ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus (S. aureus) hay còn gọi là tụ cầu vàng, được coi là một trong những tác nhân hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm khuẩn từ đơn giản đến phức tạp. Điều trị nhiễm khuẩn do S. aureus gặp rất nhiều khó khăn, không chỉ do vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh và sự đa dạng của các yếu tố độc lực, mà còn do sự tồn tại các kiểu hình dai dẳng cũng như khả năng bám dính và hình thành biofilm trên các bề mặt khác nhau của vi khuẩn [15].
Trong số nhiều loại nhiễm khuẩn có thể gây ra bởi S. aureus, các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm thường gây nên rất nhiều thách thức trong điều trị [35]. Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuẩn ở người, đặc biệt là những bệnh có biểu hiện dai dẳng hoặc tái phát [24]. Cuộc chiến chống lại biofilm là cuộc chiến khó khăn bởi tình trạng bởi tình trạng kém đáp ứng với kháng sinh của các vi khuẩn trong biofilm.
Vì vậy, việc tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm là điều rất quan trọng. Trong bối cảnh này, thực vật là nguồn cung cấp phong phú và tiềm năng [13]. aureus trên đĩa 96 giếng là một công cụ hiệu quả để sàng lọc và nghiên cứu các hoạt chất có khả năng kháng biofilm, với các lợi thế vượt trội về giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, cũng như nhiều điều kiện thí nghiệm có thể thực hiện ở cùng thời điểm. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc tìm ra được các hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm của S.
aureus có nguồn gốc từ thực vật ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tạo biofilm của Staphylococcus aureus trên đĩa 96 giếng và đánh giá khả năng kháng biofilm của một số cao dược liệu” với 03 mục tiêu như sau: 1. Khảo sát được một số môi trường phù hợp để nuôi cấy biofilm của S. Khảo sát được thời gian và điều kiện nuôi cấy biofilm của S. Đánh giá được khả năng kháng biofilm S.
aureus của một số cao chiết dược liệu. Tổng quan về Staphylococcus aureus 1. Giới thiệu về Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus lần đầu tiên được xác định vào năm 1884 bởi Anton Rosenbach, một bác sĩ phẫu thuật người Đức [27], [28]. aureus là một thành viên của chi Staphylococcus.
Các thuật ngữ Staphylococcus được đề xuất bởi Sir Alexander Ogston từ tiếng Hy Lạp (staphyle nghĩa là chùm nho) do sự sắp xếp đặc trưng của nó thành cụm [6], [27].1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus [42] Trái: hình ảnh trên kính hiển vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tử Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), S. aureus được xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [6]. aureus được phân biệt với các loài tụ cầu khác trên cơ sở sắc tố vàng của khuẩn lạc, kết quả dương tính của các phép thử coagulase, lên men đường mannitol và deoxyribonuclease [23]. Đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy S.
aureus là vi khuẩn Gram dương không di động, được đặc trưng bởi các cầu khuẩn riêng lẻ có đường kính từ 0,5 đến 1,5 µm, là vi khuẩn kỵ khí đa dạng [6]. Tụ cầu vàng S. aureus có thể chịu được nhiệt độ cao tới 60ºC trong vòng 30 phút và nồng độ muối cao tới 10% [9]. Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc đường kính 1- 2mm, nhẵn.
Sau 24 giờ ở 37ºC, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh. Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn [1]. Trên môi trường thạch manitol, tụ cầu vàng lên men manitol tạo ra một vùng màu vàng xung quanh khuẩn lạc [9]. Trên môi trường canh thang, tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu có thể lắng cặn [1].
Khả năng gây bệnh của S. aureus Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng. Vi khuẩn này gây bệnh cho những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau [1].
Nhiễm khuẩn da Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, các ổ áp xe. Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn. Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch [1].
Nhiễm khuẩn huyết Tụ cầu vàng là một trong những vi khuẩn thường liên quan đến gây nhiễm khuẩn huyết. Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết. Ðây là một nhiễm khuẩn rất nặng. Từ nhiễm khuẩn huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc, có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch.
Một số nhiễm khuẩn khu trú này trở thành viêm mạn tính như viêm xương [1]. Viêm phổi Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp. Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu.
Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm [1]. Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng. Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính.
Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải độc tố tụ cầu 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất điện giải nên có thể dẫn tới sốc. Ngộ độc thức ăn do S. aureus là một trong những ngộ độc thức ăn rất thường gặp ở Việt Nam [1].
Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu Thường rất hay gặp, nhất là đối với nhiễm khuẩn vết mổ, vết bỏng từ đó đẫn tới nhiễm khuẩn huyết. Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh. Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao [1]. 3 Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome) Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng rộp.
Bệnh này thường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu [1]. Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome) Hội chứng này thường gặp ở phụ nữ sử dụng bông gạc không sạch khi có kinh nguyệt hoặc những người bị nhiễm khuẩn vết thương [1]. Về mặt lâm sàng, một vấn đề chính liên quan đến S. aureus là mức độ kháng thuốc đáng kể đối với nhiều loại kháng sinh, gây phức tạp cho việc điều trị.
Kháng sinh bán tổng hợp methicillin được phát triển vào cuối những năm 1950, và S. aureus kháng methicillin (MRSA) được xác định trên lâm sàng vào năm 1960. Nhiễm khuẩn do các chủng S. aureus kháng methicillin có tỷ lệ tử vong cao hơn so với nhiễm khuẩn do các chủng nhạy cảm với methicillin.
Ngoài ra, chúng làm tăng thời gian nằm viện cũng như chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan [19]. Khái niệm biofilm Nhiều định nghĩa khác nhau đã được đề xuất để mô tả biofilm, nhưng nhìn chung, biofilm được định nghĩa là một cộng đồng vi sinh vật (VSV) gồm các tế bào nằm trong ma trận của các chất cao phân tử ngoại bào mà chúng đã tạo ra. Về cơ bản, ma trận này được cấu tạo từ polysaccharid, ADN ngoại bào (eDNA) và protein với cấu trúc sắp xếp, tỷ lệ phần trăm, số lượng phụ thuộc nhiều vào điều kiện hình thành [22], [30]. Các giai đoạn hình thành biofilm của S.
aureus Sự hình thành biofilm của S. aureus là một quá trình phức tạp có thể được chia thành ba giai đoạn chính: (i) gắn ban đầu, (ii) phát triển biofilm hoàn chỉnh, (iii) tách tế bào và hình thành biofilm mới. Ba giai đoạn này tạo một vòng khép kín, gắn liền với sự hình thành, tồn tại và phát tán các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm [30]. Giai đoạn gắn ban đầu: tụ cầu vàng S.
aureus có thể bám dính và tạo biofilm trên cả bề mặt sinh học và nhân tạo. Sự gắn kết với bề mặt được coi là giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển biofilm. Sự gắn kết của tế bào S. aureus với bề mặt xảy ra thông qua tương tác kỵ nước với bề mặt phi sinh học hoặc thông qua các protein bề mặt liên kết với các protein nền vật chủ (fibrinogen, fibronectin, vitronectin…) [30].2) Giai đoạn phát triển biofilm hoàn chỉnh: trong giai đoạn này các VSV sau khi bám dính sẽ phát triển bằng cách tăng sinh.
Ngoài ra, các tế bào tiết ra các chất cao phân tử bao gồm polysaccharid và protein. Các chất cao phân tử từ tế bào chết được cho là đóng góp vào ma trận biofilm. Đáng chú ý nhất trong số đó là protein và ADN, sau khi giải phóng khỏi tế bào chết được gọi là ADN ngoại bào (eDNA) [30].2) 4 Giai đoạn tách tế bào và hình thành biofilm mới: Sự tách rời, phá vỡ biofilm đi kèm với quá trình sản sinh các biofilm mới. Các tiểu phần vi khuẩn được tách ra có thể đến vị trí mới, bám dính và tái tạo một biofilm khác.
Giai đoạn này liên quan đến việc khởi phát các biến chứng của nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm, chẳng hạn như nhiễm khuẩn catheter, nhiễm khuẩn huyết [30].2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S. aureus [30] Theo một số tài liệu những năm gần đây, sự hình thành biofilm của S. aureus bao gồm 5 giai đoạn: 1) gắn, 2) nhân lên, 3) lan tỏa, 4) hoàn chỉnh và 5) phân tán [17], [26], [35]. Mô hình này mở rộng mô hình biofilm truyền thống, trong đó giai đoạn phát triển biofilm hoàn chỉnh được chia nhỏ làm 03 giai đoạn là nhân lên (multiplication), lan tỏa (exodus), và hoàn chỉnh (maturation).
Trong giai đoạn nhân lên, các tế bào bắt đầu phát triển, phân chia và tự sinh một ma trận bao gồm các protein và eDNA.