Trần thị minh thu nghiên cứu tạo biofilm của staphylococcus aureus trên đĩa 96 giếng và đánh giá khả năng kháng biofilm của một số cao dược liệu khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

Luận văn tốt nghiệp y tế nghiên cứu Trần thị minh thu nghiên cứu tạo biofilm của staphylococcus aureus trên đĩa 96 giếng và đánh giá, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Trần Thị Minh Thu
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Khắc Tiệp
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu tạo biofilm của Staphylococcus aureus và khả năng kháng của dược liệu
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN VỀ Staphylococcus aureus
• 2.1. Giới thiệu về Staphylococcus aureus
• 2.2. Đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy
• 2.3. Khả năng gây bệnh của S. aureus
• 2.4. Khái niệm biofilm
• 2.5. Các giai đoạn hình thành biofilm của S. aureus
• 2.6. Thành phần biofilm của S. aureus
• 2.7. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của S. aureus
• 2.8. Biofilm và các thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn
• 2.9. Một số mô hình biofilm và ứng dụng trong nghiên cứu
• 2.9.1. Mô hình biofilm in vitro
• 2.9.2. Mô hình biofilm in vivo
• 2.10. Cách đánh giá các chỉ tiêu thành phần của biofilm
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên liệu, thiết bị
• 3.1.1. Nguyên liệu và chủng giống
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Khảo sát một số môi trường phù hợp cho nuôi cấy biofilm của S. aureus
• 3.2.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tạo biofilm của S. aureus
• 3.2.3. Đánh giá tác dụng kháng biofilm của một số hoạt chất
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng
• 3.3.2. Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm của S. aureus trên đĩa 96 giếng
• 3.3.3. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu của biofilm
• 3.3.4. Phương pháp chuẩn bị các mẫu thử
• 3.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm của một số dược liệu
• 3.3.6. Phương pháp thống kê
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Khảo sát được một số môi trường phù hợp cho nuôi cấy biofilm của S. aureus
• 4.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tạo biofilm của S. aureus
• 4.3. Đánh giá tác dụng kháng biofilm của một số hoạt chất
• 4.4. Sàng lọc hoạt tính kháng biofilm của một số dược liệu ở Việt Nam
• 4.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao ổi (DHN10)
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biofilm của Staphylococcus aureus

Nghiên cứu về biofilm của Staphylococcus aureus (S. aureus) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học và sinh học. S. aureus là một trong những tác nhân gây bệnh chính, đặc biệt trong các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm. Biofilm là một cộng đồng vi sinh vật bám dính trên bề mặt, tạo ra một ma trận phức tạp giúp vi khuẩn tồn tại và phát triển. Việc hiểu rõ về cơ chế hình thành và tính chất của biofilm sẽ giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Đặc điểm của Staphylococcus aureus và biofilm

S. aureus là vi khuẩn Gram dương, có khả năng gây ra nhiều loại nhiễm khuẩn khác nhau. Biofilm của S. aureus được hình thành qua nhiều giai đoạn, từ gắn kết ban đầu đến phát triển và tách tế bào. Sự hình thành này không chỉ giúp vi khuẩn tồn tại mà còn làm tăng khả năng kháng thuốc.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu biofilm trong y học

Nghiên cứu về biofilm của S. aureus có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới. Các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm thường khó điều trị do khả năng kháng thuốc cao, vì vậy việc tìm ra các hoạt chất mới có khả năng tiêu diệt biofilm là rất cần thiết.

II. Thách thức trong điều trị nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus

Điều trị nhiễm khuẩn do S. aureus gặp nhiều khó khăn do sự kháng thuốc của vi khuẩn. S. aureus có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, đặc biệt là các chủng kháng methicillin (MRSA). Sự tồn tại của biofilm làm cho vi khuẩn trở nên khó tiếp cận hơn với các tác nhân điều trị, dẫn đến tỷ lệ điều trị thất bại cao.

2.1. Khó khăn trong việc phát hiện và điều trị nhiễm khuẩn

Nhiễm khuẩn do S. aureus thường không dễ phát hiện, đặc biệt là trong các trường hợp có biofilm. Việc điều trị trở nên phức tạp khi vi khuẩn đã hình thành biofilm, làm giảm hiệu quả của các loại kháng sinh thông thường.

2.2. Tác động của kháng sinh đến biofilm

Kháng sinh thường không hiệu quả trong việc tiêu diệt vi khuẩn trong biofilm. Các nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn trong biofilm có khả năng kháng thuốc cao hơn từ 10 đến 1000 lần so với vi khuẩn tự do.

III. Phương pháp nghiên cứu biofilm của Staphylococcus aureus

Nghiên cứu biofilm của S. aureus thường sử dụng các phương pháp in vitro để đánh giá khả năng hình thành và kháng của biofilm. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, sử dụng các môi trường khác nhau để khảo sát sự hình thành biofilm.

3.1. Mô hình nuôi cấy biofilm in vitro

Mô hình nuôi cấy biofilm in vitro cho phép nghiên cứu sự hình thành và phát triển của S. aureus trong điều kiện kiểm soát. Phương pháp này giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm và khả năng kháng thuốc.

3.2. Đánh giá khả năng kháng của dược liệu

Nghiên cứu cũng tập trung vào việc đánh giá khả năng kháng của một số dược liệu đối với biofilm của S. aureus. Các dược liệu này có thể cung cấp các hoạt chất mới có khả năng tiêu diệt biofilm, mở ra hướng đi mới trong điều trị nhiễm khuẩn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu biofilm trong điều trị

Nghiên cứu về biofilm của S. aureus không chỉ có giá trị lý thuyết mà còn có ứng dụng thực tiễn trong điều trị nhiễm khuẩn. Việc phát hiện và phát triển các hoạt chất có khả năng tiêu diệt biofilm sẽ giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm tỷ lệ tái phát nhiễm khuẩn.

4.1. Các dược liệu có khả năng kháng biofilm

Một số dược liệu truyền thống đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng kháng biofilm của S. aureus. Việc sử dụng các dược liệu này có thể là một giải pháp hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn.

4.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng

Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng các hoạt chất từ dược liệu có thể làm giảm đáng kể sự hình thành biofilm và tăng cường hiệu quả điều trị. Điều này mở ra cơ hội mới cho việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu biofilm

Nghiên cứu về biofilm của S. aureus đang mở ra nhiều hướng đi mới trong việc điều trị nhiễm khuẩn. Việc tìm kiếm và phát triển các hoạt chất mới có khả năng tiêu diệt biofilm là rất cần thiết. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp hiệu quả hơn trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn do S. aureus.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để tiêu diệt biofilm và cải thiện hiệu quả điều trị. Việc kết hợp giữa các dược liệu và kháng sinh có thể là một hướng đi tiềm năng.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu liên ngành

Nghiên cứu về biofilm cần sự hợp tác giữa các lĩnh vực khác nhau như vi sinh vật học, dược học và y học. Sự kết hợp này sẽ giúp phát triển các giải pháp toàn diện hơn trong việc điều trị nhiễm khuẩn.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), đặc biệt là các chủng kháng methicillin (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus - MRSA), là nguyên nhân hàng đầu gây ra các ca nhiễm trùng nghiêm trọng tại bệnh viện và cộng đồng. Theo thống kê từ Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ (NIH) và Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC), khoảng 65% đến 80% các trường hợp nhiễm trùng mạn tính và tái phát ở người có liên quan trực tiếp đến sự hình thành màng sinh học (biofilm). Khi ở trạng thái biofilm, vi khuẩn tự bao bọc trong chất nền ngoại bào polymer tự sinh (EPS - Extracellular Polymeric Substances), làm tăng khả năng chống chịu với các dòng kháng sinh thông thường lên gấp 10 đến 1.000 lần so với dạng tế bào phù du (planktonic cells).

Thực trạng bế tắc trong điều trị kháng sinh đòi hỏi các hướng tiếp cận đột phá. Nguồn hoạt chất tự nhiên từ hệ thực vật phong phú tại Việt Nam mang lại tiềm năng to lớn để sàng lọc các phân tử có hoạt tính kháng và phá hủy biofilm. Đề tài "Nghiên cứu tạo biofilm của Staphylococcus aureus trên đĩa 96 giếng và đánh giá khả năng kháng biofilm của một số cao dược liệu" được thực hiện nhằm xây dựng một quy trình chuẩn hóa in vitro sàng lọc hoạt tính kháng biofilm quy mô lớn, từ đó tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng từ thảo dược bản địa.

+------------------------------------------------------------------------------------+
|                         KHUNG MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU DỰ ÁN                            |
+------------------------------------------------------------------------------------+
| [1] Khảo sát môi trường vi sinh phù hợp để nuôi cấy biofilm S. aureus trên đĩa 96  |
| [2] Chuẩn hóa thời gian và điều kiện động học hình thành biofilm hoàn chỉnh (24h)  |
| [3] Sàng lọc 300 mẫu cao chiết và đánh giá chi tiết cơ chế hiệp đồng diệt biofilm   |
+------------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp tiếp cận dựa trên việc tích hợp song song các kỹ thuật phân tích hóa sinh: nhuộm tím tinh thể (Crystal Violet - CV) để đo tổng sinh khối, đo huỳnh quang Resorufin (RF) từ phản ứng khử Resazurin để đánh giá hoạt tính chuyển hóa của vi khuẩn sống, và cấy đếm định lượng khuẩn lạc (CFU/ml). Nghiên cứu giới hạn trong phạm vi khảo sát chủng chuẩn S. aureus MRSA ATCC 33591 trên bề mặt vi đĩa polystyrene 96 giếng, kết hợp đối chiếu hiệu lực phối đồng vận với hai kháng sinh lâm sàng chuẩn: Moxifloxacin (1,5 mg/L) và Vancomycin (20 mg/L).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các kỹ thuật nghiên cứu biofilm in vitro hiện nay đối mặt với nhiều rào cản về tính tái lập, độ nhạy và chi phí thực nghiệm:

Phương pháp đánh giá	Ưu điểm	Nhược điểm	Chi phí & Độ phức tạp
Nhuộm Crystal Violet (CV)	Nhanh, rẻ, đo được toàn bộ cấu trúc nền EPS	Không phân biệt được vi khuẩn sống hay đã chết	Thấp / Đơn giản
Chuyển hóa Resazurin (RF)	Đánh giá trực tiếp khả năng sống (viability), thông lượng cao	Nhạy cảm với điều kiện oxy hóa - khử	Trung bình / Tự động hóa cao
Cấy đếm đĩa thạch (CFU/ml)	Tiêu chuẩn vàng, định lượng tế bào sống chính xác	Tốn công sức, tốn thời gian (24-48h), thông lượng thấp	Thấp / Thủ công
Kính hiển vi đồng tiêu (CLSM)	Hình ảnh 3D trực quan, độ phân giải cao	Rất đắt, thời gian xử lý mẫu lâu, không khả thi cho sàng lọc	Rất cao / Phức tạp

Dựa trên phân tích khoảng trống kỹ thuật, dự án đã áp dụng khung phân loại yêu cầu MoSCoW để xây dựng hệ thống sàng lọc tối ưu:

• Must have (Bắt buộc): Mô hình đĩa 96 giếng có tính lặp lại cao; môi trường nuôi cấy kích thích tối đa biểu hiện operon ica tổng hợp PNAG; phân biệt được giữa việc làm giảm sinh khối và diệt khuẩn nội biofilm.
• Should have (Nên có): Quy trình đọc huỳnh quang Resorufin tự động hóa; đo lường hiệp đồng tác dụng với kháng sinh tiêu chuẩn.
• Could have (Có thể có): Phân lập và làm giàu phân đoạn chiết bằng sắc ký cột silica gel.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật nhiễm khuẩn catheter hay kính hiển vi đồng tiêu laser quét (CLSM).

Thiết kế hệ thống

Hệ sinh thái kỹ thuật và nền tảng thiết bị được chuẩn hóa phục vụ quy trình đánh giá thông lượng cao (High-Throughput Screening - HTS):

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                  SƠ ĐỒ HỆ THỐNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG BIOFILM                  |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  [Chuẩn hóa vi khuẩn S. aureus MRSA ATCC 33591 (OD600 = 0,005 ~ 10^7 CFU/mL)]     |
|       [Nuôi cấy tạo Biofilm hoàn chỉnh 24h trong môi trường TGN (37°C)]          |
|   [Xử lý: Cao chiết đơn lẻ (100 mg/L) OR Phối hợp Moxifloxacin/Vancomycin (24h)]  |
|  [Phân tích Sinh khối]                                   [Định lượng Tế bào sống] |
|  - Cố định nhiệt (60°C, 2h)                               - Resazurin 10 mg/L     |
|  - Nhuộm Crystal Violet 0,05%                             - Huỳnh quang Ex560/Em590|
|  - Đo OD570 nm (Varioskan Lux)                            - Cấy đếm thạch TSA CFU |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

• Stack hóa chất & Chủng giống: S. aureus ATCC 33591 (MRSA), môi trường Tryptic Soy Broth (TSB - Merck), Brain Heart Infusion (BHI - Merck), Mueller-Hinton Broth (MHB - Merck), Natri Resazurin (Sigma-Aldrich), Crystal Violet (Sigma-Aldrich), Dimethyl Sulfoxide (DMSO - Fisher Chemical), Moxifloxacin (Sigma-Aldrich), Vancomycin (Sigma-Aldrich).
• Hệ thống thiết bị: Máy đọc vi đĩa đa năng huỳnh quang - UV Thermo Scientific Varioskan Lux, máy quang phổ UV-VIS Hitachi U5100, tủ ủ vi sinh Memmert, tủ cấy an toàn sinh học BioAir.
• Tiêu chuẩn an toàn sinh học: Cấp độ vi sinh BSL-2, vô trùng tuyệt đối bằng đèn UV và nhiệt ẩm 115°C/20 phút.

Methodology

Quy trình phát triển nghiên cứu áp dụng mô hình lặp có kiểm soát (Iterative Waterfall):

1. Pha 1 (Milestone 1): Khảo sát môi trường và dinh dưỡng vi lượng (TSB, BHI, MHB; biến thiên nồng độ Glucose 1% và NaCl 2%).
2. Pha 2 (Milestone 2): Đánh giá động học hình thành biofilm qua các mốc 6h, 24h, 48h, 72h (đối chiếu giữa chế độ thay môi trường mỗi 24h vs. không thay môi trường).
3. Pha 3 (Milestone 3): Sàng lọc sơ cấp 300 mẫu cao chiết thảo dược; kiểm chuẩn thống kê ANOVA đơn biến (One-way ANOVA) kết hợp kiểm định Dunnett trên phần mềm GraphPad Prism 4 ($p < 0,05$).

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình chuẩn bị và xử lý dữ liệu sàng lọc biofilm được chuẩn hóa thông qua thuật toán tự động hóa xử lý tín hiệu huỳnh quang và độ hấp thụ quang phổ:

import numpy as np

def calculate_biofilm_inhibition(rf_treated, rf_control, cv_treated, cv_control, cfu_treated, cfu_control):
    """
    Thuật toán tính toán % ức chế chuyển hóa tế bào sống và độ suy giảm log10 CFU
    RF: Tín hiệu huỳnh quang Resorufin (Ex: 560nm, Em: 590nm)
    CV: Độ hấp thụ Crystal Violet (OD: 570nm)
    CFU: Mật độ vi khuẩn (CFU/mL)
    """
    # 1. Tính % chuyển hóa trao đổi chất còn lại (Viability %)
    metabolic_viability_pct = (np.mean(rf_treated) / np.mean(rf_control)) * 100.0
    
    # 2. Tính % tổng sinh khối còn lại (Biomass %)
    biomass_pct = (np.mean(cv_treated) / np.mean(cv_control)) * 100.0
    
    # 3. Tính độ giảm log10 CFU (Log Reduction)
    log_reduction = np.log10(np.mean(cfu_control)) - np.log10(np.mean(cfu_treated))
    
    # Tiêu chí chọn mẫu tiềm năng: Giảm > 25% giá trị RF so với chứng dương
    is_hit = (100.0 - metabolic_viability_pct) >= 25.0
    
    return {
        "metabolic_activity_pct": metabolic_viability_pct,
        "biomass_pct": biomass_pct,
        "log_kill": log_reduction,
        "hit_status": is_hit
    }

Testing và validation

1. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy (Media Optimization)

Khảo sát các hệ môi trường nền TSB, BHI, MHB với các chất bổ sung cho thấy:

• Môi trường TSB bổ sung đồng thời 2% NaCl và 1% Glucose (môi trường TGN) kích thích mạnh nhất sự hình thành biofilm bền vững. Sự kết hợp này kích hoạt mạnh mẽ cụm gen icaADBC, thúc đẩy tổng hợp chất kết dính liên bào Poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine (PNAG/PIA).
• Tại môi trường TGN, mật độ vi khuẩn đạt đỉnh $8,58 \pm 0,39 \log_{10}\text{ CFU/ml}$, đồng thời mật độ quang của sinh khối nhuộm CV đạt giá trị cao nhất và có độ lặp lại vượt trội giữa các giếng.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|           ĐỘNG HỌC PHÁT TRIỂN BIOFILM S. AUREUS THEO THỜI GIAN TRONG TGN          |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| Thời gian (h) | Chế độ thay môi trường   | Mật độ vi khuẩn (log10 CFU/ml) | Trạng thái biofilm |
| :---          | :---                     | :---                           | :---               |
| 6h            | Không áp dụng            | 6,21 ± 0,15                    | Bám dính ban đầu   |
| 24h           | Đạt đỉnh sinh trưởng     | 8,58 ± 0,39                    | Hoàn chỉnh (Chín)  |
| 48h           | Thay môi trường mỗi 24h  | 8,45 ± 0,22                    | Ổn định bền vững   |
| 48h           | Không thay môi trường    | 7,32 ± 0,31 (giảm p<0,05)       | Bắt đầu thoái hóa  |
| 72h           | Thay môi trường mỗi 24h  | 8,12 ± 0,28                    | Duy trì ổn định    |
| 72h           | Không thay môi trường    | 5,84 ± 0,45 (giảm p<0,01)       | Phân rã tự nhiên   |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Kết luận: Điểm rơi thực nghiệm chuẩn xác nhất là biofilm 24 giờ, với thao tác thay mới môi trường khi đưa mẫu thử vào đánh giá.

Kết quả đạt được

1. Sàng lọc thông lượng cao 300 mẫu cao chiết dược liệu

• Tỷ lệ trúng đích (Hit rate): Xác định được 11 mẫu/300 mẫu (tỷ lệ 3,6%) có hoạt tính diệt S. aureus trong biofilm (giảm > 25% huỳnh quang RF so với chứng).
• Đơn trị liệu: Chỉ 5/11 mẫu thể hiện hoạt tính diệt khuẩn độc lập.
• Đồng trị liệu: Khi phối hợp với Moxifloxacin (1,5 mg/L) hoặc Vancomycin (20 mg/L), cả 11 mẫu đều thể hiện tác động tăng cường hoạt lực kháng sinh rõ rệt. Mẫu nổi bật nhất là cao lá ổi (DHN10).

2. Đánh giá chuyên sâu cao chiết lá ổi (DHN10) và các phân đoạn

Phân đoạn cao tổng methanol lá ổi bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$ - DCM), ethyl acetat (EtOAc), và nước ($\text{H}_2\text{O}$).

+------------------------------------------------------------------------------------+
|         HOẠT TÍNH KHÁNG BIOFILM CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CAO LÁ ỔI (DHN10) TRÊN TGN       |
+------------------------------------------------------------------------------------+
| Phân đoạn mẫu      | % Huỳnh quang RF (Đơn) | % RF (+Moxifloxacin) | Mật độ (log10 CFU/ml) |
| :---               | :---                  | :---                 | :---                  |
| Mẫu chứng (TGN)    | 100,0 ± 5,3%          | 98,2 ± 13,2%         | 8,58 ± 0,39           |
| Cao tổng DHN10     | 58,3 ± 7,3%           | 49,7 ± 0,1%          | 8,09 ± 0,33           |
| Phân đoạn H2O      | 62,8 ± 5,4%           | 60,3 ± 20,5%         | 8,12 ± 0,29           |
| Phân đoạn EtOAc    | 72,3 ± 1,4%           | 111,1 ± 4,9%         | 8,39 ± 0,06           |
| Phân đoạn n-hexan  | 28,0 ± 1,5%           | 26,7 ± 9,9%          | 7,95 ± 0,43           |
| Phân đoạn DCM      | 29,7 ± 2,6%           | 23,8 ± 0,3%          | 7,48 ± 0,01 (p<0,05)  |
+------------------------------------------------------------------------------------+

3. Phân tách sắc ký cột phân đoạn Dicloromethan (DCM)

Phân đoạn DCM được đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi cloroform 100%, thu được 4 phân đoạn nhỏ (1.1, 1.2, 1.3, 1.4):

Phân đoạn nhỏ DCM	% RF dạng đơn	% RF (+Mxf 1,5 mg/L)	Mật độ CFU (+Mxf)	Độ suy giảm CFU (+Mxf)
Chứng (TGN)	100,0 ± 10,2%	93,1 ± 13,6%	7,79 ± 0,04	Quy chuẩn đối chứng
Phân đoạn 1.1	33,6 ± 4,1%	18,4 ± 0,7%	5,03 ± 0,48	Giảm 3,14 $\log_{10}$ CFU/ml (99,9%)
Phân đoạn 1.2	40,8 ± 2,6%	19,7 ± 0,8%	7,10 ± 0,56	Giảm 0,69 $\log_{10}$ CFU/ml
Phân đoạn 1.3	27,7 ± 3,0%	19,9 ± 5,0%	4,40 ± 0,94	Giảm 3,77 $\log_{10}$ CFU/ml (>99,9%)
Phân đoạn 1.4	113,3 ± 5,9%	86,5 ± 10,2%	7,85 ± 0,12	Không có hoạt tính

---

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những giá trị khoa học và thực tiễn nổi bật trong lĩnh vực công nghệ sinh dược phẩm:

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                       ĐỐI CHIẾU VỚI CÁC CÔNG TRÌNH TIỀN NHIỆM                     |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| Đặc tính kỹ thuật | Nghiên cứu này (2022) | Quave et al. (2012) | Lan Thanh et al. (2020) |
| :---              | :---                  | :---                | :---                    |
| Đối tượng diệt    | Biofilm chín (24h)    | Ngăn bám dính ban đầu| Ngăn bám dính ban đầu   |
| Dược liệu khảo sát| Lá ổi (*P. guajava*)  | Rễ cây *R. ulmifolius*| Trâm tròn (*S. glomeratum*)|
| Mức độ diệt CFU   | > 3 log10 (>99,9%)    | < 1,5 log10         | Không đo lường CFU     |
| Cơ chế tác động   | Diệt trực tiếp vi khuẩn| Ức chế tổng hợp EPS | Phá hủy màng tế bào     |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

• Đột phá về hiệu lực diệt khuẩn nội màng: Rất hiếm nghiên cứu in vitro đạt được mức độ tiêu diệt vi khuẩn giảm trên $3 \log_{10}\text{ CFU/ml}$ trong màng biofilm hoàn chỉnh khi kết hợp với fluoroquinolone ở nồng độ điều trị lâm sàng ($1,5\text{ mg/L}$). Phân đoạn 1.3 đã đạt mức giảm kỷ lục $3,77 \log_{10}\text{ CFU/ml}$.
• Cơ chế tác động chuyên biệt: Dữ liệu nhuộm CV cho thấy các phân đoạn không làm suy giảm tổng sinh khối EPS (CV% không đổi), nhưng dữ liệu RF và CFU chứng minh vi khuẩn bên trong đã bị tiêu diệt gần như hoàn toàn. Điều này khẳng định hoạt chất đóng vai trò như một chất dẫn đường (permeabilizer), tăng cường tính thấm của kháng sinh vào sâu bên trong lõi biofilm.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

• Phát triển thuốc phối hợp kháng khuẩn (Adjuvant Therapy): Hoạt chất từ phân đoạn DCM lá ổi có tiềm năng bào chế thành dung dịch rửa vết thương mạn tính (loét bàn chân đái tháo đường, vết loét tì đè) hoặc dung dịch khóa ống thông (catheter lock solution) nhằm triệt phá ổ vi khuẩn ẩn náu.
• Lớp phủ bề mặt thiết bị y tế (Medical Device Coatings): Ứng dụng trong công nghệ phủ bề mặt vật liệu cấy ghép (implant titan, stent, van tim nhân tạo) nhằm ngăn ngừa sự dung nạp và bám dính của vi khuẩn MRSA.
• Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit Analysis): Chi phí nguyên liệu thô từ lá ổi tại Việt Nam cực kỳ thấp; quy trình chiết xuất bằng dung môi hữu cơ phân cực DCM có hiệu suất thu hồi cao và khả năng mở rộng (scale-up) công nghiệp với chi phí R&D tối ưu.

+------------------------------------------------------------------------------------+
|                    LỘ TRÌNH TRIỂN KHAI PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM                         |
+------------------------------------------------------------------------------------+
| Giai đoạn 1 (0-6 tháng)   : Tinh sạch và xác định cấu trúc phân tử (NMR, LC-MS/MS) |
| Giai đoạn 2 (6-18 tháng)  : Thử nghiệm độc tính tế bào & mô hình động vật in vivo  |
| Giai đoạn 3 (18-36 tháng) : Bào chế thuốc mỡ/gel bôi ngoài da & thử nghiệm tiền lâm |
+------------------------------------------------------------------------------------+

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật: Nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ phân đoạn nhỏ sắc ký cột, chưa phân lập và giải mã định danh cấu trúc tinh khiết của hợp chất đơn lẻ (chưa có phổ NMR, khối phổ MS).
• Mô hình thực nghiệm: Đánh giá in vitro trên đĩa nhựa polystyrene tĩnh chưa mô phỏng được điều kiện dòng chảy sinh lý (shear stress) trong lòng mạch máu cũng như tương tác với hệ thống miễn dịch của vật chủ.
• Hướng nghiên cứu tiếp nối:
  1. Tách chiết các chất tinh khiết từ phân đoạn 1.1 và 1.3 của cao lá ổi để xác định hoạt chất chính.
  2. Đánh giá phổ kháng biofilm trên các chủng lâm sàng đa kháng khác (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Candida albicans).
  3. Thử nghiệm trên mô hình cấy catheter màng bụng ở động vật (chuột/thỏ).

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên cao học Dược/Sinh học: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chuẩn hóa, phương pháp tiếp cận đa chỉ tiêu (CV + RF + CFU) trong đánh giá hoạt tính sinh học.
• Nhà nghiên cứu Vi sinh & Dược lý: Sở hữu bộ dữ liệu sàng lọc định lượng 300 mẫu dược liệu, làm cơ sở dữ liệu mở rộng cho các nghiên cứu chống kháng thuốc.
• Doanh nghiệp Dược phẩm & Thiết bị Y tế: Rút ngắn thời gian R&D thuốc mới; tiếp cận nguồn nguyên liệu bản địa giá rẻ để phát triển các sản phẩm chăm sóc vết thương kháng biofilm thế hệ mới.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai quy trình sàng lọc này là gì? Hệ thống cần trang bị máy đọc vi đĩa huỳnh quang đa năng (hỗ trợ kính lọc hoặc đơn sắc Ex 560nm / Em 590nm, UV 570nm), phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 2 (BSL-2) và nguồn chủng chuẩn S. aureus ATCC 33591 được lưu giữ ở -80°C.

2. Tại sao lại chọn môi trường TGN (TSB + 2% NaCl + 1% Glucose) thay vì TSB nguyên bản? Glucose cung cấp tiền chất tổng hợp khung polysaccharide PNAG, trong khi NaCl nồng độ 2% tạo áp lực thẩm thấu kích hoạt operon ica, giúp biofilm hình thành dày đặc, ổn định và có độ lặp lại cao nhất giữa các giếng thí nghiệm.

3. Làm thế nào để phân biệt giữa việc ức chế hình thành biofilm và tiêu diệt biofilm đã trưởng thành? Ức chế hình thành là cho chất thử tiếp xúc cùng lúc khi cấy vi khuẩn (giai đoạn bám dính). Tiêu diệt biofilm trưởng thành (nghiên cứu này thực hiện) là nuôi vi khuẩn tạo màng hoàn chỉnh sau 24h, rửa trôi tế bào tự do rồi mới ủ với chất thử trong 24h tiếp theo.

4. Tại sao phân đoạn 1.3 không làm giảm tổng sinh khối (CV) nhưng lại diệt khuẩn tới 99,9% (CFU)? Thuốc nhuộm Crystal Violet bắt màu cả tế bào sống, tế bào chết và chất nền EPS. Phân đoạn 1.3 thâm nhập tiêu diệt vi khuẩn bên trong (giảm CFU và tín hiệu hô hấp RF) mà không phá vỡ khung giàn giáo polysaccharide ngoại bào.

5. Chi phí và khả năng mở rộng quy trình chiết xuất cao lá ổi như thế nào? Lá ổi (Psidium guajava) là nguồn phụ phẩm nông nghiệp dồi dào, giá thành gần như bằng 0. Quy trình chiết phân đoạn bằng dung môi DCM và sắc ký silica gel sử dụng công nghệ phổ biến, hoàn toàn khả thi để nâng quy mô pilot trong sản xuất dược liệu.

---

Kết luận

Công trình đã thiết lập thành công quy trình chuẩn hóa nuôi cấy và định lượng biofilm của Staphylococcus aureus trên đĩa 96 giếng với môi trường TGN trong 24 giờ. Từ 300 mẫu cao chiết dược liệu Việt Nam, nghiên cứu đã phát hiện 11 mẫu có hoạt tính kháng biofilm tiềm năng. Đáng chú ý nhất, phân đoạn Dicloromethan từ cao lá ổi và các phân đoạn nhỏ 1.1, 1.3 khi kết hợp cùng Moxifloxacin đã chứng minh khả năng tiêu diệt vi khuẩn trong biofilm vượt trội lên tới $3,77 \log_{10}\text{ CFU/ml}$ (triệt tiêu > 99,9% quần thể vi khuẩn). Đây là bằng chứng khoa học vững chắc mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp phối hợp từ thảo dược Việt Nam nhằm giải quyết cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus (S. aureus) hay còn gọi là tụ cầu vàng, được coi là một trong những tác nhân hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm khuẩn từ đơn giản đến phức tạp. Điều trị nhiễm khuẩn do S. aureus gặp rất nhiều khó khăn, không chỉ do vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh và sự đa dạng của các yếu tố độc lực, mà còn do sự tồn tại các kiểu hình dai dẳng cũng như khả năng bám dính và hình thành biofilm trên các bề mặt khác nhau của vi khuẩn [15].

Trong số nhiều loại nhiễm khuẩn có thể gây ra bởi S. aureus, các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm thường gây nên rất nhiều thách thức trong điều trị [35]. Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuẩn ở người, đặc biệt là những bệnh có biểu hiện dai dẳng hoặc tái phát [24]. Cuộc chiến chống lại biofilm là cuộc chiến khó khăn bởi tình trạng bởi tình trạng kém đáp ứng với kháng sinh của các vi khuẩn trong biofilm.

Vì vậy, việc tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm là điều rất quan trọng. Trong bối cảnh này, thực vật là nguồn cung cấp phong phú và tiềm năng [13]. aureus trên đĩa 96 giếng là một công cụ hiệu quả để sàng lọc và nghiên cứu các hoạt chất có khả năng kháng biofilm, với các lợi thế vượt trội về giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, cũng như nhiều điều kiện thí nghiệm có thể thực hiện ở cùng thời điểm. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc tìm ra được các hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm của S.

aureus có nguồn gốc từ thực vật ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tạo biofilm của Staphylococcus aureus trên đĩa 96 giếng và đánh giá khả năng kháng biofilm của một số cao dược liệu” với 03 mục tiêu như sau: 1. Khảo sát được một số môi trường phù hợp để nuôi cấy biofilm của S. Khảo sát được thời gian và điều kiện nuôi cấy biofilm của S. Đánh giá được khả năng kháng biofilm S.

aureus của một số cao chiết dược liệu. Tổng quan về Staphylococcus aureus 1. Giới thiệu về Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus lần đầu tiên được xác định vào năm 1884 bởi Anton Rosenbach, một bác sĩ phẫu thuật người Đức [27], [28]. aureus là một thành viên của chi Staphylococcus.

Các thuật ngữ Staphylococcus được đề xuất bởi Sir Alexander Ogston từ tiếng Hy Lạp (staphyle nghĩa là chùm nho) do sự sắp xếp đặc trưng của nó thành cụm [6], [27].1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus [42] Trái: hình ảnh trên kính hiển vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tử Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), S. aureus được xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [6]. aureus được phân biệt với các loài tụ cầu khác trên cơ sở sắc tố vàng của khuẩn lạc, kết quả dương tính của các phép thử coagulase, lên men đường mannitol và deoxyribonuclease [23]. Đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy S.

aureus là vi khuẩn Gram dương không di động, được đặc trưng bởi các cầu khuẩn riêng lẻ có đường kính từ 0,5 đến 1,5 µm, là vi khuẩn kỵ khí đa dạng [6]. Tụ cầu vàng S. aureus có thể chịu được nhiệt độ cao tới 60ºC trong vòng 30 phút và nồng độ muối cao tới 10% [9]. Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc đường kính 1- 2mm, nhẵn.

Sau 24 giờ ở 37ºC, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh. Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn [1]. Trên môi trường thạch manitol, tụ cầu vàng lên men manitol tạo ra một vùng màu vàng xung quanh khuẩn lạc [9]. Trên môi trường canh thang, tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu có thể lắng cặn [1].

Khả năng gây bệnh của S. aureus Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng. Vi khuẩn này gây bệnh cho những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau [1].

Nhiễm khuẩn da Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, các ổ áp xe. Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn. Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch [1].

Nhiễm khuẩn huyết Tụ cầu vàng là một trong những vi khuẩn thường liên quan đến gây nhiễm khuẩn huyết. Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết. Ðây là một nhiễm khuẩn rất nặng. Từ nhiễm khuẩn huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc, có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch.

Một số nhiễm khuẩn khu trú này trở thành viêm mạn tính như viêm xương [1]. Viêm phổi Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp. Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu.

Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm [1]. Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng. Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính.

Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải độc tố tụ cầu 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất điện giải nên có thể dẫn tới sốc. Ngộ độc thức ăn do S. aureus là một trong những ngộ độc thức ăn rất thường gặp ở Việt Nam [1].

Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu Thường rất hay gặp, nhất là đối với nhiễm khuẩn vết mổ, vết bỏng từ đó đẫn tới nhiễm khuẩn huyết. Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh. Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao [1]. 3 Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome) Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng rộp.

Bệnh này thường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu [1]. Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome) Hội chứng này thường gặp ở phụ nữ sử dụng bông gạc không sạch khi có kinh nguyệt hoặc những người bị nhiễm khuẩn vết thương [1]. Về mặt lâm sàng, một vấn đề chính liên quan đến S. aureus là mức độ kháng thuốc đáng kể đối với nhiều loại kháng sinh, gây phức tạp cho việc điều trị.

Kháng sinh bán tổng hợp methicillin được phát triển vào cuối những năm 1950, và S. aureus kháng methicillin (MRSA) được xác định trên lâm sàng vào năm 1960. Nhiễm khuẩn do các chủng S. aureus kháng methicillin có tỷ lệ tử vong cao hơn so với nhiễm khuẩn do các chủng nhạy cảm với methicillin.

Ngoài ra, chúng làm tăng thời gian nằm viện cũng như chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan [19]. Khái niệm biofilm Nhiều định nghĩa khác nhau đã được đề xuất để mô tả biofilm, nhưng nhìn chung, biofilm được định nghĩa là một cộng đồng vi sinh vật (VSV) gồm các tế bào nằm trong ma trận của các chất cao phân tử ngoại bào mà chúng đã tạo ra. Về cơ bản, ma trận này được cấu tạo từ polysaccharid, ADN ngoại bào (eDNA) và protein với cấu trúc sắp xếp, tỷ lệ phần trăm, số lượng phụ thuộc nhiều vào điều kiện hình thành [22], [30]. Các giai đoạn hình thành biofilm của S.

aureus Sự hình thành biofilm của S. aureus là một quá trình phức tạp có thể được chia thành ba giai đoạn chính: (i) gắn ban đầu, (ii) phát triển biofilm hoàn chỉnh, (iii) tách tế bào và hình thành biofilm mới. Ba giai đoạn này tạo một vòng khép kín, gắn liền với sự hình thành, tồn tại và phát tán các nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm [30]. Giai đoạn gắn ban đầu: tụ cầu vàng S.

aureus có thể bám dính và tạo biofilm trên cả bề mặt sinh học và nhân tạo. Sự gắn kết với bề mặt được coi là giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển biofilm. Sự gắn kết của tế bào S. aureus với bề mặt xảy ra thông qua tương tác kỵ nước với bề mặt phi sinh học hoặc thông qua các protein bề mặt liên kết với các protein nền vật chủ (fibrinogen, fibronectin, vitronectin…) [30].2) Giai đoạn phát triển biofilm hoàn chỉnh: trong giai đoạn này các VSV sau khi bám dính sẽ phát triển bằng cách tăng sinh.

Ngoài ra, các tế bào tiết ra các chất cao phân tử bao gồm polysaccharid và protein. Các chất cao phân tử từ tế bào chết được cho là đóng góp vào ma trận biofilm. Đáng chú ý nhất trong số đó là protein và ADN, sau khi giải phóng khỏi tế bào chết được gọi là ADN ngoại bào (eDNA) [30].2) 4 Giai đoạn tách tế bào và hình thành biofilm mới: Sự tách rời, phá vỡ biofilm đi kèm với quá trình sản sinh các biofilm mới. Các tiểu phần vi khuẩn được tách ra có thể đến vị trí mới, bám dính và tái tạo một biofilm khác.

Giai đoạn này liên quan đến việc khởi phát các biến chứng của nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm, chẳng hạn như nhiễm khuẩn catheter, nhiễm khuẩn huyết [30].2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S. aureus [30] Theo một số tài liệu những năm gần đây, sự hình thành biofilm của S. aureus bao gồm 5 giai đoạn: 1) gắn, 2) nhân lên, 3) lan tỏa, 4) hoàn chỉnh và 5) phân tán [17], [26], [35]. Mô hình này mở rộng mô hình biofilm truyền thống, trong đó giai đoạn phát triển biofilm hoàn chỉnh được chia nhỏ làm 03 giai đoạn là nhân lên (multiplication), lan tỏa (exodus), và hoàn chỉnh (maturation).

Trong giai đoạn nhân lên, các tế bào bắt đầu phát triển, phân chia và tự sinh một ma trận bao gồm các protein và eDNA.