Đánh Giá Chức Năng Gen CR7 Đối Với Sự Phát Triển Rễ Lúa Tại Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu đánh giá chức năng của gen cr7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ c2h2zf đối với sự phát, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Đinh Văn Lâm
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Thị Giang
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đánh Giá Chức Năng Của Gen CR7 Ảnh Hưởng Đến Sự Phát Triển Rễ Lúa
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh mục chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Trích yếu luận văn
• Thesis abstract
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa
• 2.1.1. Hình thái giải phẫu
• 2.1.2. Chức năng bộ rễ lúa
• 2.2. Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học
• 2.2.1. Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa
• 2.2.2. Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn
• 2.2.3. Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn
• 2.3. Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa
• 3. CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.1.1. Vật liệu thực vật
• 3.1.2. Mồi và các vật tư khác
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Nghiên cứu hoạt động của promoter cr7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa
• 3.2.2. Nghiên cứu vai trò của gen cr7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa
• 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Chọn lọc dòng lúa t0 siêu biểu hiện gen cr7 bằng kỹ thuật qpcr
• 3.4.2. Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ t1, t2
• 3.4.3. Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen cr7
• 3.4.4. Đánh giá sự hoạt động của promoter cr7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị gus
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu hoạt động promoter cr7 thông qua sự biểu hiện của gen chỉ thị gus
• 4.1.1. Kết quả chọn lọc dòng lúa t1 mang một copy cấu trúc gen procr7::gus
• 4.1.2. Kết quả chọn lọc dòng t2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen procr7::gus
• 4.1.3. Kết quả đánh giá sự hoạt động promoter cr7
• 4.2. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen cr7 đối với sự hình thành rễ lúa
• 4.2.1. Kết quả nghiên cứu các dòng chuyển gen trên nền di truyền giống tc65
• 4.2.2. Kết quả nghiên cứu các dòng chuyển gen trên nền di truyền thể đột biến crl1
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Chức Năng Gen CR7 ở Lúa 55 ký tự

Nghiên cứu chức năng gen lúa là yếu tố then chốt để cải thiện năng suất và khả năng thích ứng của cây lúa, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu. Gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển rễ lúa. Đề tài này tập trung vào việc đánh giá vai trò của gen CR7 đối với sự hình thành và phát triển của bộ rễ, từ đó mở ra hướng tiếp cận mới trong công tác chọn tạo giống lúa chống chịu tốt với các điều kiện stress. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải mã cơ chế sinh học phân tử lúa liên quan đến sự phát triển rễ, cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng di truyền học lúa vào thực tiễn sản xuất.

1.1. Tại Sao Nghiên Cứu Gen CR7 Lại Quan Trọng

Nghiên cứu gen CR7 quan trọng vì rễ là bộ phận quan trọng của cây lúa, giúp cây hấp thụ nước và dinh dưỡng. Cấu trúc bộ rễ ảnh hưởng đến khả năng chống chịu hạn, mặn và hiệu quả sử dụng dinh dưỡng. Theo nghiên cứu của Đinh Văn Lâm, bộ rễ lúa bao gồm rễ phôi, rễ phụ phôi, rễ phụ hậu phôi, rễ bên lớn và rễ bên nhỏ. Rễ phụ chiếm đa số và giữ vai trò quan trọng đối với sinh trưởng và năng suất lúa. Hiểu rõ vai trò của CR7 gene function sẽ giúp cải thiện bộ rễ và tăng năng suất lúa.

1.2. Mục Tiêu Chính Của Nghiên Cứu CR7 Gene Function

Mục tiêu của nghiên cứu là chọn lọc các dòng lúa chuyển gen và làm sáng tỏ vai trò của gen CR7 đối với sự hình thành và phát triển của bộ rễ. Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa chuyển gen trong phòng thí nghiệm và nhà lưới, cũng như nghiên cứu giải phẫu bộ rễ ở mức độ tế bào. Ở mức độ phân tử, nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện gen bằng kỹ thuật qPCR, sàng lọc các cây chuyển gen. Thành công của nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở cho công tác chọn tạo giống lúa có đặc điểm di truyền bộ rễ tiềm năng, tăng năng suất và khả năng chống chịu stress.

II. Thách Thức Vấn Đề Nghiên Cứu Phát Triển Rễ Lúa 59 ký tự

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu di truyền học lúa, việc kiểm soát quá trình phát triển rễ lúa vẫn còn nhiều thách thức. Các yếu tố môi trường như hạn hán, xâm nhập mặn, và thiếu dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của rễ, làm giảm năng suất cây trồng. Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các gen chủ chốt điều khiển sự phát triển rễ trong điều kiện stress, từ đó tìm ra giải pháp cải thiện năng suất lúa và chống chịu stress ở lúa. Phân tích dữ liệu RNA-seq lúa và ứng dụng kỹ thuật genome editing lúa là hướng đi đầy tiềm năng.

2.1. Ảnh Hưởng Của Stress Môi Trường Lên Rễ Lúa

Stress môi trường như hạn hán, mặn và ngập úng ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển bộ rễ lúa. Hạn hán làm giảm khả năng hút nước, mặn gây độc cho tế bào, và ngập úng gây thiếu oxy. Các stress này ảnh hưởng đến gene expression in rice, làm thay đổi quá trình sinh lý và giảm năng suất. Nghiên cứu cần xác định các gen liên quan đến khả năng chống chịu stress ở lúa và tìm cách tăng cường biểu hiện của chúng.

2.2. Hạn Chế Trong Nghiên Cứu Di Truyền Phát Triển Rễ Lúa

Mặc dù đã xác định được một số gen liên quan đến regulation of root development in rice, việc hiểu rõ cơ chế điều khiển và tương tác giữa các gen này vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu thường tập trung vào một gen duy nhất, bỏ qua sự tương tác phức tạp giữa các gen trong mạng lưới điều hòa. Cần có các nghiên cứu hệ thống, sử dụng các phương pháp phân tích dữ liệu RNA-seq lúa và tin sinh học để giải mã mạng lưới gen điều khiển sự phát triển rễ.

III. Cách Nghiên Cứu Hoạt Động Promoter CR7 Bằng GUS 57 ký tự

Để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của gen CR7, nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị GUS để đánh giá hoạt động của promoter CR7. Cụ thể, cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS được chuyển vào cây lúa. Sau đó, hoạt động của promoter CR7 được đánh giá dựa trên sự biểu hiện của gen GUS. Phương pháp này cho phép xác định vị trí và thời điểm biểu hiện gen CR7 trong quá trình phát triển rễ.

3.1. Kỹ Thuật Chuyển Gen Promoter CR7 GUS Vào Cây Lúa

Kỹ thuật chuyển gen được sử dụng để đưa cấu trúc gen chứa promoter CR7 gắn với gen chỉ thị GUS vào cây lúa. Các dòng lúa chuyển gen sau đó được chọn lọc dựa trên khả năng kháng thuốc và được kiểm tra bằng PCR để xác nhận sự hiện diện của gen chuyển. Quá trình chuyển gen này cho phép nghiên cứu vai trò của CR7 trong lúa bằng cách quan sát sự biểu hiện của GUS.

3.2. Đánh Giá Biểu Hiện Gen GUS Để Xác Định Vị Trí Hoạt Động CR7

Sự biểu hiện của gen GUS được đánh giá bằng phương pháp nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi. Vị trí nhuộm màu cho biết vị trí hoạt động của promoter CR7. Theo trích yếu luận văn, promoter CR7 hoạt động mạnh ở gốc thân và mô phân sinh rễ, cho thấy gen CR7 có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành rễ phụ và phát triển rễ. Dữ liệu này cung cấp thông tin quan trọng về CR7 and root architecture.

IV. Giải Pháp Ứng Dụng CRISPR Cas9 vào Nghiên Cứu CR7 55 ký tự

Ứng dụng công nghệ Crispr/Cas9 lúa mở ra một hướng đi mới trong nghiên cứu chức năng gen CR7 và phát triển rễ lúa. Kỹ thuật này cho phép chỉnh sửa gen CR7 một cách chính xác, tạo ra các dòng lúa đột biến CR7. So sánh kiểu hình của các dòng đột biến và dòng đối chứng sẽ giúp xác định vai trò chính xác của gen CR7 trong quá trình phát triển rễ, cũng như ảnh hưởng của nó đến cấu trúc gen CR7.

4.1. Tạo Dòng Lúa Đột Biến CR7 Bằng Kỹ Thuật CRISPR Cas9

Sử dụng kỹ thuật Crispr/Cas9 để tạo các dòng lúa đột biến mất chức năng gen CR7. Các dòng đột biến này sẽ được sử dụng để so sánh kiểu hình bộ rễ với dòng lúa thông thường (wild-type) để xác định chức năng của gen CR7. Các dòng CR7 mutant rice sẽ giúp hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của gen đến rễ lúa.

4.2. Phân Tích Kiểu Hình Bộ Rễ ở Dòng Đột Biến CR7

Tiến hành phân tích chi tiết kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa đột biến CR7, bao gồm số lượng rễ phụ, chiều dài rễ, khối lượng rễ và cấu trúc rễ. So sánh các chỉ số này với dòng đối chứng để xác định vai trò của gen CR7 trong sự phát triển của từng loại rễ. Nghiên cứu này sẽ cung cấp bằng chứng trực tiếp về ảnh hưởng của gen đến rễ lúa.

V. Kết Quả CR7 Tăng Số Lượng Rễ Phụ Ở Lúa 53 ký tự

Nghiên cứu của Đinh Văn Lâm cho thấy rằng sự siêu biểu hiện của gen CR7 ở cây lúa TC65 đã làm tăng số lượng rễ phụ. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về khối lượng khô bộ rễ và số nhánh. Ở giai đoạn cây con, gen CR7 được siêu biểu hiện giúp khắc phục hiện tượng đột biến và làm khôi phục sự hình thành rễ phụ. Kết quả này khẳng định vai trò của CR7 trong lúa.

5.1. Số Lượng Rễ Phụ Tăng Khi CR7 Siêu Biểu Hiện

Dòng lúa 2TCR7 TC65 12.17, một dòng đồng hợp tử, cho thấy số lượng rễ phụ tăng đáng kể so với dòng lúa TC65 thông thường. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc tăng số lượng rễ phụ không đồng nghĩa với việc tăng khối lượng khô bộ rễ. Điều này cho thấy CR7 and root architecture có tác động cụ thể đến một số khía cạnh của sự phát triển rễ.

5.2. CR7 Khôi Phục Sự Hình Thành Rễ Ở Dòng Đột Biến crl1

Ở dòng lúa đột biến crl1, việc siêu biểu hiện gen CR7 giúp khôi phục sự hình thành rễ phụ. Điều này cho thấy gen CR7 có thể đóng vai trò quan trọng trong đường truyền tín hiệu auxin, một yếu tố quan trọng trong sự phát triển rễ. Nghiên cứu này cung cấp thông tin về CR7 signaling pathway.

VI. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai về Gen CR7 ở Lúa 53 ký tự

Nghiên cứu về chức năng gen CR7 ở lúa còn nhiều tiềm năng phát triển. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế điều khiển của gen CR7 và sự tương tác của nó với các gen khác trong mạng lưới điều hòa phát triển rễ. Ứng dụng các kỹ thuật tiên tiến như genome editing lúa và sinh học phân tử lúa sẽ giúp giải mã toàn diện vai trò của gen CR7 và mở ra cơ hội cải thiện năng suất lúa và khả năng thích ứng.

6.1. Nghiên Cứu Tương Tác Gen CR7 Với Các Gen Khác

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc xác định các gen tương tác với CR7 trong mạng lưới điều hòa phát triển rễ. Sử dụng các phương pháp phân tích di truyền và sinh học phân tử để xác định các gen upstream và downstream của CR7. Hiểu rõ mạng lưới điều hòa này sẽ giúp kiểm soát quá trình root development in rice hiệu quả hơn.

6.2. Ứng Dụng CR7 Trong Chọn Tạo Giống Lúa Chịu Stress

Kết quả nghiên cứu về gen CR7 có thể được ứng dụng trong công tác chọn tạo giống lúa chịu stress. Sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với gen CR7 để chọn lọc các dòng lúa có bộ rễ phát triển tốt trong điều kiện hạn hán, mặn. Điều này sẽ góp phần cải thiện năng suất lúa và đảm bảo an ninh lương thực.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lúa gạo (Oryza sativa L.) là nguồn lương thực thiết yếu nuôi sống hơn 50% dân số toàn cầu. Hiện nay, biến đổi khí hậu đang làm gia tăng mức độ khắc nghiệt của các hiện tượng thời tiết cực đoan, trong đó tình trạng hạn hán và xâm nhập mặn đã tác động tiêu cực đến hơn 380 triệu hecta đất nông nghiệp trên thế giới, tương đương khoảng 33% tổng diện tích đất canh tác. Khi độ dẫn điện của đất vượt ngưỡng 4 dS/m, cây lúa bị ức chế sinh trưởng nghiêm trọng, làm suy giảm năng suất từ 20% đến hơn 50%. Để giải quyết thách thức an ninh lương thực, việc nghiên cứu các cơ chế phân tử kiểm soát cấu trúc hệ rễ nhằm tạo ra các giống lúa có khả năng hấp thụ nước và dinh dưỡng hiệu quả đóng vai trò vô cùng cấp thiết.

Bộ rễ lúa bao gồm rễ phôi, rễ phụ (crown roots) và rễ bên, trong đó rễ phụ phát sinh từ các nốt thân chiếm số lượng áp đảo và quyết định trực tiếp đến sinh khối cũng như năng suất cây trồng. Nghiên cứu tập trung giải mã chức năng sinh học của gen CR7 (Crown Root 7), mã hóa yếu tố phiên mã chứa ngón tay kẽm thuộc họ C2H2ZF nằm trong mạng lưới 277 gen hạ lưu được điều hòa bởi gen CRL1 dưới tác động của tín hiệu auxin.

Mục tiêu trọng tâm của đề tài là chọn lọc thành công các dòng lúa chuyển gen thế hệ T0, T1, T2 và làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của promoter CR7 cũng như tác động của sự siêu biểu hiện gen CR7 đối với sự phát sinh, phát triển rễ lúa. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm liên kết quốc tế LMI RICE-2 thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp trong giai đoạn từ tháng 1/2017 đến tháng 10/2017. Kết quả mang lại ý nghĩa học thuật sâu sắc, đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác chọn tạo giống lúa chống chịu stress phi sinh học có định hướng di truyền rõ ràng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Quá trình phát sinh và hình thành rễ phụ ở cây lúa được điều khiển chặt chẽ bởi con đường truyền tín hiệu nội tiết tố thực vật auxin. Dưới tác động của auxin, các protein ức chế thuộc họ AUX/IAA (với khoảng 31 gen tương đồng đã được xác định ở lúa) bị phân giải thông qua phức hệ ubiquitin-proteasome, giải phóng các yếu tố đáp ứng auxin ARF (Auxin Response Factors). Yếu tố phiên mã ARF1 liên kết đặc hiệu với trình tự cảm ứng AuxRE trên vùng điều hòa của gen CRL1 (Crown Rootless 1), từ đó kích hoạt mạng lưới biểu hiện của 277 gen xuôi dòng tham gia vào sự phân chia mô phân sinh và định hình mầm rễ.

Đột biến mất đoạn 20 cặp base trên gen tương đồng ARL1 hoặc đột biến điểm trên crl1 khiến cây lúa hoàn toàn mất khả năng hình thành rễ phụ từ các nốt thân. Gen CR7 là một trong 13 gen đích biểu hiện mạnh nhất thuộc mạng lưới CRL1, mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF (Cys2/His2 Zinc Finger Protein). Họ protein C2H2ZF giữ vai trò điều hòa phiên mã đa chức năng, tham gia kiểm soát chu kỳ tế bào, phân hóa mô và trung gian phản ứng thích nghi trước các stress môi trường. Cấu trúc giải phẫu rễ lúa gồm 5 loại rễ với các vùng mô chuyên hóa như đai Casparian ở nội bì, mô khí trung bì và hệ thống mạch gỗ xylem, đảm nhận việc vận chuyển nước và ion khoáng một cách chọn lọc.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu gồm giống lúa Taichung 65 (TC65) và thể đột biến mất rễ phụ crl1 được biến nạp hai cấu trúc gen: cấu trúc siêu biểu hiện pUBi::cdsCR7 và cấu trúc dung hợp promoter chỉ thị proCR7::GUS. Cỡ mẫu phân tích ở thế hệ T1 gồm 15 đến 20 hạt trên mỗi dòng và thế hệ T2 từ 20 đến 30 hạt trên mỗi dòng, được chọn lọc ngẫu nhiên từ các sự kiện chuyển gen độc lập nhằm đảm bảo tính đại diện thống kê.

Phương pháp sinh học phân tử bao gồm: tách chiết RNA tổng số từ 500 mg mô lá non 2 tuần tuổi theo quy trình Trizol LS, tổng hợp cDNA từ 4 µg RNA với enzym Maxima Reverse Transcriptase và phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime quantitative PCR (qPCR) sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green. Gen actin với sản phẩm khuếch đại 212 bp được sử dụng làm nội chuẩn tham chiếu để chuẩn hóa dữ liệu biểu hiện gen đích CR7 (kích thước khuếch đại 152 bp). Phân tích di truyền quần thể thế hệ T1 và T2 dựa trên phản ứng PCR kiểm tra gen chỉ thị chọn lọc kháng sinh HPT (678 bp) kết hợp thử nghiệm sức sống trên môi trường thạch bổ sung 50 mg/l hygromycin.

Độ lệch phân ly được kiểm định bằng phương pháp Khi bình phương (Chi-square test) với ngưỡng tin cậy p < 0,05 (giá trị χ2 lý thuyết là 3,84). Hoạt tính mô học của promoter CR7 được xác định qua phản ứng nhuộm GUS với cơ chất X-Gluc ở 37°C trong 24 giờ và cắt lát vi phẫu mô học dày 8 µm bằng máy cắt vibratome Microm HM 650V. Đánh giá kiểu hình rễ cây 4 tuần tuổi được thực hiện trên hệ thống ống bầu cát PVC (đường kính 16 cm, chiều cao 40 cm) bổ sung phân bón NPK tỷ lệ 20 kg/m3 cát, bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB) với 10 lần lặp lại.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân tích phân ly di truyền trên 7 dòng chuyển gen thế hệ T1 mang cấu trúc proCR7::GUS đã chọn lọc được 6 dòng mang một bản sao chèn đoạn đơn độc lập (chiếm tỷ lệ 85,7%), điển hình là dòng 1TR7 GUS 10.1 với tỷ lệ cây dương tính đạt 67,74% và giá trị χ2 = 0,87 < 3,84, hoàn toàn tuân theo quy luật phân ly Mendel 3:1. Từ các dòng T1 này, nghiên cứu đã sàng lọc thành công 3 dòng thuần đồng hợp tử ở thế hệ T2 gồm 2TR7 GUS 10.42, 2TR7 GUS 11.46 và 2TR7 GUS 34.17 với tỷ lệ sống sót đạt 100% khi xử lý kháng sinh chọn lọc.

Đánh giá hoạt tính promoter CR7 qua gen chỉ thị GUS chỉ ra rằng promoter hoạt động mạnh nhất ở giai đoạn sớm từ 3 đến 5 ngày sau nảy mầm và suy giảm dần sau 7 đến 14 ngày tuổi. Hoạt động biểu hiện tập trung đặc hiệu tại vùng mô phân sinh đỉnh ngọn rễ của rễ chính, rễ phụ và vùng gốc thân (nốt bao lá mầm, bó mạch dẫn và vùng khởi sinh mầm rễ phụ), trong khi hoàn toàn không xuất hiện ở vùng phát sinh rễ bên.

Phân tích định lượng qPCR trên 12 dòng chuyển gen thế hệ T0 ghi nhận 10 dòng (chiếm 83,3%) có mức độ siêu biểu hiện gen CR7 cao vượt trội so với đối chứng không chuyển gen TC65 với mức ý nghĩa p < 0,05. Đáng chú ý, dòng TCR7 TC65 22.1 có mức biểu hiện CR7 gấp hơn 15 lần so với gen nội chuẩn actin (p < 0,01), các dòng TCR7 TC65 11.1 và 12.1 biểu hiện cao hơn trên 5 lần. Ở thế hệ T2 trồng trong bầu cát 4 tuần tuổi, dòng đồng hợp tử 2TCR7 TC65 12.17 cho số lượng rễ phụ tăng rõ rệt so với đối chứng. Đặc biệt, việc siêu biểu hiện gen CR7 trong thể đột biến crl1 sau 3 tuần nuôi cấy in vitro đã khôi phục hoàn toàn khả năng hình thành rễ phụ vốn bị khiếm khuyết.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thực nghiệm chứng minh vai trò hạ lưu then chốt của yếu tố phiên mã CR7 trong chu trình truyền tín hiệu auxin do CRL1 điều khiển. Dữ liệu định lượng từ qPCR khi được trực quan hóa qua biểu đồ cột thể hiện sự chênh lệch rõ ràng về mức độ sao chép mRNA giữa dòng đối chứng và các dòng mang cấu trúc siêu biểu hiện. Bảng thống kê phân ly di truyền Chi-square đóng vai trò chuẩn mực trong việc loại bỏ các dòng mang đa bản sao (như dòng 1TR7 GUS 21.2 với 100% cây dương tính T1 và χ2 vượt ngưỡng), bảo đảm tính ổn định di truyền của tính trạng chuyển gen.

Việc promoter CR7 biểu hiện tập trung tại các mô phân sinh phân chia tích cực ở ngọn rễ và gốc thân trong 5 ngày đầu sau nảy mầm khẳng định gen này tham gia trực tiếp vào việc tái phân chia tế bào để hình thành mầm rễ phụ phôi và rễ phụ hậu phôi. Kết quả khôi phục kiểu hình tạo rễ ở thể đột biến crl1 cho thấy CR7 là gen thực thi chức năng sinh học cốt lõi, có khả năng kích hoạt quá trình biệt hóa mô rễ ngay cả khi thiếu vắng sự biểu hiện trực tiếp của gen điều hòa thượng nguồn CRL1.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, Viện Di truyền Nông nghiệp và các đơn vị nghiên cứu công nghệ sinh học cần ứng dụng cấu trúc siêu biểu hiện pUBi::cdsCR7 cùng hệ thống chỉ thị phân tử đặc hiệu (như cặp mồi CR7-RT-F/R và HPT-PC-F/R) vào các chương trình chọn giống lúa chống chịu hạn và mặn. Mục tiêu hành động là tạo ra các dòng lúa chuyển gen hoặc dòng chuyển đoạn có số lượng rễ phụ tăng từ 15% đến 20%, triển khai thực hiện trong khung thời gian 24 đến 36 tháng.

Thứ hai, các viện nghiên cứu lúa và trường đại học nông nghiệp cần mở rộng khảo nghiệm đồng ruộng đối với hai dòng đồng hợp tử tiềm năng 2TCR7 TC65 12.17 và 1TCR7 CRL1 11. Đánh giá toàn diện các chỉ số nông sinh học bao gồm mật độ rễ ăn sâu, chỉ số diện tích rễ, hiệu suất sử dụng nước và năng suất thực thu qua ít nhất 3 vụ liên tiếp trên các vùng đất cát ven biển hoặc đất nhiễm mặn (độ mặn EC từ 4 đến 6 dS/m).

Thứ ba, nhóm nghiên cứu cần ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm biến đổi vùng promoter tự nhiên của gen CR7 trên các giống lúa thuần chất lượng cao của Việt Nam (như giống Bắc Thơm 7 hoặc Đài Thơm 8), hướng tới mục tiêu tăng cường biểu hiện nội sinh mà không cần đưa gen chuyển ngoại lai, hoàn thành thử nghiệm trong giai đoạn 3 năm tới.

Thứ tư, các phòng thí nghiệm tế bào thực vật cần chuẩn hóa quy trình sàng lọc dòng thuần thế hệ T2 kết hợp thử nghiệm kháng sinh hygromycin 50 mg/l và chỉ thị phân tử PCR. Giải pháp này giúp rút ngắn 50% thời gian đánh giá kiểu hình, tiết kiệm khoảng 30% chi phí hóa chất so với các phương pháp chọn lọc truyền thống.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học và Di truyền học thực vật: Tài liệu cung cấp quy trình chi tiết từ thiết kế mồi PCR, tách chiết RNA bằng Trizol LS, phân tích qPCR đến kỹ thuật nhuộm mô học GUS và cắt lát vibratome với độ chính xác cao.

Các nhà khoa học và chuyên gia chọn tạo giống cây trồng: Cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền phân tử về mạng lọc gen kiểm soát cấu trúc hệ rễ, mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng các gen mã hóa yếu tố phiên mã C2H2ZF để nâng cao khả năng chống chịu stress phi sinh học cho cây ngũ cốc.

Giảng viên và cán bộ giảng dạy tại các trường đại học khối Nông Lâm Sinh: Nguồn học liệu tham khảo chuẩn xác phục vụ giảng dạy các học phần Sinh học phân tử thực vật, Kỹ thuật chuyển gen và Cơ chế phản ứng thích nghi của thực vật trước biến đổi khí hậu.

Kỹ sư nông nghiệp và cán bộ kỹ thuật tại các Trung tâm Khuyến nông công nghệ cao: Tham khảo để hiểu rõ bản chất sinh lý của hệ rễ lúa, từ đó xây dựng các biện pháp kỹ thuật canh tác tối ưu hóa chế độ tưới tiêu và phân bón dựa trên đặc điểm phát triển rễ ở từng giai đoạn sinh trưởng.

Câu hỏi thường gặp

Gen CR7 có vai trò chính xác là gì trong quá trình phát triển bộ rễ cây lúa? Gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF, hoạt động ở giai đoạn sớm (3 đến 5 ngày sau nảy mầm). Gen tập trung biểu hiện ở mô phân sinh gốc thân và đỉnh rễ, trực tiếp kích thích sự phân hóa tế bào để phát sinh rễ phụ và thúc đẩy rễ sinh trưởng kéo dài.

Tại sao nghiên cứu lại chọn lọc các dòng mang 1 copy gen chuyển ở thế hệ T1? Các dòng chuyển gen mang 1 bản sao duy nhất có tính di truyền ổn định theo tỷ lệ phân ly Mendel 3:1 (giá trị χ2 < 3,84). Điều này giúp tránh hiện tượng bất hoạt gen (gene silencing) và tạo tiền đề vững chắc để chọn lọc dòng thuần đồng hợp tử 100% ở thế hệ T2.

Sự siêu biểu hiện của gen CR7 tác động như thế nào đến kiểu hình thể đột biến crl1? Thể đột biến crl1 nguyên bản hoàn toàn không thể phát sinh rễ phụ sau 1 tuần tuổi. Khi được chuyển cấu trúc siêu biểu hiện pUBi::cdsCR7, cây lúa crl1 đã được khôi phục khả năng hình thành rễ phụ sau 3 tuần nuôi cấy in vitro, chứng minh CR7 hoạt động độc lập ở hạ lưu đường truyền tín hiệu.

Phương pháp nào được sử dụng để xác định hoạt động không gian của promoter CR7? Nghiên cứu sử dụng hệ thống gen chỉ thị proCR7::GUS. Sau khi nhuộm mô bằng dung dịch X-Gluc ở 37°C trong 24 giờ và cắt lát vi phẫu 8 µm trên máy vibratome, vị trí hoạt động của promoter được nhận diện chính xác qua tín hiệu màu xanh lam dưới kính hiển vi.

Kết quả đánh giá trên ống bầu cát 4 tuần tuổi mang lại ý nghĩa gì cho thực tiễn sản xuất? Thử nghiệm trên bầu cát mô phỏng điều kiện đất tơi xốp cho thấy dòng chuyển gen 2TCR7 TC65 12.17 phát triển số lượng rễ phụ vượt trội so với đối chứng. Đây là đặc tính nông học then chốt giúp cây lúa tăng diện tích tiếp xúc đất, hấp thu nước và dinh dưỡng tốt hơn trong điều kiện khô hạn.

Kết luận

• Đã phân tích phân ly di truyền và chọn lọc thành công 6 dòng lúa T1 mang 1 copy cấu trúc proCR7::GUS cùng 3 dòng thuần đồng hợp tử thế hệ T2 đạt tỷ lệ sống 100% trên môi trường hygromycin.
• Xác định chính xác promoter CR7 hoạt động sớm từ 3 đến 5 ngày tuổi tại vị trí mô phân sinh đỉnh rễ và mô mạch dẫn gốc thân, liên quan mật thiết đến sự phát sinh rễ phụ.
• Đã sàng lọc được các dòng siêu biểu hiện gen CR7 ở thế hệ T0 với mức tăng trưởng biểu hiện gấp hơn 15 lần so với gen nội chuẩn actin theo phân tích qPCR.
• Khẳng định gen CR7 có khả năng phục hồi hoàn toàn kiểu hình phát sinh rễ phụ ở thể đột biến crl1, đóng vai trò then chốt trong mạng lưới điều hòa của CRL1.
• Đề xuất mở rộng thử nghiệm ngoài đồng ruộng trong 2 đến 3 vụ tới đối với dòng 2TCR7 TC65 12.17 nhằm đẩy mạnh công tác tạo giống lúa thích ứng với biến đổi khí hậu toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐINH VĂN LÂM NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHỨC NĂNG CỦA GEN CR7 MÃ HÓA YẾU TỐ PHIÊN MÃ THUỘC HỌ C2H2ZF ĐỐI VỚI SỰ PHÁT TRIỂN RỄ LÚA Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 0201 Người hướng dẫn khoa học: 1. Hoàng Thị Giang 2. Nguyễn Văn Giang NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 download by : [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Hoàng Thị Giang và TS.

Các số liệu, kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa công bố dưới bất cứ hình thức nào trước đây. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nếu phát hiện bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng kỷ luật Nhà nước. Hà Nội, ngày 29 tháng 9 năm 2017 Tác giả luận văn Đinh Văn Lâm i download by : [e-mail] LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân còn có sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu của các thầy cô, anh (chị, em) đồng nghiệp.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Hoàng Thị Giang, người đã trực tiếp, tận tình chỉ dạy tôi về mặt học thuật cũng như phương pháp tiếp cận nghiên cứu trong suốt quá trình thực tập và hoàn thiện luận văn thạc sĩ. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Nguyễn Văn Giang đã có nhiều đóng góp khoa học cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thơm cùng các anh, chị (em) đồng nghiệp phòng LMI RICE-2, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 29 tháng 9 năm 2017 Tác giả luận văn Đinh Văn Lâm ii download by : [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt .v Danh mục bảng. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn.

viii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài.Tổng quan tài liệu. Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa.

Hình thái giải phẫu. Chức năng bộ rễ lúa. Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học. Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa.

Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn. Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn. Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu thực vật. Mồi và các vật tư khác. Nội dung nghiên cứu.

Nghiên cứu hoạt động của promoter cr7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa. Nghiên cứu vai trò của gen cr7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Chọn lọc dòng lúa t0 siêu biểu hiện gen cr7 bằng kỹ thuật qpcr. Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ t1, t2 .20 iii download by : skknchat@gmail. Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen cr7. Đánh giá sự hoạt động của promoter cr7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị gus.

Kết quả và thảo luận. Kết quả nghiên cứu hoạt động promoter cr7 thông qua sự biểu hiện của gen chỉ thị gus. Kết quả chọn lọc dòng lúa t1 mang một copy cấu trúc gen procr7::gus. Kết quả chọn lọc dòng t2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen procr7::gus.

Kết quả đánh giá sự hoạt động promoter cr7. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen cr7 đối với sự hình thành rễ lúa. Kết quả nghiên cứu các dòng chuyển gen trên nền di truyền giống tc65. Kết quả nghiên cứu các dòng chuyển gen trên nền di truyền thể đột biến crl1.

Kết luận và kiến nghị .45 Tài liệu tham khảo .lua iv download by : [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Anh ABA Abscisic Acid ARF Auxin Responsive Factor ARL1 Adventitious Rootless 1 AUX/IAA Auxin/Indole-3-Acetic Acid cDNA Complementary DNA C2H2ZF Cys2 His2 Zinc Finger Protein CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide EC Electric Conductivity EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HKT High-Affinity K+ Transporter LOB LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN MS Murashige and Skoog Medium PCR Polymerase Chain Reaction qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative Trait Locus TC65 TaiChung 65 TE Tris-EDTA buffer RT-PCR Realtime Polymerase Chain Reaction luan.lua v download by : [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen. Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS. Thành phần phản ứng PCR.

Chu trình nhiệt phản ứng PCR. Đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền thế hệ T1 của các dòng chuyển gen proCR7::GUS. Kết quả chọn lọc dòng đồng hợp tử mang cấu trúc gen proCR7::GUS. Kết quả chọn lọc dòng TC65 mang một copy cấu trúc gen chuyển.

Kết quả chọn lọc dòng đồng hợp tử locus gen pUbi::CR7 ở cây TC65 chuyển gen thế hệ T2 .lua vi download by : [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cấu trúc và hình thái rễ lúa. Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân. Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa.

Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ. Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn. Gen liên quan tới khả năng chống chịu mặn ở lúa. Đường truyền tín hiệu auxin cho sự phát sinh rễ phụ ở cây lúa.

Mạng lưới gen điều hòa bởi Crl1. Hình ảnh giống lúa đối chứng. Kết quả điện di kiểm tra các cây chuyển gen T1. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 10.

Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 11. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 34. Biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ của dòng 2TR7 GUS 10. Biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ của dòng 2TR7 GUS 34.

Lát cắt ngang phần gốc thân của dòng 2TR7 GUS 10. Lát cắt ngang phần gốc thân cây lúa của dòng 2TR7 GUS 11. Lát cắt ngang phần gốc thân cây lúa của dòng 2TR7 GUS 34. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây lúa TC65 chuyển gen thế hệ T0.

Kết quả điện di kiểm tra cây TC65 chuyển gen ở thế hệ T1. Sàng lọc dòng TC65 mang đồng hợp tử cấu trúc gen chuyển bằng hygromycin. Số lượng rễ phụ của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi. Khối lượng khô bộ rễ của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi.

Số nhánh của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây crl1 chuyển gen thế hệ T0. Kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa crl1 chuyển gen sau 3 tuần tuổi. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây crl1 chuyển gen thế hệ T1.

Số lượng rễ phụ ở các dòng lúa crl1 chuyển gen thế hệ T1 .lua vii download by : [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đinh Văn Lâm Tên luận văn: “Nghiên cứu đánh giá chức năng của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF liên quan tới sự phát triển rễ lúa”. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 0201 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen và làm sáng tỏ vai trò của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã họ C2H2ZF đối với sự hình thành và sự phát triển của bộ rễ ở các dòng lúa chuyển gen. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào các giống Taichung 65 và dạng đột biến crl1 ở các thế hệ T0, T1, T2 dưới sự kiểm soát của promoter Ubiquitin, ký hiệu là pUBi::cdsCR7. Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS, ký hiệu là proCR7::GUS được chuyển vào cây TC65.

Phương pháp nghiên cứu Đánh giá mức độ biểu hiện gen ở các dòng lúa chuyển gen bằng kỹ thuật qPCR. Phương pháp tế bào học đánh giá hoạt động của promoter gen CR7 dựa vào gen chỉ thị GUS Chọn lọc các dòng lúa chuyển gen bằng PCR, đánh giá biểu hiện GUS và khả năng kháng Hygromycine trên môi trường nuôi cấy. Đánh giá kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa chuyển gen bằng các ống cát. Kết quả chính và kết luận Dựa vào mức độ phân ly di truyền ở thế hệ T1 đã chọn lọc được 6 dòng mang một copy cấu trúc gen chuyển proCR7::GUS là 1TR7 GUS 10.

Ở thế hệ T2 đã sàng lọc thành công 3 dòng đồng hợp tử độc lập gồm: 2TR7 GUS 10. Trong 3 dòng đồng hợp tử thu được, hoạt động của promoter CR7 chủ yếu được đánh giá dựa trên sự biểu hiện tương đồng của hai dòng 2TR7 GUS 10. Promoter CR7 hoạt động ở giai đoạn sớm từ giai đoạn nảy mầm đến khi cây ra luan.lua viii download by : [e-mail] lá thật đầu tiên và hoạt động chủ yếu tại vị trí gốc thân và mô phân sinh rễ. Trong gốc thân promoter CR7 hoạt động chính ở phần bó mạch trong thân cây, tại vùng hình thành các rễ phụ phôi ở nốt bao lá mầm và tại vùng mô phân sinh cho sự phát sinh mầm rễ phụ ở các nốt gốc thân.

Ở bộ rễ hoạt động của promoter CR7 tập trung vào vùng mô phân sinh đầu ngọn rễ. Nhận định rằng gen CR7 có vai trò nhất định đối với quá trình hình thành rễ phụ phôi và rễ phụ cũng như tham gia vào sự phát triển rễ ở cây lúa. Phân tích bằng phương pháp qPCR khẳng định gen CR7 biến nạp thành công và biểu hiện mạnh trên nền di truyền của cây TC65 và crl1. Đã chọn lọc được 3 dòng TC65 mang 1 copy cấu trúc gen pUbi::cdsCR7 là 1TCR7 TC65 3.

Ở thế hệ T2 đã chọn lọc được 2 dòng TC65 đồng hợp tử độc lập là 2TCR7 TC65 11. Đánh giá bước đầu cho thấy rằng ở giai đoạn cây 4 tuần tuổi trồng trên bầu cát, sự siêu biểu hiện của gen CR7 ở cây TC65 đã làm tăng số lượng rễ phụ ở dòng đồng hợp tử 2TCR7 TC65 12.