CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Công nghệ mô sụn Công nghệ mô là một lĩnh vực đa ngành, ứng dụng các công cụ kỹ thuật kết hợp y sinh học và khoa học công nghệ để sử dụng các tế bào sống hoặc thu hút các tế bào nội sinh nhằm hỗ trợ sự hình thành hoặc tái tạo mô để hồi phục, duy trì hoặc cải thiện chức năng của mô [3], công nghệ mô đã được áp dụng để sửa chữa, tái tạo các tổn thương ở nhiều loại cơ quan khác nhau như mô xương, gan, tụy … và mạch máu [105]. Riêng đối với công nghệ mô sụn, mục đích nghiên cứu là tạo ra các loại tấm tế bào sụn công nghệ dùng để thay thế mô sụn. Một trong những lợi ích quan trọng nhất của công nghệ này là có thể sử dụng chính tế bào tự thân của người bệnh để tạo ra các mảnh ghép cho chính họ, các mảnh ghép thay thế này có thể dễ dàng vượt qua rào cản miễn dịch ghép của cơ thể.
So với việc sử dụng mô ghép tự thân, mảnh ghép công nghệ sử dụng một lượng tế bào hiến ít hơn (vì số tế bào thu nhận được sẽ được làm tăng lên thông qua việc nhân khối in vitro) và làm giảm tổn thương cho người bệnh khi phải phẫu thuật thu nhận mô sụn tự thân để ghép vào các tổn thương sụn. Các thành phần cơ bản để tạo ra tấm tế bào sụn dựa trên nền tảng công nghệ mô gồm có 3 yếu tố là tế bào, giá thể và các yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ quá trình tạo sụn. Trong đó, giá thể kết hợp với yếu tố hoạt hóa sinh học sẽ tạo một môi trường thuận lợi giúp cho sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào, đồng thời giá thể còn giúp tạo sự toàn vẹn cơ học khi cấy ghép in vivo. Sự tăng sinh, hoạt động biến dưỡng và biệt hóa của tế bào sẽ được định hướng thông qua tác động của các yếu tố tăng trưởng [37].
Nguồn tế bào được sử dụng trong công nghệ mô sụn được nghiên cứu ứng dụng nhiều hiện nay là TBGTM, đây được cho là sự lựa chọn phù hợp thay thế cho tế bào sụn trong việc tái tạo mô. Không những khắc phục được những nhược điểm khi cấy ghép tế bào sụn, TBGTM còn có khả năng điều biến miễn dịch giúp hạn chế quá trình viêm khi cấy ghép và khả năng biệt hóa thành tế bào sụn [100]. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 1. Tế bào gốc trung mô Hiện nay, tế bào gốc (TBG) được xem là nguồn tế bào vô tận.
Chúng có thể được thu nhận từ phôi, thai và các mô ở người trưởng thành. Ngược lại với những tế bào từ cơ thể trưởng thành, TBG từ phôi hoặc thai có khả năng tăng sinh không giới hạn nên có thể được sử dụng trong các liệu pháp điều trị. Ngoài ra, các TBG này còn có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể khi cảm ứng trong điều kiện nuôi cấy thích hợp. Trong giai đoạn 3 lá phôi, lớp trung bì phôi được tạo thành giữa lớp ngoại bì và nội bì phôi.
Lớp tế bào của phần trung bì có chứa các tế bào được cho là các tế bào gốc trung mô (TBGTM), đây là quần thể tế bào gốc đa tiềm năng còn tồn tại sau khi sinh. TBGTM có thể thu nhận từ nhiều nguồn mô khác nhau của phôi, thai cho đến các mô của cơ thể trưởng thành. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu tập trung nhiều hơn ở các loại mô có nguồn gốc từ cơ thể trưởng thành vì các ưu điểm nổi bật mà các mô này mang lại như dễ thu nhận, vượt qua rào cản y đức cũng như có thể dễ dàng để ghép tự thân lại cho người bệnh [69]. Ngày nay, các TBGTM được xác định chắc chắn xuất hiện trong nhiều loại mô, cụ thể như là mô mỡ, mô cơ, màng xương, cuống rốn, máu cuống rốn, tủy răng, nhú răng, gai nhau, dịch ối … đã được nghiên cứu rất nhiều, với nguồn cung cấp TBGTM khá dồi giàu sẽ là một điều kiện thuận lợi để chúng ta có thể sử dụng các tế bào này trong các liệu pháp tế bào, đặc biệt là trong lĩnh vực y học tái tạo [164].
Khả năng tăng trưởng và duy trì tiềm năng biệt hóa của TBGTM phụ thuộc vào nhiều yếu tố như là nguồn mô thu nhận, kỹ thuật nuôi cấy, hóa chất sử dụng …. Trong đó, đặc biệt là việc lựa chọn loại huyết thanh phù hợp để bổ sung vào môi trường nuôi tế bào. Theo như Caplan và CS [30] sự hình thành chất nền ngoại bào cũng được quan sát thấy khi nuôi TBGTM trong môi trường có chứa nồng độ huyết thanh cao của thai bò hoặc ngựa khi sử dụng ở nồng độ 10% hoặc 20% huyết thanh. Do đó, huyết thanh cung cấp nhiều yếu tố rất quan trọng cho việc trao đổi, vận chuyển các phân tử thiết yếu và chất dinh dưỡng để hỗ trợ cho tế bào tăng trưởng.
6 Số lượng TBGTM hiện diện trong một mẫu tủy xương có thể được xác định bằng cách đếm các cụm tế bào CFU trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp bằng cách áp dụng phương pháp tạo dòng tế bào theo tác giả Friedenstein [56]. Số lượng các cụm tế bào được tìm thấy tương ứng với số lượng tế bào đơn nhân ban đầu được phân lập từ tủy xương [56], nhiều tác giả đồng ý rằng dữ liệu đó có thể sử dụng để tính toán cho các TBGTM trong nguồn mẫu thu nhận từ ban đầu. Thông thường số lượng này nằm trong 5 6 khoảng 1 TBGTM cho khoảng từ 1×10 đến 1×10 tế bào đơn nhân trong tủy xương [71]. Trong lĩnh vực công nghệ mô sụn cần phải sử dụng một lượng lớn tế bào để ghép lại cho người bệnh, do đó một lượng nhỏ các TBGTM phân lập sẽ được nhân khối và cho tăng trưởng để gia tăng đủ số lượng tế bào để tiến hành ghép lại cho người bệnh.
Quần thể TBGTM chưa có dấu ấn đặc hiệu để xác định. Tuy nhiên, quần thể tế bào tiền thân của các tế bào này đã được xác định bằng sự hiện diện của một số dấu ấn bề mặt tế bào cũng như không biểu hiện của một số dấu ấn. Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế (ISCT) đã đưa ra các tiêu chí để sử dụng cho việc định danh các quần thể TBGTM này [48]: Thứ nhất, đó là các tế bào có khả năng bám dính vào đáy chai nuôi khi được nuôi cấy trong điều kiện in vitro. Thứ hai, đó là các tế bào không biểu hiện các dấu ấn của các tế bào tạo máu như CD11b, CD14, CD34, CD45, B-lymphocyte antigens CD19 và CD79a và HLA-DR nhưng biểu hiện được các dấu ấn như CD73, CD90 và CD105.
Thứ ba, đó là các tế bào có khả năng biệt hóa thành các tế bào của dòng trung mô như là tế bào sụn, tế bào mỡ và tế bào xương trong điều kiện in vitro. Đặc điểmTBGTM thu nhận từ mô mỡ TBGTM từ mô mỡ hay còn gọi là tế bào gốc từ mô mỡ (ADSC) được phát hiện đầu tiên vào năm 1980 do Plaas và Vryer. Các tác giả cho rằng, mô mỡ bò trưởng thành chứa các tế bào giống nguyên bào sợi có tiềm năng biệt hóa thành tế bào mỡ. Một số nghiên cứu đã kiểm tra sự tồn tại của tế bào gốc trong mô mỡ ở các loài khác 7 nhau.
Năm 2001, Patricia Zuk và nhóm nghiên cứu của đại học California (Mỹ) công bố thu nhận được tế bào từ mỡ hút được xử lý bằng kỹ thuật chọc hút mỡ. Mỡ sau khi thu nhận được rửa với dung dịch PBS và tách với collagenase 0,075%. Phân lớp mạch nền được thu nhận bao gồm các loại tế bào khác nhau như TBGTM, tế bào gốc tạo máu và các tế bào không phải tế bào gốc như tế bào nội mạch, nguyên bào sợi, tế bào máu, tế bào tiềm năng tạo mỡ và tế bào quanh mao mạch. Để phân lập TBGTM khỏi các tế bào khác, tế bào được nuôi trên bề mặt nuôi cấy plastic trong thời gian dài, trong đó các tế bào có khả năng bám dính bám trên bề mặt nuôi cấy có khả năng sống sót trong khi các tế bào phát triển huyền phù như tế bào tạo máu không có khả năng tăng sinh và bị loại bỏ trong quá trình nuôi.
Sau vài lần cấy chuyền, các tế bào không phải tế bào gốc như tế bào nội mô có khả năng tăng sinh và chu kỳ sống có giới hạn không thể duy trì trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy mất đi trong quá trình nuôi. Lượng ADSC thu nhận từ mô mỡ tương đương (hay nhiều hơn) lượng TBG thu từ tủy xương [42]. 5 Với 30 ml tủy xương thu được khoảng 1x10 tế bào [24], trong khi với 21 ml mỡ hút 6 dưới xương bánh chè có thể thu được khoảng 5,5x10 tế bào [167]. Quần thể tế bào này có thể được duy trì trong điều kiện in vitro trong thời gian dài với khả năng tăng sinh ổn định và khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau.
Việc phát hiện sự tồn tại của nguồn TBGTM trong mô mỡ đã mở ra một tiềm năng to lớn trong ứng dụng điều trị. Thứ nhất, mô này là phổ biến, có nhiều trong cơ thể người, dễ dàng thu nhận, ít xâm lấn nên ít gây đau đớn cho bệnh nhân so với việc thu nhận tủy xương. Lượng TBGTM tự thân cần thiết cho nghiên cứu có thể được thu nhận từ khoảng 1g mỡ. Hơn nữa, chỉ cần gây tê cục bộ và vết thương có thể lành trong vòng 1 tuần.
Nếu mỡ thu nhận từ người cho là mỡ hút hoặc mỡ từ phẫu thuật dưới da, thì lượng TBGTM đủ để cấy ghép ngay sau đó mà không cần qua bước nhân khối ex vivo. Thứ hai, mô này cũng là nguồn tế bào có thể tự tái tạo lại được trong cơ thể. Thứ ba, và quan trọng nhất, nó là nguồn mô tự ghép. Ngoài ra, mô mỡ có những đặc điểm nổi trội hơn các nguồn mô có thể thu nhận được tế bào gốc trưởng thành trong nghiên cứu và ứng dụng.
Đó là vì: 8 Thứ nhất, mô mỡ có chứa các tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào nội mô, nguyên bào sợi, tế bào máu và các TBGTM hay còn gọi là tế bào gốc từ mô mỡ (ADSC) [87]. Các ADSC này có thể dễ dàng được phân lập, nuôi cấy, tăng sinh in vitro và có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào của các dòng khác nhau.