Khóa luận: Chiết xuất Amylase từ đậu xanh bằng phương pháp tách hai pha lỏng

Tài liệu trình bày nghiên cứu chiết xuất và tinh sạch enzym Amylase từ hạt đậu xanh nảy mầm, ứng dụng phương pháp tách hai pha lỏng.

• Tác giả: Lê Thu Hà
• Người hướng dẫn: ThS. Mai Văn Hiên
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất Amylase từ hạt đậu xanh nảy mầm bằng phương pháp tách hai pha lỏng
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và tầm quan trọng của Amylase

Amylase là một enzym thủy phân quan trọng thuộc nhóm Glycoside hydrolase (GH), có khả năng phân hủy các liên kết glycosid trong tinh bột và các polysaccharide phức tạp. Amylase được tìm thấy phổ biến trong các hạt đậu xanh nảy mầm và đóng vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa sinh hóa của thực vật. Nghiên cứu chiết xuất amylase từ hạt đậu xanh là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học, vì amylase có ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và các lĩnh vực khác. Việc tìm hiểu cơ chất của amylase và đặc điểm hoạt động của nó giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng.

1.1. Định nghĩa và phân loại Amylase

Amylase được phân loại thành hai loại chính: α-amylase và β-amylase, tùy theo vị trí cắt trên chuỗi glucose. α-amylase tác dụng ngẫu nhiên trên các liên kết α-1,4-glycosidic, trong khi β-amylase tác dụng từ đầu chuỗi. Cơ chất của amylase chủ yếu là tinh bột và các polysaccharide phức tạp. Các enzyme này được mã hóa bởi mã EC 3.2.1.1 (α-amylase) và 3.2.1.2 (β-amylase).

1.2. Ý nghĩa nghiên cứu chiết xuất Amylase

Nghiên cứu chiết xuất amylase từ hạt đậu xanh (Vigna radiata) nảy mầm mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Việc tách chiết và tinh sạch amylase từ nguồn tự nhiên giúp thu được enzyme với độ tinh khiết cao, chi phí thấp. Amylase có ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất sirô, trong dược phẩm làm hỗ trợ tiêu hóa.

II. Đặc điểm sinh hóa của hạt đậu xanh nảy mầm

Hạt đậu xanh (Vigna radiata) là một loại cây họ đậu giàu dinh dưỡng, chứa nhiều protein, carbohydrate và enzym. Trong quá trình nảy mầm, hạt đậu xanh trải qua những biến đổi sinh hóa quan trọng, kích hoạt sự sản xuất các enzym tiêu hóa như amylase, protease, lipase. Hoạt tính enzym tăng đáng kể trong 3-7 ngày đầu nảy mầm, đặc biệt là hoạt động của amylase để phân hủy tinh bột thành các đường đơn giản cho sự phát triển của cây non. Sự gia tăng này là cơ sở lý tưởng cho việc chiết xuất amylase với hiệu suất cao.

2.1. Quá trình nảy mầm và kích hoạt enzym

Trong quá trình nảy mầm của hạt đậu xanh, độ ẩm tăng kích hoạt sự thức tỉnh của tế bào, giải phóng các enzym từ các túi chứa. Hoạt tính amylase tăng gấp 2-3 lần so với hạt khô. Các hormone thực vật như gibberellin kích thích sự sản xuất mRNA của gene amylase. Sự gia tăng hoạt tính này là nền tảng lý tưởng cho tách chiết enzyme hiệu quả.

2.2. Vai trò của hoạt động enzym trong quá trình phát triển

Amylase và các enzym phân hủy khác đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa dự trữ thành năng lượng và các vật liệu xây dựng cho cây non. Sự phân hủy tinh bột cung cấp glucose cho quá trình hô hấp tế bào và sinh tổng hợp. Hiểu rõ về biến đổi sinh hóa này giúp tối ưu hóa điều kiện nảy mầm để thu được amylase với hiệu suất cao nhất.

III. Phương pháp tách hai pha lỏng ATPS trong tinh sạch Amylase

Phương pháp tách hai pha lỏng (Aqueous Two-Phase System - ATPS) là một kỹ thuật tinh sạch enzyme hiện đại, được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học. Nguyên lý của ATPS dựa trên việc tạo ra hai pha lỏng không hòa lẫn nhau từ các polymer (PEG - Polyethylene glycol) và muối (natri polyacrylate - NaPA) hoặc các chất hóa học khác. Amylase được phân bố giữa hai pha này dựa trên cấu trúc protein, điện tích và tính chất thủy tán. Phương pháp ATPS có ưu điểm vượt trội: hiệu suất cao, chi phí thấp, bảo tồn hoạt tính enzyme, thân thiện với môi trường, và có khả năng mở rộng quy mô sản xuất công nghiệp.

3.1. Nguyên lý và thành phần hệ hai pha lỏng

ATPS được hình thành từ hai polymer hòa tan trong nước hoặc một polymer và một muối, tạo ra hai pha không hòa tan lẫn nhau. Hệ PEG-NaPA là hệ phổ biến nhất. Amylase được phân bố giữa hai pha dựa trên tính chất physicochemical. Việc điều chỉnh nồng độ PEG, pH, nhiệt độ giúp tối ưu hóa sự phân bố và nâng cao độ tinh khiết.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tinh sạch

Độ pH, nồng độ polymer, tỷ lệ thể tích hai pha, thời gian chiết tách là những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất tinh sạch và hoạt tính enzym. Nhiệt độ cũng là biến số quan trọng vì amylase nhạy cảm với nhiệt độ cao. Việc khảo sát thực nghiệm các yếu tố này giúp tìm ra điều kiện tối ưu để chiết xuất amylase với độ tinh khiết cao nhất và hoạt tính enzym được bảo tồn.

IV. Ứng dụng và triển vọng của nghiên cứu chiết xuất Amylase

Chiết xuất và tinh sạch amylase từ hạt đậu xanh nảy mầm có nhiều ứng dụng thực tiễn trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong ngành công nghiệp thực phẩm, amylase được sử dụng để chuyển hóa tinh bột thành đường glucose trong sản xuất sirô, nước tương, bia. Trong dược phẩm, amylase được ứng dụng làm enzyme hỗ trợ tiêu hóa trong các sản phẩm chức năng. Amylase cũng được sử dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy để xử lý tinh bột. Triển vọng phát triển của lĩnh vực này rất lớn, đặc biệt là sử dụng công nghệ di truyền để cải tiến công suất enzyme, và tối ưu hóa quy trình tách chiết để nâng cao hiệu quả sản xuất và giảm chi phí.

4.1. Ứng dụng thực tiễn trong công nghiệp

Amylase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm: sản xuất gạo lên men, bánh mì, nước trái cây. Trong công nghiệp dệt, amylase loại bỏ bột dán từ sợi. Trong dược phẩm, amylase là thành phần hoạt chất của nhiều thuốc hỗ trợ tiêu hóa. Phương pháp ATPS giúp sản xuất amylase với độ tinh khiết cao, giá thành rẻ, phù hợp cho sản xuất công nghiệp quy mô lớn.

4.2. Triển vọng phát triển và những hướng nghiên cứu tiếp theo

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: áp dụng công nghệ fermentation để tăng hoạt tính amylase, sử dụng enzyme immobilization để tái sử dụng enzyme, và cải tiến ATPS bằng các hóa chất mới, thân thiện môi trường. Kết hợp biểu hiện gen để tạo amylase biến đổi với tính chất ổn định hơn, hoạt tính cao hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những thập kỷ gần đây, enzym với vai trò là một chất xúc tác sinh học, đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, giúp thay thế các quy trình hóa học phức tạp, đem lại hiệu quả kinh tế cao cũng như cải thiện các vấn đề môi trường. Amylase là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều nhất, chiếm khoảng 30% thị trường enzym và có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như sản xuất chất tẩy rửa, giấy và bột giấy, thực phẩm, dược phẩm, các quy trình xử lý sinh học,… [1], [2], [3], [4], [5]. Nhiều quy trình chiết xuất và tinh chế khác nhau đã được thử nghiệm và ứng dụng trong sản xuất nhằm tối ưu hóa hoạt tính của amylase, tuy nhiên những phương pháp này có hạn chế là chi phí thiết bị cao, quá trình tinh chế phức tạp, sử dụng hóa chất độc hại [5], [6], [7]. Một phương pháp tinh sạch enzym khác đang nhận được sự quan tâm gần đây là phương pháp tách hai pha lỏng.

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như khả năng tách chiết nhiều loại phân tử sinh học, hiệu suất cao, chi phí thấp, quy trình đơn giản, dễ nâng cấp quy mô sản xuất, thân thiện với môi trường,. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nguyên liệu sản xuất amylase là hạt đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) nảy mầm. So với vi sinh vật, hạt đậu xanh nảy mầm có nhiều ưu điểm như quy trình chuẩn bị nguyên liệu đơn giản, chi phí tiết kiệm, không yêu cầu các điều kiện nuôi cấy khắt khe như thiết bị nuôi cấy đặc biệt, môi trường vô trùng, kiểm soát pH, bổ sung thêm chất cảm ứng,… điều này giúp rút ngắn đáng kể quá trình thu nhận enzym và giảm bớt các bước xử lý sinh học phức tạp [5], [9]. Thông qua việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, độ tinh sạch và hoạt tính enzym, nghiên cứu này giúp xác định được các thông số tối ưu của quy trình chiết amylase bằng phương pháp tách hai pha lỏng, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất sau này.

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất amylase từ hạt đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) nảy mầm bằng phương pháp tách hai pha lỏng” được thực hiện với 3 mục tiêu chính: 1. Đánh giá hiệu quả tinh sạch của phương pháp tách hai pha lỏng trong quy trình tách chiết amylase từ hạt đậu xanh nảy mầm. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình tinh sạch amylase từ hạt đậu xanh nảy mầm bằng phương pháp tách hai pha lỏng. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym amylase từ hạt đậu xanh nảy mầm.

Định nghĩa Amylase được định nghĩa là các enzym có khả năng thủy phân các liên kết glycosid ở tinh bột. Theo Ủy ban Danh pháp của Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB) các amylase có thể được phân loại vào 3 lớp là transferase (EC 2), hydrolase (EC 3) và isomerase (EC 5). Trong đó đa số các amylase thuộc nhóm enzym thủy phân hydrolase [10], [11]. Phân bố trong tự nhiên Amylase có thể tìm thấy nhiều trong lá, củ, quả và đặc biệt là hạt nảy mầm của nhiều loài thực vật khác nhau.

Mầm đại mạch (Hordeum vulgare) là nguyên liệu phổ biến nhất được sử dụng để khai thác amylase phục vụ sản xuất công nghiệp, đặc biệt trong ngành sản xuất bia và mạch nha. Ngoài ra, amylase cũng được chiết xuất từ một số nguồn thực vật khác như ngô (Zea mays), các loại đậu như đậu đen (Vigna mungo), đậu nành (Glycine max),… Ở động vật, amylase có thể được tìm thấy trong nước bọt, và dịch tụy, đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình tiêu hóa của động vật [5], [12], [13], [11]. Amylase còn có thể thu được từ các nguồn vi sinh như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Các chủng nấm thường được sử dụng có thể kể đến như Aspergillus, và Rhizopus.

Một số loài như Aspergillus niger, Aspergillus oryzae với khả năng tổng hợp mạnh mẽ các amylase như -amylase, -glucosidase, glucoamylase,… [5]. Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo ra lượng lớn amylase, một số đại diện như Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis,. được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các loại amylase có thể chịu được nhiệt độ cao và pH kiềm trong sản xuất công nghiệp. Một số loại amylase khác cũng được phân lập từ các vi khuẩn thuộc chủng Pseudomonas và Streptomyces [5], [14], [11].

Cơ chất của amylase Hầu hết các amylase hoạt động chủ yếu trong việc phân cắt các liên kết -1,4 glycosid và -1,6 glycosid của của tinh bột, glycogen [11]. Ngoài hai cơ chất chính kể trên, một số loại amylase đặc biệt còn có tác dụng lên một cơ chất đặc hiệu khác là pullulan [15]. Pullulan là một polysaccharide được tổng hợp bởi vi khuẩn Aureobasidium pullulans. Về bản chất, pullulan là một glucan gồm các đơn vị maltotriose (ba phân tử glucose liên kết với nhau qua liên kết α-1,4 glycosid), được nối với nhau bằng liên kết α-1,6 glycosid, tạo thành một chuỗi tuyến tính có các nhánh đặc trưng [11].

Endoamylase Endoamylase hay amylase nội phân tử, với đại diện là -amylase (EC 3.1), là những amylase cắt các liên kết -1,4 glycosid của cơ chất một cách ngẫu nhiên, tạo thành các chuỗi oligosaccarid cấu hình  mạch thẳng và mạch nhánh với độ dài khác nhau [16]. Exoamylase Đây là nhóm enzym tác động lên cơ chất từ đầu không khử, tạo thành các chuỗi oligosaccarid ngắn và các sản phẩm thủy phân khác như maltose, glucose. Các đại diện tiêu biểu của nhóm này có thể kể đến như -amylase, glucoamylase, -glucosidase [17].2) cắt các liên kết -1,4 glycosid từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Sản phẩm của quá trình này là các phân tử maltose có cấu hình  và -dextrin.

Glucoamylase hay -amylase ( EC 3.3) tấn công lần lượt các liên kết - 1,4 glycosid tạo ra các phân tử glucose có cấu hình . Enzym này cũng thủy phân liên kết -1,6 glycosid ở các điểm nhánh trong chuỗi amylopectin nhưng với tốc độ chậm hơn so với liên kết -1,4 glycosid [16]. Enzym khử nhánh Đây là nhóm enzym tác dụng chủ yếu lên liên kết -1,6 glycosid giúp cắt các nhánh của cơ chất. Các đại diện thuộc nhóm này có thể kể đến như oligo-1,6-glucosidase (EC 3.10), amylo-1,6-glucosidase (EC 3.41), và isoamylase (EC 3.

Pullulanase được chia thành hai loại chính [15]. Pullulanase loại I hay pullulanase chỉ thủy phân liên kết α-1,6 glycosid trong amylopectin, dextrin và pullulan. Pullulanase loại II hay neopullunalase có phạm vi tác dụng rộng hơn, có khả năng tấn công cả liên kết α-1,4 và α-1,6 glycosid trong tinh bột và dextrin. Isoamylase hoạt động khá tương tự pullulanase nhưng không thủy phân được cơ chất là pullulan [17].

Transglucosidase Nhóm enzym này khá đặc biệt vì có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân [17]. Chúng được xếp vào nhóm EC 2. Các enzym như amylomaltases (EC 2.25) và cyclodextrin glucosyltransferases (CGTases, EC 2.19) phân cắt và hình thành các liên kết -1,4 glycosid mới, thì một số enzym khác như branching enzym (EC 2.18) lại cắt liên kết -1,4 glycosid và kết nối phân tử glucose vào một chuỗi khác bằng liên kết - 1,6 glycosid [17]. Cấu trúc Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác định cấu trúc amylase từ các nguồn khác nhau.

Cấu trúc protein đầu tiên được xác định của amylase là Taka-amylase vào năm 1984 [18]. Đến nay, hơn 200 cấu trúc không gian của amylase đã được mô tả, đa phần các amylase thuộc họ GH 13. Các amylase thuộc cùng họ GH từ các nguồn khác nhau tuy có sự khác biệt về số lượng acid amin nhưng khá giống nhau về cấu trúc không gian của enzym [19]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 3 loại amylase phổ biến nhất từ các nghiên cứu khác nhau để minh họa cho cấu trúc enzym.

 - amylase Cấu trúc không gian của Taka-amylase (- amylase từ Aspergillus oryzae) được thể hiện ở Hình 1.2 là một chuỗi polypeptide đơn bao gồm 478 acid amin, với 3 vùng chính: Vùng A (aa 1–376), B (aa 128–201) và C (aa 385–478). Vùng A, chiếm phần lớn cấu trúc, có 376 acid amin, chứa vị trí xúc tác và có cấu trúc (β/α)8 (TIM barrel) đặc trưng. Cấu trúc này giống như một cái thùng, cấu tạo từ 8 chuỗi peptid có cấu trúc gấp β song song tạo thành hình trụ, bao quanh bởi 8 chuỗi xoắn α. Các enzym -amylase từ các nguồn khác nhau thuộc họ GH 13 đều có chung cấu trúc thùng đặc trưng này [9], [20].

Vùng B được cấu tạo từ ba chuỗi gấp nếp β và có thể chứa vị trí liên kết với ion canxi. Vùng C nằm sau chuỗi xoắn α thứ tám và cấu tạo từ 8 chuỗi β [11]. Hai acid amin xúc tác chính trong Taka-amylase là Asp 206 và Glu 230. Asp 206 đóng vai trò như một nucleophile (base), trong khi Glu 230 hoạt động như một chất cho proton (acid).

Ion Ca2+ nằm ở giữa vùng A và vùng B, giúp ổn định cấu trúc enzym thông qua việc hình thành cầu nối ion giữa 2 vùng, từ đó bảo vệ enzym khỏi sự biến tính do nhiệt hoặc tác động của các enzym phân giải protein. Chức năng của vùng C vẫn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên, có giả thuyết cho rằng nó liên quan đến việc liên kết cơ chất, ổn định cấu trúc hoặc tương tác với các phân tử khác [7], [11]. Cấu trúc không gian của - amylase từ Aspergillus oryzae [14]. Vùng A màu xanh lá, vùng B màu xanh dương, vùng C màu đỏ.

Phần trung tâm xúc tác được biểu thị bằng các mũi tên, vị trí các acid amin chính có vai trò xúc tác biểu thị bằng các đoạn gấp khúc màu xanh. Mô hình cấu trúc các vùng (domain) A, B, C ở Aspergillus oryzae [9]. Cấu trúc xoắn  và gấp nếp  được minh họa bởi các hình tròn và vuông được đánh số thứ tự từ 1-8. Vị trí của 2 acid amin Asp 206 và Glu 230 đóng vai trò chính trong quá trình xúc tác được biểu thị bằng vòng tròn kép.

 - amylase Cấu trúc không gian của β-amylase từ Bacillus cereus được minh họa ở Hình 1.4 bao gồm hai vùng chính: vùng A (aa 1–417) và vùng B (aa 418–516). Mặc dù enzym này thuộc họ GH 14, vùng A có cấu trúc (β/α)8 tương tự α-amylase. Vị trí xúc tác của β-amylase hình thành trong một cấu trúc thùng, với các vòng ngắn giữa các chuỗi gấp β và chuỗi xoắn α. Tuy nhiên, cấu trúc thùng của α-amylase và β-amylase có sự khác biệt rõ rệt: α-amylase có vị trí xúc tác dạng khe rộng và nông, phù hợp với việc thủy phân ngẫu nhiên các liên kết trong chuỗi polysaccharide, trong khi β-amylase có vị trí xúc tác dạng túi sâu, cho phép tiếp cận chọn lọc một phần đầu không khử của chuỗi polysaccharide và tách maltose tuần tự [7].