MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Ngày nay cùng với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học, phân tích ADN đã trở thành công cụ đắc lực không thể thiếu trong xét nghiệm mối quan hệ huyết thống, giám định pháp y, điều tra hình sự…Việc phân tích ADN giúp giải quyết từ những vụ việc mang tính dân sự như xác định cha cho con, tranh chấp quyền thừa kế…đến các vụ án hình sự giết người, hiếp dâm…ADN là bằng chứng có tính pháp lý cao và có giá trị quyết định trong các phiên toà. Hơn thế nữa, trong những vụ thiên tai, thảm hoạ với số lượng người tử vong lớn hay khi việc nhận dạng thông thường không thể thực hiện thì giám định ADN để xác định danh tính nạn nhân trở thành biện pháp khả thi nhất. Sự lựa chọn các chỉ thị phân tử là các đoạn gen (locus gen) có tính bền vững, đa hình cao, mang đặc trưng cho từng cá thể trở thành đối tượng cho việc nghiên cứu ứng dụng ADN trong khoa học điều tra, pháp y. Các đoạn lặp lại ngắn - STR (short tandem repeat) - là những trình tự ADN lặp lại liên tiếp với mỗi đơn vị lặp lại gồm 1 - 6 bp được nghiên cứu, lựa chọn và trở thành chỉ thị phân tử phổ biến nhất hiện nay.
Các locus STR đã được khảo sát, hệ thống lại tạo thành các bộ kit thương phẩm với khả năng khuếch đại đồng thời nhiều locus STR một cách nhanh chóng, chính xác, có độ nhạy cao. Song song với các locus STR trên cặp nhiễm sắc thể thường, việc nghiên cứu ứng dụng các locus STR trên nhiễm sắc thể giới tính X và Y cũng đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học. Các STR trên NST giới tính Y (gọi tắt là Y-STR) có đặc điểm chính là chỉ di truyền theo dòng cha mà không có sự tái tổ hợp. Phân tích Y-STR giúp giải quyết nhiều trường hợp khi việc sử dụng các STR trên nhiễm sắc thể thường không thể đáp ứng được yêu cầu giám định, đặc biệt là giám định ADN đối với các mẫu từ nam giới như trong việc xác định mối quan hệ cha - con, anh - em trai, các vụ án hiếp dâm.
Hiện nay việc phân tích Y-STR chủ yếu thực hiện qua các bộ kit thương mại hoá mà phổ biến nhất là bộ PowerPlex® Y23 system (hãng Promega) phân tích 23 Y-STR và bộ Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (hãng Thermo Fisher Scientific) phân tích 27 Y-STR. Hai bộ kit tỏ rõ hữu hiệu với nhiều ứng dụng khác nhau: phân biệt cá thể nam trong quần thể, xác định quan hệ huyết thống theo dòng cha, giám định hình sự trên mẫu có nồng độ m 2 ADN thấp, mẫu lẫn từ nhiều nguồn, mẫu vi vết. Do cấu trúc di truyền của từng quần thể là khác nhau nên việc đánh giá độ đa hình, tính phù hợp của các STR nói chung và Y-STR nói riêng là điều cần thiết trước khi áp dụng trong quần thể. Mỗi phòng thí nghiệm, viện nghiên cứu được khuyến cáo nên xây dựng bảng tần suất phân bố các alen với từng quần thể người khác nhau nhằm phục vụ cho việc tính toán độ tin cậy, xác suất có quan hệ huyết thống.
Việc sử dụng các bộ kit trên để nghiên cứu và ứng dụng các chỉ thị Y-STR trong khoa học kỹ thuật, hình sự, giám định huyết thống đã được áp dụng phổ biến trên thế giới. Tuy vậy tại Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết để khảo sát tần suất phân bố, độ đa hình, tính phù hợp, khả năng ứng dụng của các chỉ thị Y-STR trên quần thể đại diện cho nam giới người Việt. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở số ít các chỉ thị trên quy mô mẫu nhỏ. Việc khảo sát thêm các locus Y-STR nhằm phục vụ cho việc tính toán độ tin cậy hồ sơ Y-STR, xác suất có quan hệ theo dòng cha, ứng dụng trong khoa học hình sự là thực sự cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao.
Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y” với mục tiêu: 1. Lựa chọn và đánh giá các đặc điểm liên quan (tần suất phân bố alen, độ đa hình, khả năng phân biệt cá thể …) của 29 chỉ thị Y-STR trong quần thể nam giới Việt Nam dân tộc Kinh. Khảo sát một số chỉ thị có kích thước nhỏ trên NST Y (mini Y-STR) nhằm ứng dụng trong phân tích các mẫu có ADN đứt gãy nhiều, mẫu đã bị phân hủy. Đánh giá tính ứng dụng của các chỉ thị Y-STR trên nhiều loại mẫu khác nhau (mẫu lẫn, mẫu có chất lượng kém, mẫu đã phân hủy).
Nội dung nghiên cứu 1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu, tiến hành thu thập mẫu và tách chiết ADN. Thực hiện quy trình phân tích chỉ thị Y-STR từ các mẫu nghiên cứu. Lập bảng phân bố tần suất alen của các chỉ thị locus Y-STR và tính toán các chỉ số liên quan: số alen, độ đa hình, độ đa dạng haplotype, khả năng phân biệt cá thể.
Lựa chọn và tối ưu điều kiện khuếch đại một số mini STR trên NST Y và bước đầu ứng dụng trong công tác giám định ADN. Khảo sát khả năng tạo chỉ thị Y-STR trên nhiều loại mẫu giám định khác nhau như mẫu lẫn từ nhiều nguồn, mẫu hài cốt lâu năm, mẫu vi vết. Đóng góp mới của luận án 1. Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam khảo sát toàn diện 29 chỉ thị Y-STR trong quần thể nam giới dân tộc Kinh, Việt Nam với tổng cộng 400 mẫu nghiên cứu và số chỉ thị Y-STR lớn hơn so với nghiên cứu trước đây trong quần thể người Kinh, Việt Nam.
Nghiên cứu đã xây dựng bảng phân bố tần suất alen của 29 chỉ thị Y-STR là cơ sở để tính toán độ hiếm của một hồ sơ ADN trong quần thể cũng như chỉ số có quan hệ họ hàng (kinship index) giữa các hồ sơ ADN. Kết quả nghiên đã tìm ra những chỉ thị Y-STR có số alen lớn, độ đa hình cao, tiềm năng ứng dụng lớn trong phân biệt giữa các cá thể nam như DYS385, DYF387S1, DYS518, DYS 627, DYS458 và các chỉ thị có alen hiếm gặp trong quần thể. Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam thực hiện việc khảo sát các mini Y-STR - là các chỉ thị có kích thước ngắn dưới 200 bp, có hiệu quả cao trong việc phân tích các mẫu đã bị phân hủy so với các chỉ thị Y-STR thông thường trong bộ kit thương mại. Nghiên cứu đã khảo sát tiềm năng ứng dụng của các chỉ thị Y-STR trong bộ kit thương mại và các mini Y-STR theo nhiều hướng mới trong lĩnh vực giám định pháp y tại Việt Nam bao gồm: giám định các mẫu có quan hệ huyết thống theo dòng cha, giám định mẫu trong khoa học hình sự đặc biệt là với trường hợp mẫu lẫn giữa nam và nữ, giám định mẫu lâu năm, mẫu đã bị phân huỷ.
Bên cạnh đó kết quả từ 400 hồ sơ Y-STR còn được ứng dụng để xây dựng khoảng cách di truyền giữa quần thể người Việt Nam trong nghiên cứu với các nhóm quần thể khác trên thế giới. Phân tích ADN trong giám định pháp y Giám định pháp y là một ngành khoa học sử dụng những thành tựu trong lĩnh vực y học, sinh học, hoá học, vật lý học, tin học. để đáp ứng những yêu cầu của pháp luật trong hoạt động tố tụng hình sự và dân sự thông qua hoạt động giám định khi được các cơ quan trưng cầu. Các thành tựu từ lĩnh vực sinh học và công nghệ sinh học được đặc biệt ứng dụng trong lĩnh vực giám định pháp y, phản ánh những đặc trưng riêng biệt của từng cá thể để từ đó có thể truy nguyên cá thể [1].
Từ những năm 1930, dấu vân tay được đưa vào ứng dụng trong pháp y và trở thành công cụ cần thiết trong phòng xét nghiệm để nhận dạng cá thể. Tuy nhiên dấu vân tay cũng bộc lộ nhiều khiếm khuyết khi áp dụng trong thực tế như chỉ có thể thu mẫu ở đầu ngón tay, có thể bị thay đổi qua phẫu thuật, hung thủ không để lại dấu vân tay tại hiện trường…. Chỉ trong vòng hơn 60 năm kể từ khi cấu trúc ADN được Watson và Crick công bố ngành sinh học đã phát triển mạnh mẽ, được ứng dụng rộng rãi. Một trong những ứng dụng quan trọng là sử dụng đặc tính ADN đặc trưng của từng cá thể vào giám định pháp y để nhận dạng, phân biệt giữa các cá thể.
Được bắt đầu vào giữa những năm 1980 kỹ thuật phân tích ADN được coi là một cuộc cách mạng trong khoa học hình sự của nhân loại. Giống như dấu vân tay, mỗi người đều có đặc trưng riêng về cấu trúc di truyền của mình được xác định bằng trình tự nucleotide trên ADN. Việc phân tích ADN nhằm xác định các đặc trưng riêng của từng cá thể hình thành nên thuật ngữ kỹ thuật là dấu vân ADN (DNA fingerprint), dấu vân di truyền (genetic fingerprinting) hay lập hồ sơ ADN (ADN profiling) và mở ra hướng nghiên cứu mới là giám định ADN [2]. Kỹ thuật này lần đầu tiên được mô tả vào năm 1984 bởi nhà khoa học người Anh Alec Jeffreys.
Tiến sĩ Jeffreys nhận thấy tại các khu vực nhất định trong chuỗi ADN có các đoạn ADN được lặp đi lặp lại nhiều lần liên tiếp. Ông cũng phát hiện ra rằng số lượng các trình tự lặp lại có thể khác nhau ở các cá thể nhằm ứng dụng vào việc phân biệt giữa các cá thể. Bằng kỹ thuật xác định sự thay đổi chiều dài của các chuỗi ADN có trình tự lặp lại, Tiến sĩ Jeffreys đã phát hiện ra các kỹ thuật phân tích nhận dạng cá thể từ ADN. Do đó, Alec Jeffreys đã công bố rằng: “ADN là duy nhất ở m 5 mỗi cá thể, trong đó có những cặp base được di truyền từ cha và mẹ sang con.
Cấu trúc của ADN không thay đổi từ lúc còn là phôi thai cho đến suốt cuộc đời”. Cho đến nay giám định ADN trong khoa học hình sự và pháp y đã phổ biến và phát triển mạnh mẽ. Hầu hết các nước đều có phòng xét nghiệm ADN cho mục đích hình sự và dân sự. Ở Việt Nam kỹ thuật phân tích ADN được áp dụng vào những năm cuối của thập niên 90 và thực sự phát triển trong khoảng 10 năm trở lại đây.
Hiện nay, giám định ADN có 2 loại chính theo mục đích ứng dụng đó là: giám định để xác định mối quan hệ huyết thống và giám định pháp y.