MỞ ĐẦU Hiện nay tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Một trong các yếu tố dẫn đến bệnh ung thƣ là do chế độ ăn uống. Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp muối, hun khói đƣợc coi là những thực phẩm có thể dẫn đến căn bệnh chết ngƣời này. Tuy vậy, rất ít ngƣời dân nhận thức đƣợc rằng các thực phẩm tƣởng chừng vô hại nhƣ các loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, một chất có khả năng gây ung thƣ.
Năm 2002 các nhà khoa học Thụy Điển đã tìm ra chất này trong các sản phẩm thực phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10]. Acrylamide hình thành khi các thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán ở nhiệt độ trên 120oC. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ cao, asparagine trong bột làm bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide [29]. Các nhà khoa học trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine.
Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic và ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8]. Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A. oryzae ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại là Acrylaway®L (2007) [24]. Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar [11].
Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các thực phẩm chiên nƣớng ở Việt Nam còn rất hạn chế. Với mong muốn tạo ra chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng ở trong nƣớc, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris”. pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại lai đƣợc các nhà khoa học sử dụng rộng rãi bởi những đặc tính ƣu việt đó là chủng an toàn sinh học, 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com là chủng eukaryote đơn giản, có thể thực hiện biến đổi sau dịch mã tốt, có khả năng sinh trƣởng mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trong quá trình lên men, thao tác dễ dàng [3,49]. Ngoài ra, hệ thống P.
pastoris có thể sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với nguồn nguyên liệu methanol rẻ tiền và ít bị tạp nhiễm. Chính vì những ƣu điểm này mà P. pastoris đƣợc xem là hệ biểu hiện thích hợp nhất đƣợc lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa asparaginase từ nấm sợi A. Hiện nay, có rất nhiều công trình trên thế giới biểu hiện asparaginase từ các nguồn khác nhau để phục vụ chủ yếu cho mục đích chữa bệnh và làm chất phụ gia.
Các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng đƣợc biểu hiện trong E. coli và Bacillus [27, 50, 51, 52] còn các gen có nguồn gốc từ nấm thƣờng đƣợc biểu hiện ở các chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55]. Ngoài ra có hai công trình nghiên cứu biểu hiện asparaginase I và III của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chủng nấm men P.
pastoris để biểu hiện asparaginase của A. Toàn bộ công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 1.
Khả năng gây bệnh của acrylamide Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo ngƣời tiêu dùng về nguy cơ ung thƣ do ăn khoai tây chiên. Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tƣởng nhƣ vô hại khác nhƣ cà phê, bánh mì, bánh quy. cũng có thể dẫn đến ung thƣ. Nguyên nhân chính là do các thực phẩm trên có acrylamide.
Ngay sau khi ăn, acrylamide trong thực phẩm sẽ nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Nó đƣợc phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí là cả trong sữa mẹ. Acrylamide chuyển hoá thành glycidamide ở trong gan thông qua cytochrome P540. Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có thể tƣơng tác với các đại phân tử nhƣ DNA, hemoglobin và các enzyme gây đột biến DNA hoặc làm ảnh hƣởng tới chức năng sinh học của hệ enzyme trong cơ thể [16].
Những nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và ảnh hƣởng đến hệ thần kinh [38]. Thông thƣờng chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hƣởng đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5 mg/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày), tuy nhiên nồng độ này thƣờng khó đạt đƣợc thông qua ăn uống. Ngƣợc lại, khả năng gây ung thƣ và đột biến gen của acrylamide và glycidamide đã đƣợc công bố ở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng nhƣ trên động vật. Nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào cho thấy acrylamide và glycidamide có thể làm gãy nhiễm sắc thể và gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thƣờng trên nhiễm sắc thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh.
Những nghiên cứu trên tế bào chuột và ngƣời đƣợc xử lý bằng acrylamide cho thấy, acrylamide làm tăng tỉ lệ đột biến, đặc biệt là đột biến thay thế các nucleobase nhƣ adenine bằng guanine và guanine bằng cytosine. Đối với thí nghiệm trên chuột, acrylamide thúc đẩy quá trình hình thành khối u trên não, phổi, tinh hoàn và tuyến vú. Khi chuột đƣợc xử lý với liều 2 mg acrylamide trên 1 kg trọng lƣợng cơ thể sẽ làm tăng 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đáng kể u não, tuyến ức, tử cung và những tế bào khác. Mặc dù vậy, acrylamide đƣợc sử dụng với liều cao trong các nghiên cứu trên động vật có thể không phản ánh trung thực những ảnh hƣởng, tác động của acrylamide hấp thu đƣợc trong thức ăn.
Do đó rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học đã đƣợc thực hiện để đánh giá nguy cơ gây ung thƣ của acrylamide cho con ngƣời. Mucci và cộng sự (2003) đã chứng minh rằng acrylamide hầu nhƣ không liên quan tới ung thƣ bóng đái, ruột, thận, thanh quản, thực quản, vú và buồng trứng [32]. Tuy nhiên , Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Tổ chức Nông lƣơng liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Hóa học Châu Âu và Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ thế giới (IARC) đều coi acrylamide là chất có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời, thuộc nhóm 2A [24]. Vì vậy, nồng độ của acrylamide trong thực phẩm phải đƣợc kiểm soát ở mức độ cho phép.
Vì lý do đó, con đƣờng hình thành acrylamide cần phải đƣợc xác định để kiểm soát lƣợng acrylamide hấp thu vào cơ thể. Tổ chức Bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EPA) và WHO đã đƣa ra hàm lƣợng acrylamide tối đa trong đồ uống là 0,5 ppb hoặc 0,05 µg/lít. Hiện nay, số liệu về lƣợng acrylamide vào cơ thể từ thức ăn và liều gây chết còn hạn chế [9]. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng Bột mỳ là nguyên liệu chính giàu carbohydrate đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất các loại bánh nƣớng nhƣ bánh mỳ, bánh bích quy.
Bột mỳ đƣợc trộn với nguyên phụ liệu, nhào bột, ép nặn tạo hình, ủ, nƣớng, làm nguội, phân loại và bao gói. Quá trình nƣớng trải qua ba giai đoạn với nhiệt độ nƣớng là 160oC, 190oC và trên 225oC từ 10 đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn [24]. Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy , Thụy Sĩ , Anh và Mỹ đã cho thấy các loại thực phẩ m có nguồ n gố c thực vâ ̣t giàu carbohydrate khi đƣợc chế biế n bằng các phƣơng pháp đòi hỏi nhiê ̣t đô ̣ cao (>120oC) đều sản sinh acrylamide [16, 30, 41]. Nguyên nhân là trong sản xuất bánh nƣớng, sự tạo thành màu vàng sau khi nƣớng là do các axit amin phản ứng với đƣờng glucose (phản ứng Maillard) tạo thành hợp chất có màu vàng nâu.
Tuy nhiên, chỉ có asparagine là tiền chất chủ yếu tạo thành acrylamide. Những loại đƣờng khử tham gia tạo thành acrylamide mạnh mẽ nhất là glucose, fructose [16, 30]. Hàm lƣợng asparagine tự do trong các loại bột 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mỳ rất khác nhau, dao động từ 0,14-0,4 g/kg [28]. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm [30] 1.
Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm Sự lo ngại về acrylamide trong thực phẩ m đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các nghiên cứu đã đƣa ra số liệu về hàm lƣợng acrylamide trong một số loại thực phẩm nhƣ sau: khoai tây chiên 600-4300 µg/kg, bánh bích quy 100-750 µg/kg, bánh mỳ 50-4000 µg/kg, ngũ cốc 50-1350 µg/kg [30]. Mức độ nhiễm acrylamide trong một số sản phẩm thƣơng mại cũng đã đƣợc Uỷ ban Châu Âu báo cáo: bánh mỳ gừng lên đến 7834 µg/kg, trung bình là 303 µg/kg, trong bánh bích quy 3324 µg/kg, trung bình là 145 µg/kg và ở bánh mỳ 2838 µg/kg, trung bình là 244 µg/kg [33]. Tuy nhiên, lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu protein đƣợc chế biế n ở nhiê ̣t đô ̣ cao là thấp , từ 5-50 µg/kg, nhƣng phát hiện với liều cao ở thực phẩm giàu carbohydrate, trung bình 150-4000 µg/kg và không phát hiện thấy ở thực phẩm không nƣớng và thực phẩm luộc [16].
Asparaginase Asparaginase (L-asparagine amidohydrolase) là enzym thủy phân L- asparagine thành axit aspartic và ammonia. Asparaginase có mặt trong giới thực vật, động vật và vi sinh vật. Ở thực vật, phần lớn các nghiên cứu về asparaginase từ cây đậu. Ở động vật, enzyme này đƣợc tìm thấy trong gan gà.
Việc sản xuất asparaginase bằng vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu từ năm 1972 [18]. Asparaginase đƣợc sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau [33] nhƣ Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Aerobacter aerogens, Aeromonas 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hydrophila, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris, Bacillus subtilis, Streptomyces griseus, Corynebacterium glutamicum [22, 33, 34]. Nấm mốc và nấm men cũng có khả năng sinh asparaginase nhƣ Aspergillus niger, A. terreus, Penicillium granulatum, P.
digitatum, Fusarium solani, F. oxysporum, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae [22, 33, 34]. Asparaginase có thể đƣợc tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết các chủng sản sinh asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi. Asparaginase sinh ra từ vi sinh vật khác nhau có khối lƣợng phân tử khác nhau: từ 40 đến gần 200 kDa.
Tính chịu nhiệt của các asparaginase khác nhau thƣờng khác nhau. Asparaginase của một số vi khuẩn nhƣ là P.