MỞ ĐẦU TNF-α là một cytokine tiền viêm đóng vai trò then chốt trong cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm khớp dạng thấp (VKDT). Các thuốc điều trị VKDT chủ yếu tập trung vào việc ức chế khả năng hoạt động của TNF-α, ví dụ như Adalilumab, Infliximab và Etanercept.Cho đến nay, việc sử dụng Etanercept (ETA) trung hòa TNF-α được xem là phương pháp hiệu quả nhất cho việc điều trị căn bệnh này. Tuy nhiên, việc sử dụng sản phẩm này cũng gây ra nhiều tác dụng phụ tới người bệnh do liều tiêm cao (25 mg/lần, 2 lần/tuần) và quá trình điều trị kéo dài. Chính vì vậy, việc giảm liều lượng tiêm, số lần tiêm cũng như kéo dài thời gian hiệu quả của thuốc là rất cần thiết.
Các hệ mang ETA này mới đạt được khả năng bao gói và giải phóng thuốc có kiểm soát, hứa hẹn một hệ mang thuốc tiềm năng hạn chế tác dụng phụ của ETA; tuy nhiên, hệ vận chuyển này lại chưa đạt được hiệu quả cao do tính hướng đích còn bị hạn chế. Tại vị trí khớp viêm, các tế bào miễn dịch tập trung với số lượng rất lớn, đồng thời chúng có khả năng biểu hiện mạnh thụ thể Dectin-1 cao hơn bốn lần so với ở vị trí bình thường. Liên kết β-1,3 glucan của curdlan có ái lực mạnh với thụ thể dectin-1 và vật liệu này cũng dễ dàng polimer hóa cũng như chế tạo thành vật liệu mang thuốc. Thực tế, curdlan cũng đã được dùng làm vật liệu bao gói.
Dựa vào đặc điểm quan trọng này nhóm nghiên cứu đã đưa ra ý tưởng sử dụng curdlan để tạo ra tính hướng đích cho vật liệu mang thuốc. Agarose là một polysaccharide mạch thẳng, tan ở nhiệt độ trên 60oC và trở về dạng đông đặc và tạo mạng lưới lưu giữ các chất tan khi nhiệt độ trở lại bình thường. Agarose đã được sử dụng trong nhiều mục đích nghiên cứu sinh học và cũng đã được một số nhà khoa học nghiên cứu để tạo thành vật liệu mang thuốc. Chúng tôi cho rằng sự kết hợp giữa agarose với curdlan sẽ là vật liệu tiềm năng trong việc tạo vật liệu dẫn thuốc hướng đích.
Chúng được đưa về kích thước nano nhằm tận dụng được các ưu điểm của kích thước này như khả năng bao gói thuốc, khả năng giải phóng thuốc được kiểm soát, khả năng dẫn thuốc hướng đích đặc hiệu và phát huy tác dụng sinh học của thuốc một cách hiệu quả. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tác dụng sinh học của một phức hệ mang thuốc dạng nano cần đánh giá trên nhiều đối tượng và cấp độ thực nghiệm, như đánh giá thực nghiệm trên tế bào động vật, trên động vật thực nghiệm hay trên người. Trong đó, biện pháp đánh giá tác dụng sinh học trên tế bào là bước đầu tiên kiểm tra tác dụng sinh học của thuốc ở in vitro. Từ đó, đưa ra được các đặc tính sinh học của phức hệ, đưa ra các bằng chứng thực nghiệm về tính hướng đích và khả năng trung hoà TNF-α của phức hệ mang thuốc.
Trên cơ sở đó bước đầu nhận định về một tiềm năng mang thuốc ETA làm giảm tác dụng phụ và tăng khả năng hướng đích cho điều trị VKDT. Dòng đại thực bào chuột RAW264.7 là một dòng tế bào thương mại dễ nuôi, phổ biến, có khả năng sản xuất các cytokines như: IL-1β, IL-6, IL-10, hay TNF-α…. Ngoài ra, dòng tế bào này cũng biểu hiện mạnh thụ thể Dectin-1, một thụ thể biểu hiện nhiều ở các tế bào miễn dịch trong các ổ dịch VKDT. Vì vậy, đại thực bào RAW264.7 là một ứng cử viên sáng giá cho mô hình thử nghiệm hoạt tính sinh học cấp độ tế bào cho các sản phẩm điều trị bệnh VKDT.
Trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo phức hệ gel Agarose-Curldan mang thuốc Etanercept ức chế yếu tố hoại tử u TNF-α và thử nghiệm trên đại thực bào RAW264.7” với các nội dung cụ thể sau: 1. Chế tạo phức hệ agarose - curdlan mang thuốc etanercept ở dạng nanogel. Đánh giá các tác dụng hướng đích và khả năng trung hoà TNF-α của phức hệ agarose - curdlan mang etanercept trên mô hình tế bào RAW264. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1.
Vai trò của TNF-α trong các phản ứng viêm và viêm khớp dạng thấp 1. Yếu tố hoại tử khối u TNF alpha TNF-α là một tín hiệu protein của tế bào (cytokine) thuộc họ yếu tố hoại tử khối u và có cấu trúc tam trùng phân (trimer). TNF-α là cytokine có ý nghĩa quan trọng trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh và trung gian đáp ứng của vật chủ chống lại các tác nhân gây nhiễm trùng. Đây là một cytokine tiền viên hay gọi là yếu tố trung gian có vai trò quan trọng với phản ứng chống viêm.
Chúng liên quan đến quá trình chết theo chương trình của tế bào và điều hòa các hoạt động chức năng của các tế bào miễn dịch [17]. TNF-α được tiết ra bởi các tế bào miễn dịch đặc biệt là đại thực bào và tế bào bạch cầu. Ngoài ra, cytokine này còn được sản xuất bởi các tế bào lympho hay nguyên bào sợi. TNF-α liên quan đến hầu hết các quá trình viêm trong cơ thể.
Khi được tiết với lượng bình thường, TNF-α đóng vai trò duy trì cân bằng nội môi. Lượng TNF-α được tiết ra nhiều hơn khi cơ thể cần chống lại sự nhiễm trùng, lúc này TNF-α đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoạt hóa các tế bào miễn dịch. Tuy nhiên, khi TNF-α được tiết ra với lượng quá mức, các bệnh lý miễn dịch sẽ xuất hiện, chẳng hạn như bệnh lý của VKDT, lupus ban đỏ [15]. Khi có mặt yếu tố kích thích viêm như lipopolysaccharide (LPS), quá trình tiết LPS của đại thực bào bắt đầu diễn ra [58].
Thụ thể TLR-4 có mặt trên màng các tế bào miễn dịch có thể nhận biết hiệu quả lipopolysaccharit (LPS) và kích hoạt tín hiệu thông qua một số cơ chế phân tử, ví dụ, yếu tố biệt hóa myeloid 88 (MyD88), Toll/IL-1 để kích hoạt các con đường tín hiệu của NF-κB, MAP kinase và JNK làm tăng sự biểu hiện các cytokine tiền viêm trong đó có yếu tố hoại tử khối u TNF-α (Hình 1. Với cơ chế này, nhóm nghiên cứu sử dụng LPS để hoạt hóa sự biểu hiện TNF-α trên dòng đại thực bào chuột RAW264.7 để thực hiện thí nghiệm kiểm tra khả năng trung hòa TNF-α. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sự kích hoạt đại thực bào biểu hiện TNF-α thông qua thụ thể TLR4 [56,58] Các thụ thể TNF-α có mặt trên hầu hết các tế bào, hai thụ thể màng tế bào đã được xác định là thụ thể hoại tử khối u 1 (TNF receptor 1 - TNF-R1) và thụ thể hoại tử khối u 2 (TNF-R2).
Cả hai thụ thể này là các protein màng tế bào, có cấu trúc khá giống nhau và một miền xuyên màng duy nhất. Cả hai thụ thể đều có khả năng bắt cặp với dạng hòa tan của TNF-α [4]. TNF-α và bệnh viêm khớp dạng thấp Viêm khớp dạng thấp là căn bệnh tự miễn phổ biến nhất không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới [16, 49], biểu hiện của bệnh là quá trình viêm không đặc hiệu xảy ra ở các vùng sụn khớp và đầu xương dưới sụn (Hình 1. Khớp xƣơng của ngƣời bình thƣờng (Trái) và khớp xƣơng của bệnh nhân VKDT (Phải) [19] 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Quá trình biểu hiện viêm gây nên cảm giác đau khớp ở một bộ phận chi hay khắp cơ thể, lâu dần người bệnh sẽ bị biến dạng khớp hay dính khớp thường gặp ở người từ 35 đén 50 tuổi và nhiều hơn ở nữ giới [16].
Triệu chứng bệnh có thể phân biệt với các bệnh khớp khác thông qua triệu chứng viêm không đặc hiệu đối xứng ở các vị trí trên cơ thể, diễn biến kéo dài tiến triển thành từng đợt, có xu hướng tăng dần [17]. Các tác động của bệnh VKDT lên bệnh nhân rất đa dạng và tiến triển theo thời gian như là cứng khớp, khó vận động, đau khớp. Bệnh gây đau đớn kéo dài, gây hiện tượng khó vẫn động và nhiều biến chứng nguy hiểm thậm chí có thể dẫn đến tử vong nếu không được điều trị kịp thời và đúng cách. TNF hoà tan được tìm thấy với nồng độ cao trong dịch khớp và huyết thanh của bệnh nhân VKDT [20].
Là một tín hiệu tự tiết, TNF-α gây ra hàng loạt các phản ứng viêm dây chuyền khác trong quá trình biểu hiện bệnh VKDT. TNF-α đóng một vai trò chi phối trong quá trình bệnh sinh của VKDT. Quá trình nuôi cấy tế bào mô hoạt dịch tách từ những bệnh nhân bị viêm khớp dạng thấp cho thấy, việc ức chế khả năng kết hợp của TNF-α với các phối tử của nó trên bề mặt các tế bào nuôi cấy làm giảm đáng kể sự tạo thành IL-1, IL-6, IL-8 và GM-CSF [69]. Tế bào tiết TNF-α bên trong màng hoạt dịch làm kích thích quá trình tăng sinh và tăng tiết các loại cytokines của tế bào T, làm tăng sự biệt hóa tạo thành khớp xương, kích thích quá trình tổng hợp IL-1, kích thích quá trình bạch cầu đa nhân xâm nhập vào màng hoạt dịch, phân hủy collagen, prostaglandins gây ra hiện tượng kết dính lại với nhau của tế bào nội mô.
Kết quả của quá trình này là dẫn đến sự biến dạng khớp, gây đau đớn và khó khăn trong quá trình vận động của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp. Các quá trình này còn được chứng minh là gây tổn thương mô và các kết quả sinh lý trong điều kiện viêm mãn tính như trong các bệnh viêm khớp. Ngoài ra, các mao mạch cũng được tăng sinh tạo điều kiện cho quá trình xâm nhập của các tế bào miễn dịch vào ổ hoạt dịch khiến quá trình viêm trầm trọng hơn theo thời gian. Các loại tế bào tiết TNF-α kích hoạt các tế bào T CD4 tạo ra các cytokine như IL-1, IL-6 và TNF-α [20, 22, 49, 69].
5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kích thích mạnh quá trình tạo xương Tăng sinh tế bào Tạo kháng thể Tăng cường phản hồi cấp tính Tăng cường biệt hóa Chết theo chương trình Kích hoạt quá trình phân Chỉnh sửa synaps hủy và chết của Myo cyte Hình 1.