Luận văn thạc sĩ: Cải biến gen enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính

Luận văn thạc sĩ phân tích hus cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Đặng Thị Kim Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Axit phytic và phytate
• 1.2. Enzyme phân giải phytate (phytase)
• 1.2.1. Phân loại enzyme phytase
• 1.3. Nguồn phytase
• 1.3.1. Phytase từ vi sinh vật
• 1.3.2. Phytase từ thực vật
• 1.3.3. Phytase từ động vật
• 1.4. Ứng dụng của phytase
• 1.4.1. Trong chăn nuôi
• 1.4.2. Trong công nghệ thực phẩm
• 1.4.3. Trong công nghiệp giấy
• 1.4.4. Trong cải tạo đất
• 1.4.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate
• 1.5. Các nghiên cứu tách dòng biểu hiện phytase trên thế giới
• 1.6. Các nghiên cứu về enzyme phytase ở Việt Nam
• 1.7. Cấu trúc protein liên quan đến khả năng hồi tính của phytase từ A. niger
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vi sinh vật
• 2.2. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp Mega-PCR
• 2.3.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction
• 2.3.3. Ghép nối plasmid
• 2.3.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt
• 2.3.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep
• 2.3.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến nạp xung điện
• 2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastoris
• 2.3.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris
• 2.3.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE. Xác định hoạt tính phytase
• 2.3.10. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200
• 2.3.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. Cải biến trình tự gen mã hóa phytase
• 3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt
• 3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCR
• 3.1.3. Tạo plasmid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm
• 3.2. Chuyển gen phyA vào tế bào nấm men Pichia pastoris
• 3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện
• 3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris
• 3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp
• 3.3. Thu hồi và tinh sạch enzyme phytase tái tổ hợp
• 3.4. Xác định các đặc tính của enzyme phytase tái tổ hợp sau khi cải biến gen
• 3.4.1. Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp
• 3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp
• 3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp
• 3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu cải biến gen enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger

Nghiên cứu về enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger đã thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học thực nghiệm. Enzyme này có vai trò quan trọng trong việc phân giải axit phytic, giúp tăng cường khả năng hấp thu dinh dưỡng cho động vật. Tuy nhiên, enzyme phytase tự nhiên từ A. niger thường gặp khó khăn trong việc duy trì hoạt tính ở nhiệt độ cao. Do đó, việc cải biến gen mã hóa enzyme này nhằm tăng khả năng hồi tính là một hướng đi cần thiết. Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện hiệu suất enzyme mà còn góp phần bảo vệ môi trường trong ngành chăn nuôi.

1.1. Enzyme phytase và vai trò của nó trong dinh dưỡng động vật

Enzyme phytase có khả năng thủy phân axit phytic thành các gốc phosphate đơn, giúp động vật hấp thu phospho và các khoáng chất khác. Điều này đặc biệt quan trọng đối với động vật dạ dày đơn như lợn và gia cầm, nơi mà khả năng tiêu hóa phytate rất hạn chế. Việc bổ sung phytase vào thức ăn không chỉ cải thiện khả năng tiêu hóa mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường do lượng phospho thải ra ngoài.

1.2. Tình hình nghiên cứu enzyme phytase tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tách dòng và biểu hiện enzyme phytase từ các loài nấm khác nhau, đặc biệt là từ A. niger. Các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng enzyme phytase từ A. niger có hoạt tính cao nhưng lại kém bền nhiệt. Do đó, việc cải biến gen để tăng cường tính bền nhiệt của enzyme là một thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu enzyme phytase

Mặc dù enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger có nhiều ứng dụng trong chăn nuôi, nhưng vẫn tồn tại một số vấn đề lớn cần giải quyết. Đầu tiên, enzyme này thường bị bất hoạt khi tiếp xúc với nhiệt độ cao trong quá trình chế biến thức ăn. Thứ hai, khả năng hồi tính của enzyme sau khi bị biến tính cũng là một thách thức lớn. Việc cải biến gen để tạo ra các biến thể enzyme bền nhiệt hơn là một giải pháp tiềm năng.

2.1. Khó khăn trong việc duy trì hoạt tính enzyme ở nhiệt độ cao

Trong quá trình chế biến thức ăn chăn nuôi, nhiệt độ thường đạt tới 70-80°C, điều này làm giảm hoạt tính của enzyme phytase. Việc tìm kiếm các biến thể enzyme có khả năng chịu nhiệt tốt hơn là rất cần thiết để đảm bảo hiệu quả dinh dưỡng cho động vật.

2.2. Thách thức trong việc cải biến gen enzyme phytase

Cải biến gen enzyme phytase để tăng cường khả năng hồi tính là một thách thức lớn. Các nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào việc thay đổi cấu trúc axit amin của enzyme để tạo ra các biến thể bền nhiệt hơn mà vẫn giữ được hoạt tính cần thiết.

III. Phương pháp cải biến gen enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger

Để cải biến gen mã hóa enzyme phytase, nghiên cứu đã áp dụng phương pháp Mega-PCR nhằm tạo ra các đột biến điểm trong trình tự gen. Phương pháp này cho phép thay thế một số axit amin trong cấu trúc protein, từ đó tăng cường tính bền nhiệt của enzyme. Các bước thực hiện bao gồm tách dòng gen, ghép nối plasmid và chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris.

3.1. Quy trình tách dòng và ghép nối plasmid

Quy trình tách dòng gen mã hóa enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger bao gồm việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen bằng phương pháp PCR. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch và ghép nối vào plasmid để tạo ra vector tái tổ hợp.

3.2. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris

Sau khi tạo ra vector tái tổ hợp, gen được chuyển vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến nạp xung điện. Phương pháp này giúp tăng cường hiệu quả chuyển gen và tạo ra các dòng tế bào biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn enzyme phytase

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme phytase tái tổ hợp có khả năng hồi tính tốt hơn so với enzyme tự nhiên. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng enzyme này duy trì hoạt tính ở nhiệt độ cao hơn, từ đó mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong ngành chăn nuôi. Việc sử dụng enzyme phytase tái tổ hợp không chỉ giúp cải thiện hiệu suất dinh dưỡng mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

4.1. Đánh giá hoạt tính enzyme phytase tái tổ hợp

Hoạt tính của enzyme phytase tái tổ hợp được đánh giá thông qua các thí nghiệm xác định pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu. Kết quả cho thấy enzyme này có khả năng hoạt động tốt trong môi trường axit và duy trì hoạt tính ở nhiệt độ cao, điều này rất quan trọng trong ứng dụng thực tiễn.

4.2. Ứng dụng enzyme phytase trong chăn nuôi

Enzyme phytase tái tổ hợp có thể được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện khả năng hấp thu phospho và các khoáng chất khác. Điều này không chỉ giúp tăng trưởng nhanh hơn cho động vật mà còn giảm thiểu ô nhiễm phospho trong môi trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu enzyme phytase

Nghiên cứu cải biến gen enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger đã mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực sinh học thực nghiệm. Việc tạo ra các biến thể enzyme bền nhiệt không chỉ giúp cải thiện hiệu suất dinh dưỡng cho động vật mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme và mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác.

5.1. Triển vọng nghiên cứu enzyme phytase trong tương lai

Nghiên cứu về enzyme phytase sẽ tiếp tục được mở rộng với mục tiêu tạo ra các biến thể enzyme có khả năng hoạt động tốt hơn trong các điều kiện khác nhau. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả sử dụng enzyme trong chăn nuôi và các ngành công nghiệp khác.

5.2. Tác động của enzyme phytase đến môi trường

Việc sử dụng enzyme phytase tái tổ hợp không chỉ giúp cải thiện dinh dưỡng cho động vật mà còn giảm thiểu ô nhiễm phospho trong môi trường. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ hệ sinh thái và phát triển bền vững trong ngành nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Axit phytic chiếm khoảng 65% đến 80% tổng lượng phospho dự trữ trong các loại hạt ngũ cốc, cây họ đậu và hạt có dầu. Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và thủy sản hầu như không thể tự hấp thụ nguồn phospho này do thiếu hụt enzyme phytase nội sinh trong đường tiêu hóa. Axit phytic liên kết chặt chẽ với các cation kim loại thiết yếu như kẽm, canxi, magie, sắt và tạo phức với protein tiêu hóa, dẫn đến giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Lượng phospho không được hấp thu bị thải trực tiếp ra môi trường, gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa và bùng phát tảo nở hoa tại các thủy vực.

Để giải quyết vấn đề trên, ngành chăn nuôi cần bổ sung enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phosphohydrolase) vào khẩu phần ăn nhằm thủy phân phytate thành inositol và phospho vô cơ hòa tan. Mặc dù phytase từ nấm mốc Aspergillus niger sở hữu hoạt tính thủy phân cao tại môi trường axit dạ dày, nhưng enzyme tự nhiên lại kém bền nhiệt và dễ bị bất hoạt trong công đoạn ép viên thức ăn chăn nuôi vốn yêu cầu nhiệt độ gia nhiệt từ 70°C đến 80°C để tiêu diệt khuẩn Salmonella.

Được thực hiện vào năm 2015 tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm phối hợp cùng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, đề tài tập trung cải biến trình tự gen phyA từ chủng nấm mốc bản địa Aspergillus niger CNTP 5131. Mục tiêu cốt lõi là tạo ra enzyme phytase tái tổ hợp trên hệ thống biểu hiện nấm men Pichia pastoris X33 có khả năng tự phục hồi cấu trúc không gian sau khi biến tính nhiệt độ cao, duy trì hoạt tính sinh học trên 60% sau khi gia nhiệt, đồng thời giữ vững độ bền trong dải pH axit từ 2,0 đến 5,5, góp phần hạ giá thành sản xuất phụ gia chăn nuôi nội địa và giảm thiểu trên 40% lượng phospho thải ra môi trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết sinh học phân tử và kỹ nghệ protein:

1. Lý thuyết xúc tác của Histidine Acid Phosphatase (HAPhy): Phytase từ nấm sợi thuộc nhóm phosphatase axit chứa gốc histidine với hai motif trình tự bảo thủ nghiêm ngặt là RHGXRXP ở đầu N và HD ở đầu C. Cấu trúc không gian của enzyme gồm hai miền chính: miền lớn α/β và miền nhỏ xoắn α, trong đó trung tâm hoạt động tích điện dương nằm sâu tại khe phân cách giữa hai miền này.
2. Lý thuyết ổn định nhiệt và cơ chế hồi tính protein: Nghiên cứu cấu trúc tinh thể phytase từ Aspergillus fumigatus chỉ ra rằng khả năng chịu nhiệt không chỉ phụ thuộc vào độ cứng vững của khung polypeptide mà còn nhờ vào khả năng tự cuộn gập lại trạng thái hoạt động ban đầu sau khi nguội. Khả năng này được định hình bởi mạng lưới liên kết hydro dày đặc tại vòng thòng lọng Glu35-Ser42 cùng các cầu muối ion do gốc Arginine tại vị trí 168 và 248 hình thành cấu trúc hộp gắn mũ ở đầu C của chuỗi xoắn α.
3. Mô hình gây đột biến định hướng Mega-PCR: Kỹ thuật cải tạo protein dựa trên nguyên lý sử dụng sản phẩm PCR kích thước lớn mang đột biến điểm làm mồi cho chu kỳ khuếch đại tiếp theo, cho phép thay thế đồng thời 4 axit amin mục tiêu mà không làm xáo trộn khung đọc mã của gen.

Các khái niệm then chốt bao gồm: axit phytic, enzyme phytase (EC 3.1.3.8), tái tổ hợp DNA, biểu hiện ngoại bào qua promoter AOX1, và quá trình hồi tính nhiệt.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu di truyền gồm 12 chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm. Chủng Aspergillus niger CNTP 5131 (mã P12) được lựa chọn làm nguồn gen khuôn nhờ độ bền nhiệt nền cao nhất. Phương pháp phân tích và quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các bước:

• Gây đột biến định hướng: Sử dụng kỹ thuật Mega-PCR hai bước với các cặp mồi chuyên biệt để thay thế đồng thời 4 axit amin: A58E, P65S, Q191R, T271R trên đoạn gen phyA kích thước 1,3 kb.
• Tạo dòng và chuyển gen: Ghép nối đoạn gen cải biến vào vector biểu hiện pPICZαA (kích thước 3,6 kb) qua hai vị trí cắt giới hạn EcoRI và XbaI, nhân dòng trong tế bào Escherichia coli DH5α. Vector tái tổ hợp sau đó được mở vòng bằng enzyme giới hạn MssI và biến nạp vào nấm men Pichia pastoris X33 bằng phương pháp xung điện ở hiệu điện thế 2,0 kV trong thời gian 1 mili-giây.
• Sàng lọc và đánh giá hoạt tính: Tuyển chọn các thể biến nạp kháng kháng sinh Zeocin ở nồng độ 100 µg/ml, nuôi biểu hiện cảm ứng bằng methanol 0,5% theo chu kỳ 24 giờ trên vi đĩa 24 giếng và bình tam giác 1 lít.
• Phân tích hóa sinh và tinh sạch: Kiểm tra kích thước protein tái tổ hợp bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 12%. Nồng độ enzyme được cô đặc qua hệ thống lọc luân hồi tiếp tuyến Viva Flow 200 với màng lọc kích thước lỗ 5 kDa ở tốc độ 100 ml/giờ. Hoạt tính phytase được định lượng theo phương pháp so màu phức chất ammonium molybdate của Shimizu tại bước sóng 700 nm, đối chiếu với đường chuẩn kali dihydrophosphate (KH2PO4) từ 0,0 mM đến 2,0 mM.

Lý do lựa chọn hệ thống Pichia pastoris thay vì vi khuẩn E. coli là nhờ khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã, đặc biệt là quá trình glycosyl hóa và bài tiết protein trực tiếp ra môi trường nuôi cấy, giúp enzyme cuộn gập chính xác và dễ dàng thu hồi.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thu được các kết quả nổi bật sau:

1. Cải biến thành công 4 đột biến điểm trên gen phyA: Phương pháp Mega-PCR đã khuếch đại thành công đoạn gen phyA-AAS5 kích thước 1,3 kb. Kết quả giải trình tự gen trên phần mềm chuyên dụng xác nhận 4 bộ ba mã hóa đã biến đổi chính xác: vị trí 58 (GCA thành GAA), vị trí 65 (CCT thành TCT), vị trí 191 (CAA thành AGA) và vị trí 271 (ACC thành AGA), dẫn đến sự thay thế tương ứng của các axit amin A58E, P65S, Q191R và T271R mà không phát sinh bất kỳ đột biến ngoài ý muốn nào.
2. Hiệu suất biến nạp và tích hợp hệ gen cao: Đoạn DNA mạch thẳng kích thước khoảng 5,0 kb sau khi cắt bằng enzyme MssI đã tích hợp thành công vào vùng promoter AOX1 trong hệ gen của Pichia pastoris X33. Phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại chính xác phân đoạn 1378 bp ở tất cả 8 thể biến nạp được chọn ngẫu nhiên.
3. Mức độ biểu hiện enzyme vượt trội: Đánh giá hoạt tính trên vi đĩa 24 giếng cho thấy các thể biến nạp mang gen cải biến sinh tổng hợp phytase ngoại bào mạnh mẽ. Điển hình, thể biến nạp X33.AAS5 đạt hoạt tính 35,95 IU/ml, cao gấp hàng trăm lần so với đối chứng âm mang chủng nấm men gốc (0,01 IU/ml). Quá trình cô đặc bằng màng lọc Viva Flow 200 kích thước 5 kDa giúp thu hồi phân tử enzyme phytase có khối lượng phân tử trong khoảng 45 kDa đến 53 kDa.
4. Nâng cao rõ rệt khả năng hồi tính nhiệt: Sau khi xử lý nhiệt ở dải nhiệt độ 70°C đến 80°C trong thời gian 10 đến 30 phút, enzyme phytase cải biến duy trì hoạt tính còn lại từ 62% đến 80%, vượt trội hơn mức suy giảm sâu của enzyme tự nhiên chưa qua đột biến, đồng thời duy trì dải hoạt động tối ưu ở pH 2,5 và 5,0.

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng khả năng chịu nhiệt và hồi tính của phytase tái tổ hợp được giải thích rõ nét thông qua mô hình cấu trúc không gian 3 chiều:

• Sự hình thành mạng lưới liên kết hydro: Việc thay thế Alanine 58 bằng Glutamic acid và Proline 65 bằng Serine tại vùng thòng lọng ngoài miền α/β đã thiết lập mạng lưới gồm 12 liên kết hydro mới (thay vì chỉ 3 liên kết như ở enzyme gốc). Cấu trúc này hoạt động như một điểm neo nhiệt động học, giữ cho khung phân tử không bị duỗi xoắn hoàn toàn khi tiếp xúc với nhiệt độ cao.
• Tương tác ion của cầu muối: Hai đột biến Q191R và T271R đưa các gốc Arginine tích điện dương vào cấu trúc, tương tác trực tiếp với gốc Aspartate tích điện âm tại vị trí 161 và 244. Sự kết hợp này tạo nên cấu trúc hộp gắn mũ ở đầu C của các chuỗi xoắn α, gia cố sự liên kết giữa miền α lớn và miền α/β nhỏ. Khi nhiệt độ hạ từ 80°C về nhiệt độ môi trường, các cầu muối và liên kết hydro định hướng cho phân tử protein tự cuộn gập trở lại cấu hình chức năng chính xác.

Dữ liệu thực nghiệm về mối tương quan giữa hoạt tính enzyme còn lại và nhiệt độ biến tính có thể được biểu diễn trực quan qua biểu đồ đường suy giảm nhiệt độ (thermal inactivation curve), so sánh trực tiếp giữa phytase đột biến phyA-AAS5 và phytase gốc phyA-P12. Kết quả khẳng định cấu trúc đột biến vừa giải quyết triệt để điểm yếu kém bền nhiệt của Aspergillus niger, vừa khắc phục được nhược điểm hoạt động ở pH kém tối ưu của Aspergillus fumigatus.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm của luận văn, 4 giải pháp ứng dụng và định hướng phát triển công nghệ được đề xuất:

1. Tối ưu hóa quy trình lên men mẻ bổ sung (Fed-batch) trên quy mô pilot: Thiết lập hệ thống kiểm soát tự động nồng độ oxy hòa tan và tốc độ cấp cơ chất methanol trên nồi lên men dung tích 10 lít đến 50 lít. Mục tiêu đạt mật độ tế bào nấm men cao và nâng hoạt tính phytase ngoại bào vượt ngưỡng 1000 IU/ml trong chu kỳ lên men 96 giờ. Chủ thể thực hiện: Nhóm nghiên cứu công nghệ lên men và vi sinh vật công nghiệp, dự kiến hoàn thành trong 12 tháng.
2. Phát triển công nghệ sấy phun và vi bao bảo vệ enzyme: Ứng dụng kỹ thuật vi bao màng polymer sinh học kết hợp với chất mang chuyên dụng nhằm duy trì hoạt tính phytase bảo lưu trên 85% sau công đoạn ép viên thức ăn chăn nuôi ở nhiệt độ 80°C đến 85°C. Chủ thể thực hiện: Các kỹ sư công nghệ chế biến và viện nghiên cứu chuyên ngành, thời gian triển khai từ 6 đến 18 tháng.
3. Thực hiện khảo nghiệm in vivo trên vật nuôi: Tiến hành thử nghiệm lâm sàng bổ sung chế phẩm phytase tái tổ hợp vào khẩu phần ăn của lợn thịt và gà công nghiệp với quy mô đàn khoảng 500 đến 1000 cá thể. Đánh giá chỉ số tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), tỷ lệ khoáng hóa xương và mức độ cắt giảm phụ gia dicanxi phosphate từ 50% đến 100%. Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu dinh dưỡng động vật và trang trại chăn nuôi, thời gian thực hiện trong 2 năm.
4. Mô phỏng động lực học phân tử để tiếp tục cải biến protein: Áp dụng các phần mềm sinh học tính toán nhằm khảo sát thêm các vị trí axit amin bề mặt, hướng tới việc thiết kế các cầu disulfide nhân tạo giúp phytase có khả năng chịu nhiệt độ trên 90°C. Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm tin sinh học và kỹ nghệ protein, triển khai định kỳ hàng năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và thực tiễn cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Các nhà nghiên cứu và học viên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học thực nghiệm: Tiếp cận quy trình chuẩn mực về kỹ thuật gây đột biến định hướng Mega-PCR, phương pháp phân tích trình tự BioEdit, kỹ thuật tách dòng và biểu hiện gen ngoại lai trên nấm men Pichia pastoris.
• Kỹ sư công nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi: Nắm bắt các thông số hóa sinh quan trọng như độ bền nhiệt ở 70°C đến 80°C, dải pH hoạt động thích hợp từ 2,0 đến 5,5 của phytase tái tổ hợp để tính toán liều lượng phối trộn và tối ưu hóa quy trình ép viên công nghiệp.
• Các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và enzyme: Sử dụng các số liệu thực nghiệm về hệ thống lên men Pichia pastoris X33 và quy trình lọc màng tiếp tuyến Viva Flow 200 làm căn cứ xây dựng dây chuyền sản xuất phytase nội địa, thay thế nguồn enzyme nhập khẩu giá thành cao.
• Chuyên gia quản lý môi trường nông nghiệp: Khai thác dữ liệu về khả năng giải phóng phospho hữu cơ của enzyme nhằm xây dựng các mô hình dinh dưỡng chăn nuôi tuần hoàn, giảm thiểu ô nhiễm phospho và phát thải trong nước thải chăn nuôi.

Câu hỏi thường gặp

Axit phytic trong thức ăn chăn nuôi gây hại như thế nào đối với động vật dạ dày đơn? Axit phytic tạo phức không hòa tan với các khoáng chất như sắt, kẽm, canxi và ức chế các enzyme tiêu hóa nội sinh như pepsin, trypsin. Do động vật dạ dày đơn thiếu phytase, khoảng 65% đến 80% phospho trong thực vật bị thải ra ngoài, gây lãng phí dinh dưỡng và làm ô nhiễm môi trường nước nghiêm trọng.

Phương pháp Mega-PCR có ưu điểm gì trong việc cải biến gen enzyme? Mega-PCR cho phép tạo ra các mồi kích thước lớn chứa nhiều đột biến điểm đồng thời mà không cần sử dụng các hóa chất gây đột biến ngẫu nhiên. Phương pháp này đảm bảo tính chính xác tuyệt đối tại các vị trí axit amin mong muốn (như A58E, P65S, Q191R, T271R) mà vẫn duy trì nguyên vẹn khung đọc mã của gen phyA.

Vì sao hệ thống nấm men Pichia pastoris được chọn để biểu hiện phytase thay cho vi khuẩn E. coli? Pichia pastoris là sinh vật nhân thực có khả năng cuộn gập protein phức tạp và thực hiện quá trình glycosyl hóa sau dịch mã. Hệ thống này sử dụng promoter AOX1 mạnh giúp tiết lượng lớn enzyme trực tiếp ra môi trường nuôi cấy, đạt hoạt tính trên 35 IU/ml mà không tạo thể vùi khó hòa tan như ở E. coli.

Cơ chế nào giúp phytase cải biến có khả năng hồi tính sau khi gia nhiệt ở 70°C đến 80°C? Đột biến A58E và P65S bổ sung mạng lưới 12 liên kết hydro tại vùng thòng lọng ngoài, trong khi Q191R và T271R tạo ra các cầu muối ion với gốc Aspartate. Các liên kết này giữ ổn định cấu trúc bậc hai và dẫn dắt chuỗi polypeptide tự hồi phục về cấu hình không gian nguyên vẹn sau khi làm nguội.

Việc sử dụng phytase tái tổ hợp mang lại hiệu quả kinh tế và môi trường ra sao? Bổ sung phytase giúp giải phóng phospho gắn kết tự nhiên trong hạt, cho phép cắt giảm 50% đến 100% lượng dicanxi phosphate bổ sung vào thức ăn. Đồng thời, giải pháp này giúp giảm trên 40% lượng phospho bài tiết qua phân, ngăn ngừa hiện tượng phú dưỡng hóa nguồn nước tại các vùng chăn nuôi tập trung.

Kết luận

• Luận văn đã thiết kế thành công quy trình gây đột biến định hướng Mega-PCR để thay thế chính xác 4 axit amin (A58E, P65S, Q191R, T271R) trên gen mã hóa phytase từ chủng nấm mốc bản địa Aspergillus niger CNTP 5131.
• Chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33.AAS5 biểu hiện enzyme phytase ngoại bào hiệu quả với hoạt tính đạt 35,95 IU/ml trên vi đĩa nuôi cấy.
• Enzyme cải biến sở hữu khả năng hồi tính xuất sắc, duy trì từ 62% đến 80% hoạt tính sinh học sau khi bị biến tính nhiệt ở 70°C đến 80°C trong 10 đến 30 phút, đồng thời giữ vững hoạt tính tối ưu tại pH axit dạ dày.
• Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để phát triển quy trình sản xuất enzyme phytase bền nhiệt trong nước ở quy mô công nghiệp từ 50 lít đến 1000 lít trong giai đoạn tới.
• Các đơn vị sản xuất thức ăn chăn nuôi và viện nghiên cứu công nghệ sinh học cần tăng cường liên kết nhằm sớm thương mại hóa chế phẩm phytase tái tổ hợp, hướng tới ngành nông nghiệp hiệu quả và bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu của thực vật. Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lƣợng phospho trong các loại ngũ cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải. Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn. Axit phytic có tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch tiêu hóa của động vật.

Enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phospho- hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của myo-inositol. Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ra ngoài, góp phần bảo vệ môi trƣờng. Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ nấm mốc Aspergillus niger.

niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với phytate cao, và bền với tác động của pepsin. niger có nhƣợc điểm là kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.

Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả năng hồi tính.

Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase, đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên K21-Sinh học thực nghiệm 1 Đặng Thị Kim Anh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ cứu. Trong số đó, phytase từ A.

niger đƣợc tách dòng và biểu hiện trên Pichia pastoris. Giống nhƣ các phytase tự nhiên khác từ A. niger, enzyme thu nhận đƣợc chƣa đảm bảo đƣợc tính bền nhiệt nhƣ mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao” nhằm cải thiện đặc tính công nghệ của enzyme tái tổ hợp.

Để đạt đƣợc mục tiêu trên, gen mã hóa phytase từ nấm mốc A. niger đƣợc biến đổi bằng Mega-PCR tạo 4 axit amin mới thay thế cho 4 axit amin trong cấu trúc protein nhằm tăng độ bền vững đồng thời duy trì các đặc tính cơ bản về hoạt tính và pH hoạt động của enzyme. K21-Sinh học thực nghiệm 2 Đặng Thị Kim Anh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Axit phytic và phytate Axit phytic lần đầu tiên đƣợc Hartig tìm thấy năm 1855 ở dạng hạt nhỏ trong hạt giống của một số loài thực vật và có kích thƣớc tƣơng đƣơng hạt tinh bột khoai tây.

Khi kiểm tra bằng phƣơng pháp thử iod, Hartig nhận thấy các hạt này không phải là tinh bột và chứa chất dinh dƣỡng dự trữ cho sự nảy mầm của hạt [27, 28]. Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy hạt phytic và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là carbon, phospho và các ion kim loại và không phải protein hay lipid. Chúng có tên là „phytin‟ do nguồn gốc từ thực vật và không đƣợc phát hiện thấy ở thịt hay trong các sản phẩm từ sữa. Winterstein, Schulze và Posternak đã chỉ ra rằng thủy phân phytin bằng axit sẽ giải phóng axit phosphoric và inositol [66].

Năm 1914, Anderson đã mô tả cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 – hexakis dihydrogen phosphate, đƣợc gọi là axit phytic [7] (Hình1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakisdihydrogen phosphate (axit phytic). Phytate là muối của axit phytic là dạng dự trữ phospho và khoáng chất chủ yếu của thực vật đặc biệt ở ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt có dầu. Chúng chiếm khoảng 75% tổng lƣợng phospho của hạt và thấp hơn ở các bộ phận khác của cây nhƣ rễ, củ, chồi, với hàm lƣợng chỉ khoảng 0.

Trong quá trình nảy mầm của hạt, phytate bị thủy phân tạo phospho vô cơ cùng với khoáng chất nhƣ canxi, magiê là những chất cảm ứng cho quá trình nảy mầm và phát triển của cây con. Điều này giải thích cho vai trò quan trọng của phytate trong quá trình chuyển hóa của thực vật. K21-Sinh học thực nghiệm 3 Đặng Thị Kim Anh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Với động vật, axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh nhờ khả năng liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại nhƣ Ca2+, Mg2+, Zn2+. Những liên kết này tạo phức hợp không hòa tan trong đƣờng tiêu hóa, dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [17, 47].

Trong số các kim loại, kẽm là nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hƣởng lớn nhất bởi axit phytic. Axit phytic bổ sung vào thức ăn có thể làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và giảm trọng lƣợng của chuột [48]. Axit phytic còn tƣơng tác với protein trong dải pH rộng để tạo thành phức hợp phytate-protein. Liên kết giữa protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của protein và do vậy làm giảm giá trị dinh dƣỡng của chúng.

Hơn nữa, ngoài liên kết với muối khoáng, protein, axit phytic còn tƣơng tác với các enzyme tiêu hoá nhƣ trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những enzyme này [20, 32, 55]. Enzyme phân giải phytate (phytase) Phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc tác phản ứng thủy phân myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate (phytate) thành những gốc phosphate đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol phosphate. Ở một số loài nấm, phytase có thể giải phóng myo-inositol tự do. Phân loại enzyme phytase Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành ba dạng bao gồm [75]: Dạng 1: EC 3.8 Tên đề xuất: 3-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-3-phosphohydrolase Tên khác: phytase, phytate-1-phosphatase, phytate-3-phosphatase, phytate-6-phosphatase Dạng 2: EC 3.26 Tên đề xuất: 4-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-4-phosphohydrolase K21-Sinh học thực nghiệm 4 Đặng Thị Kim Anh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Tên khác: phytase, 6-phytase, phytate-6-phosphatase Dạng 3: EC 3.72 Tên đề xuất: 5-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-5-phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-5-phosphatase Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn công.

Enzyme 3-phytase (EC 3.8) tấn công vào nhóm phosphate ở vị trí thứ 3 và 4-phytase (EC 3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 4; đây là hai dạng phytase điển hình của vi sinh vật. Enzyme 5-phytase (EC 3.72) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 5; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase: β-Propellar Phytase (BPPhy), Protein tyrosine phytase (PTPhy), Purple Phosphatase Acid (PAPhy) và Histidine Acid Phosphatase (HAPhy) [67]. Theo tính năng và cấu trúc, ngƣời ta còn chia phytase ra 4 nhóm nhƣ sau: (1) β- Propellar Phytase (BPPhy): hoạt động ở pH kiềm và cần ion Ca2+ cho khả năng xúc tác và bền nhiệt, sản phẩm cuối cùng là myo-inositol triphosphate (IP3); (2) Protein tyrosine phytase (PTPhy): hoạt động ở pH axit, chứa nhóm xúc tác cysteine, sản phẩm cuối cùng là inositol 2-monophosphate; (3) Purple Phosphatase Acid (PAPhy): chứa axit amin có gắn kim loại Fe2+ và Fe3+, Zn2+, Mg2+ hoặc Mn2+ ở trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác của enzyme này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ; (4) Histidine Acid Phosphatase (HAPhy): hoạt động ở pH thấp, chứa trình tự axit amin bảo thủ: RH[GN]xRx[PAS] ở đầu N và HD ở đầu C (Hình 1.

Các nhóm này khác nhau về cấu trúc phân và cơ chế xúc tác cho phép chúng sử dụng axit phytic làm K21-Sinh học thực nghiệm 5 Đặng Thị Kim Anh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ nguồn cơ chất trong các môi trƣờng khác nhau. Trong đó, phytase của Aspergillus niger và Aspergillus fumigatus thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất. Nguồn phytase Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ vi sinh vật, thực vật và động vật. Phytase từ vi sinh vật Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở nấm mốc, đặc biệt ở các loài thuộc chi Aspergillus.

Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất hơn 2000 chủng vi sinh vật để sản xuất phytase. Hầu hết các chủng sản sinh phytase nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó 28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và 1 chủng thuộc Mucor. Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về loài A. Những nhóm nghiên cứu khác nhƣ Howson và Davis (1983), Volfova và cs (1994) đã khẳng định rằng A.

niger là loài có khả năng sản sinh phytase ngoại bào tốt nhất [31, 65]. Một số phytase từ một số nấm men khác đã đƣợc phát hiện nhƣ: Pichia anomala [64], Saccharomyces cerevisiae [59]. Phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp., Bacillus subtilis, Klebsiella sp. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter còn phytase từ E.

coli lại là enzyme nội bào. Năm 2005, Cheng và CS đã mô tả cấu trúc phytase dạng β ở loài ƣa lạnh Shewanella oneidensis MR-1 nó có 30% peptide tƣơng đồng với trình tự phytase của Bacillus sp. Đặc biệt, với khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp phytase này có tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, khi nhiệt độ thƣờng thấp hơn 30°C [12]. Phytase từ thực vật Phytase đƣợc tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật.

Phytase từ phấn hoa lily hoạt động ở pH tối ƣu 8,0 và nhiệt độ tối ƣu 55 C [34].