Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp cải thiện thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thúy
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thanh Hải
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Khái niệm liposome
• 1.2. Phân loại theo kích thước và cấu trúc số lớp
• 1.3. Phân loại theo thành phần cấu trúc lớp vỏ
• 1.4. Thành phần cấu tạo liposome
• 1.5. Phương pháp bào chế
• 1.5.1. Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film)
• 1.5.2. Phương pháp tiêm
• 1.5.3. Phương pháp bốc hơi pha đảo (Reverse – phase evaporation method)
• 1.5.4. Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn (supercritical reverse phase evaporation method)
• 1.6. Ảnh hưởng của đặc tính tiểu phân đến tới chất lượng liposome
• 1.6.1. Ảnh hưởng của KTTP
• 1.6.2. Ảnh hưởng điện thế zeta đến độ ổn định
• 1.7. Phương pháp giảm kích thước tiểu phân
• 1.7.1. Phương pháp siêu âm
• 1.7.2. Phương pháp nén/ đẩy qua màng
• 1.7.3. Phương pháp đông lạnh - giải đông (freeze-thawed)
• 1.7.4. Phương pháp vi hóa lỏng (microfluidization)
• 1.8. Ứng dụng của liposome
• 1.8.1. Ứng dụng của liposome trong điều trị ung thư
• 1.8.2. Ứng dụng đưa thuốc tới mắt
• 1.8.3. Ứng dụng đưa thuốc tới phổi
• 1.9. Ưu điểm và nhược điểm của liposome
• 1.9.1. Nhược điểm
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nguyên vật liệu
• 2.2. Phương tiện nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng film
• 2.3.2. Nghiên cứu quy trình làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân
• 2.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường bên trong và bên ngoài đến đặc tính tiểu phân của liposome
• 2.3.4. Phương pháp đánh giá liposome tạo thành
• 2.3.4.1. Đánh giá cảm quan
• 2.3.4.2. Phương pháp đánh giá hình thái, cấu trúc liposome
• 2.3.4.3. Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa lí của hệ có môi trường trong và ngoài khác nhau
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Hình thái, cấu trúc liposome
• 3.2. Đánh giá quy trình giảm và đồng nhất KTTP
• 3.2.1. Hệ môi trường hydrat nước (H2O)
• 3.2.2. Hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4
• 3.2.3. Hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4
• 3.2.4. Hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 5
• 3.2.5. Hệ môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5%
• 3.2.6. Hệ môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10%
• 3.2.7. Hệ môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0,9%
• 3.2.8. Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat trong NaCl pH 7
• 3.3. Đánh giá độ ổn định của mỗi hệ liposome với các thành phần môi trường trong và ngoài khác nhau
• 3.3.1. Môi trường bên trong là nước
• 3.3.2. Môi trường bên trong là đệm acetat pH 4,0 (AB – acetat buffer)
• 3.3.3. Môi trường hydrat: đệm citrat pH 4
• 3.3.4. Hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 4
• 3.3.5. Môi trường hydrat: dung dịch glucose 5% (Glu)
• 3.3.6. Môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10% (Sac)
• 3.3.7. Môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0
• 3.3.8. Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat trong NaCl pH 7
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc

Liposome là một hệ thống mang thuốc tiên tiến, được phát triển từ những năm 60. Chúng có cấu trúc hình cầu, bao gồm một nhân nước ở giữa và được bao bọc bởi lớp phospholipid. Liposome có khả năng bao gói dược chất, giúp cải thiện hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này tập trung vào việc bào chế liposome nhằm tối ưu hóa khả năng mang thuốc và tăng cường hiệu quả điều trị.

1.1. Khái niệm và cấu trúc của liposome

Liposome là các hạt có cấu trúc hình cầu, bao gồm một nhân nước ở giữa và lớp phospholipid bao bọc. Chúng có thể chứa dược chất trong khoang nước hoặc giữa lớp lipid, giúp bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy.

1.2. Lịch sử phát triển liposome trong y học

Từ khi được phát hiện, liposome đã trải qua nhiều nghiên cứu và cải tiến. Chúng đã trở thành một trong những hệ thống mang thuốc hiệu quả nhất, được ứng dụng rộng rãi trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác.

II. Vấn đề và thách thức trong bào chế liposome

Mặc dù liposome có nhiều ưu điểm, nhưng việc bào chế chúng cũng gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như kích thước tiểu phân, độ ổn định và khả năng giải phóng thuốc cần được giải quyết để tối ưu hóa hiệu quả điều trị.

2.1. Kích thước tiểu phân và ảnh hưởng đến hiệu quả

Kích thước tiểu phân của liposome ảnh hưởng lớn đến khả năng phân phối thuốc trong cơ thể. Liposome có kích thước nhỏ hơn thường dễ dàng thâm nhập vào các mô và tế bào hơn.

2.2. Độ ổn định của liposome trong môi trường

Độ ổn định của liposome là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả của chúng. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần môi trường có thể ảnh hưởng đến độ ổn định và khả năng giải phóng thuốc.

III. Phương pháp bào chế liposome hiệu quả

Có nhiều phương pháp bào chế liposome, mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được liposome có chất lượng cao.

3.1. Phương pháp hydrat hóa màng film

Phương pháp này sử dụng màng phospholipid để tạo ra liposome. Quá trình hydrat hóa giúp tạo ra các hạt liposome với kích thước đồng nhất và ổn định.

3.2. Phương pháp bốc hơi pha đảo

Phương pháp này cho phép tạo ra liposome bằng cách bốc hơi dung môi, giúp nạp dược chất vào liposome một cách hiệu quả. Đây là một trong những phương pháp phổ biến nhất trong bào chế liposome.

IV. Ứng dụng thực tiễn của liposome trong điều trị

Liposome đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực y học, đặc biệt là trong điều trị ung thư. Chúng giúp cải thiện khả năng phân phối thuốc và giảm tác dụng phụ.

4.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Liposome được sử dụng để mang thuốc điều trị ung thư, giúp tăng cường hiệu quả và giảm tác dụng phụ. Chúng có khả năng nhắm mục tiêu đến các tế bào ung thư một cách chính xác.

4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh lý khác

Ngoài ung thư, liposome còn được sử dụng trong điều trị các bệnh lý khác như bệnh tim mạch, bệnh lý về mắt và phổi. Chúng giúp cải thiện khả năng hấp thu và hiệu quả điều trị.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu liposome

Nghiên cứu về liposome đang ngày càng phát triển, mở ra nhiều cơ hội mới trong điều trị bệnh. Tương lai của liposome hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong y học.

5.1. Tương lai của liposome trong y học

Với sự phát triển của công nghệ, liposome có thể được cải tiến hơn nữa để tăng cường hiệu quả điều trị. Nghiên cứu mới sẽ giúp phát triển các loại liposome nhắm mục tiêu chính xác hơn.

5.2. Thách thức trong nghiên cứu và phát triển

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu và phát triển liposome vẫn gặp nhiều thách thức. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để giải quyết các vấn đề liên quan đến độ ổn định và khả năng giải phóng thuốc.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hệ dẫn thuốc liposome được mô tả lần đầu bởi Bangham vào giữa những năm 1960, có cấu trúc hình cầu gồm một hoặc nhiều lớp màng phospholipid kép bao bọc nhân nước bên trong. Với cấu trúc lưỡng thân, liposome có khả năng mang đồng thời cả dược chất thân nước (phân bố trong khoang nước) và dược chất thân dầu (phân bố trong màng lipid kép). Cấu tạo từ các thành phần tương thích sinh học cao như phospholipid và cholesterol giúp liposome không gây độc, không sinh kháng nguyên và có khả năng phân hủy sinh học tự nhiên. Trong điều trị y học, đặc biệt là hóa trị liệu ung thư, hệ nano liposome với kích thước dưới 200 nm có thể tích tụ chọn lọc tại mô khối u nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và tính lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention - EPR), từ đó giảm thiểu tác dụng phụ trên các mô lành so với dược chất tự do.

Quá trình bào chế liposome đòi hỏi nhiều công đoạn kỹ thuật phức tạp và đầu tư trang thiết bị cao. Việc nghiên cứu bào chế sẵn các liposome "trắng" (liposome rỗng, chưa nạp dược chất) có đặc tính tiểu phân ổn định để làm chất mang trung gian cho phép tiêu chuẩn hóa quy trình, tiết kiệm thời gian và phục vụ hiệu quả cho các nghiên cứu nạp thuốc tiếp theo. Đối với các hệ tiểu phân nano, kích thước tiểu phân (KTTP) và điện thế zeta là hai chỉ số vật lý then chốt quyết định trực tiếp đến độ bền nhiệt động học, thời gian lưu thông trong tuần hoàn và hiệu quả hướng đích.

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học của tác giả Nguyễn Thị Thúy (ngành Dược học, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, 2017) với đề tài "Nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc" được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:

1. Nghiên cứu quy trình giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân liposome.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường xung quanh (môi trường bên trong và môi trường bên ngoài) đến đặc tính tiểu phân (KTTP và thế zeta) của liposome.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hệ tiểu phân liposome trắng được tạo thành từ phospholipid đậu nành đã hydro hóa (HSPC) và cholesterol (CHOL).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: Đề tài hoàn thành và nghiệm thu vào tháng 6 năm 2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên cơ sở lý thuyết về cấu trúc màng lipid kép và cơ chế hình thành tiểu phân nano liposome. Thành phần công thức sử dụng gồm HSPC (nhiệt độ chuyển pha cao, bền vững) phối hợp với cholesterol nhằm tăng độ cứng vững của màng, giảm tính thấm rò rỉ dược chất và hạn chế sự thủy phân phospholipid.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế qua các giai đoạn:

• Phương pháp bào chế màng film (phương pháp Bangham): Hòa tan hỗn hợp lipid HSPC và cholesterol theo tỷ lệ khối lượng 250 mg : 50 mg trong 50 ml dung môi cloroform. Bốc hơi dung môi trên máy cất quay chân không ở nhiệt độ 40°C, tốc độ quay 50 vòng/phút trong 1 giờ để tạo màng film mỏng, tiếp tục sấy hút chân không trong 12–18 giờ. Tiến hành hydrat hóa màng film ở 60°C (cao hơn nhiệt độ chuyển pha của lipid), tốc độ quay 80 vòng/phút trong 2 giờ bằng 8 dung dịch hydrat hóa khác nhau: nước cất, đệm acetat pH 4,0, đệm citrat pH 4,0, đệm amoni sulfat pH 5,5, dung dịch glucose 5%, dung dịch saccarose 10%, dung dịch NaCl 0,9% và đệm phosphat trong NaCl pH 7,4 (PBS).
• Phương pháp giảm và đồng nhất kích thước: Sử dụng thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex (Avestin, Canada) vận hành bằng khí nén nitơ ở nhiệt độ duy trì 60°C. Tiến hành khảo sát thực nghiệm tại 2 mức áp suất (500 bar và 1000 bar) qua các chu kỳ nén lặp lại (10, 20, 30 chu kỳ), sau đó lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm.
• Phương pháp đổi môi trường ngoài: Ứng dụng kỹ thuật thẩm tích qua màng thẩm tích Spectra/Por 4 (ngưỡng cắt phân tử MWCO 12–14 kDa). 5 ml hỗn dịch liposome được cho vào túi thẩm tích, đặt trong 500 ml môi trường ngoài khảo sát (nước cất, đệm HBS pH 7,4 hoặc đệm HBG pH 7,4) ở 4–8°C trong 24 giờ.
• Phương pháp đánh giá đặc tính hóa lý: Đánh giá hình thái cấu trúc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Đo kích thước tiểu phân trung bình (Z-average), chỉ số đa phân tán (PDI) và điện thế zeta bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer ZS90 (Malvern, Anh) sau khi pha loãng mẫu 100 lần bằng nước cất (tốc độ đếm 200–400 kcps), đo lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình. Đánh giá độ ổn định của các hệ tại điều kiện bảo quản 4°C ở các mốc thời gian: 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 30 ngày (1 tháng).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1 - TỔNG QUAN

Chương tổng quan hệ thống hóa cơ sở khoa học về hệ mang thuốc liposome. Tác giả phân loại liposome theo kích thước và số lớp vỏ: liposome đơn lớp (SUV: 20–50 nm, LUV: >50 nm, GUV: >1000 nm) và liposome đa lớp (OLV: 100–1000 nm, MLV: >500 nm, MVVs). Về cấu trúc vỏ, tổng quan phân tích từ liposome quy ước đến các dạng liposome biến đổi như: liposome tuần hoàn dài gắn PEG (tránh hiện tượng opsonin hóa), liposome miễn dịch gắn phối tử đặc hiệu (kháng thể IgG, folate, transferrin), liposome nhạy cảm kích thích (nhiệt độ, từ tính oxit sắt, pH), cationic liposome mang DNA/RNA, transferosome, ethosome và niosome.

Về phương pháp bào chế và giảm kích thước, chương 1 đối chiếu phương pháp Bangham, tiêm ethanol, tiêm ether, bốc hơi pha đảo (REV), bốc hơi pha đảo siêu tới hạn ($scCO_2$), siêu âm đầu dò, vi hóa lỏng và nén qua màng áp suất cao. Tác giả phân tích cơ chế phân phối thuốc của liposome trong điều trị ung thư dựa trên hiệu ứng EPR (khe hở mạch máu khối u >400 nm trong khi mạch máu mô lành <10 nm), dẫn chứng các thuốc đã lưu hành như Doxil/Caelyx, DaunoXome, DepoCyte, cũng như ứng dụng đưa thuốc qua mắt (voriconazole, latanoprost) và qua đường phổi (paclitaxel).

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu đạt tiêu chuẩn dược dụng hoặc tinh khiết hóa học: HSPC (Lipoid), Cholesterol và HEPES (Sigma Aldrich), túi thẩm tích Spectra/Por 4 (Spectrum Lab, Mỹ), nước cất pha tiêm (DĐVN). Tác giả thiết lập công thức điều chế các hệ đệm:

• Đệm citrat pH 4,0: 3,15 g acid citric + 0,7 g NaOH trong 100 ml nước cất pha tiêm, chỉnh pH 4,0 bằng NaOH 10%.
• Đệm amoni sulfat pH 5,5: 1,68 g $(NH_4)_2SO_4$ trong 100 ml nước cất, chỉnh pH 5,5 bằng NaOH 10%.
• Đệm acetat pH 4,0: 2,36 g natri acetat + 8 ml dung dịch $CH_3COOH$ 0,2 M trong 100 ml nước cất, chỉnh pH 4,0.
• Đệm PO4/NaCl pH 7,4 (PBS): 0,144 g $Na_2HPO_4$ + 0,024 g $KH_2PO_4$ trong 100 ml NaCl 0,9%.
• Đệm HBS pH 7,4: 20 mM HEPES trong 500 ml NaCl 0,9%; đệm HBG pH 7,4: 20 mM HEPES trong 500 ml glucose 5%.

Chương 2 cũng thiết lập sơ đồ quy trình nghiên cứu chuẩn hóa từ khâu tạo màng, hydrat hóa, nén đồng nhất hóa áp suất cao, thẩm tích đổi môi trường và quy trình đo quang học DLS, chụp TEM.

Chương 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

Kết quả chụp TEM xác nhận các tiểu phân liposome tạo thành có dạng hình cầu, cấu trúc đơn lớp đồng nhất, màng vỏ mỏng với đường kính quan sát được nằm trong khoảng 70–110 nm.

Khảo sát quy trình giảm kích thước trên thiết bị EmulsiFlex cho thấy áp suất 1000 bar luôn cho hiệu quả giảm KTTP và PDI vượt trội so với 500 bar trên tất cả các dung dịch hydrat hóa:

Hệ môi trường hydrat hóa	Áp suất tối ưu (bar)	Số chu kỳ nén tối ưu	KTTP trung bình (nm)	Chỉ số PDI	Điện thế Zeta (mV)
Nước cất ($H_2O$)	1000	20	70,8	0,140	-31,6
Đệm acetat pH 4,0	1000	30	74,3	0,152	+32,5
Đệm citrat pH 4,0	1000	20	123,7	0,186	+4,51
Đệm amoni pH 5,5	1000	30	89,54	0,160	+12,8
Dung dịch Glucose 5%	1000	30	119,5	0,210	-12,5
Dung dịch Saccarose 10%	-	-	Cao, không ổn định	>0,3	Gần 0 (lắng cặn sau 1 đêm)
Dung dịch NaCl 0,9%	1000	20	108,6	0,290	-16,1
Đệm PO4/NaCl pH 7,4	1000	30	80,6	0,159	-30,7

Đánh giá độ ổn định của các hệ sau khi thẩm tích đổi môi trường ngoài qua 30 ngày bảo quản ở 4°C:

• Hệ hydrat là nước ($H_2O$): Hệ giữ nguyên ngoại môi nước ($H_2O/H_2O$) duy trì độ ổn định tốt nhất sau 30 ngày (KTTP: 73,5 nm; PDI: 0,155; Zeta: -27,5 mV). Khi đổi ngoại môi sang HBS hoặc HBG, tiểu phân có xu hướng tăng kích thước và thế zeta giảm xuống mức kém bền (-9,1 mV và -13,5 mV).
• Hệ hydrat là đệm acetat pH 4,0 (AB): Mẫu giữ nguyên trong đệm acetat tự suy thoái nhanh do pH thấp thúc đẩy thủy phân lipid (KTTP tăng từ 74,3 lên 145,3 nm, Zeta giảm còn +12,5 mV). Khi đổi môi trường ngoài sang nước cất ($AB/H_2O$), hệ đạt độ ổn định cao nhất (KTTP: 88,4 nm; PDI: 0,196; Zeta: -30,8 mV; điện tích chuyển sang âm do hấp phụ ion).
• Hệ hydrat là đệm citrat pH 4,0 (CB): Mẫu $CB/CB$ kém bền (Zeta gần 0). Khi đổi môi trường ngoài sang đệm HBG ($CB/HBG$), hệ duy trì kích thước ổn định (124,3 nm; PDI: 0,201; Zeta: -28,7 mV). Đổi sang HBS kém ổn định do ion $Cl^-$ làm mỏng lớp khuếch tán.
• Hệ hydrat là đệm amoni pH 5,5 (AmB): Mẫu đổi môi trường ngoài sang HBS ($AmB/HBS$) cho kết quả ổn định nhất (KTTP: 94,62 nm; PDI: 0,208; Zeta: -31,2 mV).
• Hệ hydrat là dung dịch Glucose 5% (Glu): Mẫu đổi môi trường ngoài sang nước cất ($Glu/H_2O$) đạt độ ổn định tốt nhất (KTTP: 124,0 nm; PDI: 0,229; Zeta: -26,0 mV).
• Hệ NaCl 0,9% và Saccarose 10%: Đều thể hiện tính kém bền, xuất hiện kết tập, tách pha và lắng cặn rõ rệt dưới đáy lọ sau bảo quản (KTTP hệ NaCl tăng vượt 1500 nm).

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Chương kết luận tổng hợp lại các thông số kỹ thuật đã tối ưu hóa cho từng hệ dung dịch, khẳng định hệ liposome có môi trường trong là đệm acetat pH 4,0 và môi trường ngoài là nước cất ($AB/H_2O$) là hệ tối ưu nhất về độ bền tiểu phân. Tác giả đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc đánh giá tương tác môi trường, tiến hành nạp các dược chất cụ thể và thử nghiệm in vitro/in vivo.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xác lập bộ thông số thực nghiệm hoàn chỉnh cho quy trình bào chế liposome trắng quy mô phòng thí nghiệm bằng phương pháp màng film kết hợp nén áp suất cao:

• Xác định áp suất nén 1000 bar trên thiết bị EmulsiFlex là điều kiện thích hợp để thu được liposome đơn lớp có kích thước nano (<130 nm) và phân bố kích thước hẹp (PDI <0,25).
• Thiết lập bảng tương thích giữa môi trường hydrat hóa bên trong và môi trường bảo quản bên ngoài nhằm đảm bảo độ ổn định hóa lý trong thời gian 30 ngày ở 4°C:

Môi trường trong	Môi trường ngoài thích hợp	KTTP sau 30 ngày (nm)	PDI sau 30 ngày	Thế Zeta sau 30 ngày (mV)
Nước cất	Nước cất	73,5	0,155	-27,5
Đệm acetat pH 4,0	Nước cất	88,4	0,196	-30,8
Đệm citrat pH 4,0	Đệm HBG pH 7,4	124,3	0,201	-28,7
Đệm amoni pH 5,5	Đệm HBS pH 7,4	94,62	0,208	-31,2
Dung dịch Glucose 5%	Nước cất	124,0	0,229	-26,0
Đệm PBS pH 7,4	Đệm PBS pH 7,4	90,6	0,203	-22,6

Đóng góp của nghiên cứu:

• Đã giải quyết được bài toán ổn định hóa lý của liposome rỗng thông qua việc điều chỉnh gradient môi trường bên trong/bên ngoài bằng phương pháp thẩm tích, chứng minh rằng việc bảo quản liposome trong môi trường pH acid thấp (đệm acetat, citrat) sẽ gây phá hủy hệ do thủy phân phospholipid, nhưng khi tạo chênh lệch môi trường với ngoại môi trung tính hoặc nước cất, hệ sẽ đạt điện thế bề mặt tối ưu ($|\zeta| \approx 30$ mV) và duy trì cấu trúc bền vững.
• Cung cấp các công thức nền tảng (đặc biệt là hệ đệm acetat/nước và amoni sulfat/HBS) sẵn sàng phục vụ cho kỹ thuật nạp thuốc chủ động theo gradient pH hoặc gradient nồng độ ion amoni.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận từ phạm vi nghiên cứu:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở việc khảo sát trên hệ liposome trắng (chưa nạp hoạt chất), chưa đánh giá ảnh hưởng của các phân tử dược chất thực tế lên tính bền vững của màng lipid.
• Thời gian theo dõi độ ổn định thực nghiệm giới hạn trong 1 tháng (30 ngày) ở điều kiện bảo quản 4°C, chưa khảo sát độ ổn định dài hạn (3–6 tháng) hoặc độ ổn định ở nhiệt độ phòng (25°C) và điều kiện lão hóa cấp tốc.
• Chưa khảo sát các tỷ lệ phối hợp phospholipid : cholesterol khác ngoài tỷ lệ 250 mg : 50 mg.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

• Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác lý hóa giữa các môi trường trong và ngoài khác nhau nhằm nâng cao độ ổn định cho chế phẩm liposome.
• Sử dụng các hệ liposome trắng đã bào chế để tiến hành nạp các nhóm dược chất khác nhau (thân nước, thân dầu, phân tử nhỏ, kháng sinh, thuốc chống ung thư).
• Đánh giá hiệu suất liposome hóa (EE), động học giải phóng dược chất và hiệu quả điều trị của hệ mang thuốc trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
• Đánh giá độc tính tế bào và khả năng hấp thu của liposome mang thuốc trên các dòng tế bào chuyên biệt.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo thực nghiệm giá trị đối với:

• Sinh viên, học viên cao học ngành Dược học, Công nghệ Dược phẩm và Hóa sinh: Cung cấp quy trình vận hành chi tiết phương pháp Bangham kết hợp thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex và kỹ thuật phân tích tán xạ ánh sáng động Zetasizer ZS90.
• Các nhóm nghiên cứu về hệ dẫn thuốc nano: Tham khảo dữ liệu thực nghiệm về ảnh hưởng của các hệ đệm (citrat, acetat, amoni sulfat, PBS, glucose, NaCl) đến điện thế zeta và kích thước hạt, từ đó lựa chọn môi trường hydrat hóa phù hợp để thiết kế hệ nạp thuốc chủ động cho các dược chất nhạy cảm hoặc độc tính cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Mục đích của việc nghiên cứu bào chế liposome trắng (chưa mang dược chất) trong đề tài là gì? Bào chế liposome trắng nhằm tạo ra chất mang trung gian có kích thước tiểu phân và điện thế bề mặt ổn định, đồng nhất. Việc này giúp chuyên môn hóa quá trình sản xuất, tiết kiệm thời gian nghiên cứu và tạo tiền đề để nạp các loại dược chất khác nhau vào liposome ở các giai đoạn sau thông qua các cơ chế nạp chủ động hoặc thụ động.

2. Thông số vận hành tối ưu trên thiết bị nén đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex là gì? Khảo sát thực nghiệm cho thấy mức áp suất 1000 bar vượt trội hơn hẳn mức 500 bar. Số chu kỳ nén tối ưu dao động từ 20 đến 30 chu kỳ tùy theo từng môi trường hydrat hóa (ví dụ: 20 chu kỳ đối với nước và đệm citrat; 30 chu kỳ đối với đệm acetat, đệm amoni, glucose 5% và PBS) ở nhiệt độ duy trì 60°C.

3. Vì sao hệ liposome hydrat bằng đệm acetat pH 4,0 khi đổi môi trường ngoài sang nước cất lại có độ ổn định cao hơn khi giữ nguyên trong đệm acetat? Khi giữ nguyên trong đệm acetat pH 4,0, môi trường acid thấp làm gia tăng tốc độ thủy phân phospholipid khiến hệ bị suy thoái (thế zeta giảm từ +32,5 mV xuống +12,5 mV sau 30 ngày, KTTP tăng vọt). Khi đổi ngoại môi sang nước cất qua màng thẩm tích, bề mặt liposome hấp phụ các ion âm từ môi trường, chuyển điện thế bề mặt sang giá trị âm lớn (-30,8 mV), tạo lực đẩy tĩnh điện mạnh ngăn cản sự kết tập tiểu phân và làm chậm quá trình thủy phân lipid.

4. Tại sao các hệ liposome sử dụng dung dịch hydrat hóa NaCl 0,9% và saccarose 10% bị kết luận là không phù hợp? Hệ hydrat bằng saccarose 10% có KTTP lớn, PDI cao, thế zeta tiệm cận 0 và bị kết tập, lắng cặn chỉ sau một đêm ở 4°C. Hệ hydrat bằng NaCl 0,9% có thế zeta thấp (-16,1 mV), trong quá trình bảo quản xuất hiện hiện tượng tăng kích thước mạnh (>1500 nm ở ngoại môi HBG), kết tập và lắng cặn đáy lọ sau nửa tháng do ion muối làm giảm lớp khuếch tán bề mặt.

5. Cấu trúc và kích thước của tiểu phân liposome tạo thành được xác định như thế nào qua ảnh chụp TEM? Hình ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) xác nhận các tiểu phân liposome có dạng hình cầu, cấu trúc đơn lớp (unilamellar), lớp màng lipid kép mỏng và kích thước phân bố đồng nhất trong khoảng 70–110 nm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thúy đã chuẩn hóa thành công quy trình bào chế hệ mang thuốc liposome trắng từ phospholipid đậu nành hydro hóa (HSPC) và cholesterol bằng phương pháp màng film kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao 1000 bar. Nghiên cứu đã chứng minh rõ nét ảnh hưởng mang tính quyết định của thành phần môi trường hydrat hóa bên trong và dung dịch bảo quản bên ngoài đến kích thước tiểu phân và điện thế zeta. Kết quả thực nghiệm đã xác định hệ liposome có môi trường trong là đệm acetat pH 4,0 và môi trường ngoài là nước cất ($AB/H_2O$) đạt độ ổn định vật lý cao nhất (KTTP: 88,4 nm; PDI: 0,196; Zeta: -30,8 mV sau 30 ngày), tạo tiền đề kỹ thuật vững chắc cho các nghiên cứu nạp dược chất hướng đích tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1- TỔNG QUAN 1. Khái niệm liposome Liposome thuộc hệ điều trị cao hơn của dạng thuốc kiểm soát giải phóng - hệ mang thuốc hướng đích (targeted drug delivery system) có cấu trúc hình cầu đơn hay đa lớp kép cấu tạo gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [3,4] Hình 1.1: Cấu trúc liposome Thành phần chính của liposome là phospholipid và cholesterol. Đây là những chất tương hợp sinh học với cơ thể, có thể phân giải được trong cơ thể nên có ưu việt trong ứng dụng làm chất mang thuốc [3,4,54] Trong lĩnh vực Dược, liposome được ứng dụng làm hệ mang thuốc và mô hình tế bào nhân tạo. Khi sử dụng liposome làm chất mang thuốc, dược chất có thể phân bố trong khoang nước của liposome, phân bố giữa lớp phospholipid kép, tương tác và gắn với đầu không phân cực của phân tử phospholipid hoặc hấp phụ trên bề mặt của lớp phospholidpid kép tùy thuộc vào đặc tính thân dầu nước của dược chất và tương tác hóa lí giữa dược chất với lớp phospholipid kép (hình 1.2: Các cách mang dược chất của liposome: 1- Dược chất trong khoang nước.

2- Dược chất nằm giữa lớp lipid kép. 3- Dược chất gắn vào đầu phân cực của phospholipid. 4- Dược chất liên kết với lớp lipid kép. 5- Dược chất liên kết với đầu không phân cực của phân tử phospholipid.

6- Dược chất hấp phụ trên bề mặt lớp lipid kép. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Một số dược chất chỉ ổn định trong một số điều kiện nhất định, tuy nhiên môi trường ổn định nhất cho dược chất đôi khi lại không thích hợp với cơ thể do đó làm giảm khả năng điều trị của dược chất. Liposome được dùng làm chất mang thuốc do liposome có thể bao gói bên trong lớp lipid kép môi trường tối ưu cho sự ổn định của dược chất nhưng lại được phân tán trong một môi trường có điều kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể. Do đó liposome được coi là một trong những hệ mang thuốc lý tưởng [24,26,30].

Phân loại theo kích thước và cấu trúc số lớp + Liposome đơn lớp (ULV: Unilamellar vesicle): Vỏ chỉ có một lớp phospholipid Tùy theo kích thước mà có 4 loại: Loại nhỏ SUV (Small Unilamellar Vesicle) SUV có đường kính từ khoảng 20-50 nm, loại to LUV (Large Unilamellar Vesicle) có đường kính trên 50 nm, loại khổng lồ GLV (Giant Unilamellar Vesicle) có đường kính trên 1000 nm[4,43]. + Liposome đa lớp (MLV: multilamellar vesicle): Cấu tạo gồm nhiều lớp lipid và nhiều ngăn nước đồng tâm, kích thước 400 - 3. Gồm 3 loại: OLV (Oligo Lamellar Vesicle) có ít hơn 5 lớp lipid kích thước 100-1000 nm, MLV có 5-25 lớp lipid kích thước trên 500 nm, MVV (Multi Vesicular Vesicle) cấu trúc liposome kép (liposome trong liposome) [4,43].3: Phân loại liposome dựa trên kích thước và cấu trúc số lớp phospholipid. Phân loại theo thành phần cấu trúc lớp vỏ.

Liposome quy ước: là loại liposome được tạo thành từ các phospholipid khác nhau, cholesterol và có thể có các lipid khác nhưng không có sự thay đổi nào trên bề mặt liposome. Nhược điểm: thời gian tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do dễ bị liên kết protein và bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các tế bào bình thường [8,25]. Liposome biến đổi: nhằm khắc phục nhược điểm của liposome qui ước, các nhà khoa học đã nghiên cứu thay đổi cấu trúc của liposome để tăng cường hiệu quả mang thuốc hơn. Một liposome mang thuốc hiệu quả phải đạt được các yêu cầu sau: • Hiệu suất mang thuốc phải cao và ổn định.

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] • Tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn. • Có khả năng thoát khỏi lòng mạch máu tại vị trí bị bệnh để đi vào mô bệnh. • Kiểm soát được khả năng giải phóng thuốc vào trong tế bào. Để cải thiện sự lưu thông trong hệ tuần hoàn cũng như là đưa, phân phối thuốc hướng đích, bề mặt liposome được thay đổi bằng việc đưa thêm polymer thân nước PEG, các phối tử hướng đích (targeting ligand) như protein, chuỗi peptide, kháng thể đơn dòng,.

để đạt mục tiêu hướng đích chủ động [35,54].1 : Một số phân loại liposome theo thành phần cấu trúc lớp vỏ Loại liposome Thành phần Liposome quy ước PL tự nhiên hoặc PL điện tích âm kết hợp với cholesterol. Liposome nhạy PL được sử dụng như DOPE (dioleoylphosphatidyl cảm với pH ethanolamin). Liposome tích Lipid tích điện dương bề mặt với DOPE. điện dương Liposome tuần Bề mặt được bao bởi polymer thân nước.

hoàn dài Liposome miễn Bề mặt liposome gắn kháng thể hoặc các nhóm hướng dịch đích có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích. Có thể phân loại liposome biến đổi theo mục đích bào chế gồm các loại [8,54,55]: + Liposome tuần hoàn lâu trong máu (tuần hoàn dài) (Long-circualating liposome): Liposome loại này có bề mặt bao phủ một lớp polyme thân nước, tương hợp sinh học nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome tránh khỏi sự nhận diện của quá trình opsonin hóa và do đó làm giảm khả năng thải trừ liposome khỏi hệ tuần hoàn. PEG là polyme hay được sử dụng để tạo ra liposome tuần hoàn dài trong máu [7,12, 22, 28,59]. + Liposome mi n dịch (Immuno liposome): Bề mặt liposome được gắn lên các phân tử có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích (các nhóm nhận đích - target ligand).

Các chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các kháng thể IgG nên liposome này được gọi là liposome miễn dịch. Hiện nay đã phát triển thêm nhiều nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể nên các liposome đều gọi tên theo nhóm hướng đích được gắn tuy nhiên vẫn được xếp vào loại liposome miễn dịch như: liposome hướng receptor folate, liposome hướng receptor tranferin [12, 28]. + Liposome mi n dịch tuần hoàn dài (Long-circualating Immunoliposome): Đây là loại liposome kết hợp các ưu điểm của liposome tuần hoàn dài và liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome. Đặc điểm cấu tạo của liposome này s có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đích s được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome [22, 28].4: Các dạng liposome biến đổi Ngoài ra còn một số dạng của liposome đó là: + Liposome cảm ứng (sensitive liposome): Là các liposome trong thành phần cấu tạo có chứa một tỉ lệ các chất có khả năng thay đổi cấu trúc vật lý hoặc hóa học dưới các điều kiện đặc biệt, có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polyme có khả năng bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích.

Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ trường, nhiệt độ (tác nhân ngoại) như: a/ Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome): thành phần phospholipid như phosphatidyl ethanolamine, dioleoyl phosphatidyl ethanolamine liposome nhạy cảm với nhiệt độ nhanh chóng giải phóng dược chất khi nung nóng đến 41,3oC và do đó có khả năng nhắm mục tiêu phân phối hóa trị liệu toàn thể cho mô tế bào khi kết hợp với chứng tăng thân nhiệt [11,18,35,47]. b/ Liposome từ tính (magnetic liposome): bề mặt liposome được bao bởi một lớp vỏ polymer có gắn các hạt nano từ tính như oxit sắt Fe3O4 hay sắt dạng oxi hóa như γ- Fe2O3. Trong một từ trường thay đổi, thay đổi hướng ngẫu nhiên từ hướng song song sang hướng đối cực, cho phép chuyển năng lượng từ thành dạng nhiệt, do đó làm tăng nhiệt độ tại các mô khối u. Các mô tại khối u thường nhạy cảm với sự gia tăng nhiệt độ hơn các mô lành, vì thế đây là một hướng điều trị ung thư mới [10,12].

c/ Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) : là những liposome có thành phần phospholipid như DOPE, có khả năng hoạt động trong môi trường pH thấp như ở mô khối u khoảng 5,5 [6,8,35,47]. Ngoài ra còn một số dạng của liposome đó là: 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] + Liposome tích điện dương (cationic liposome): có khả năng liên hợp với tế bào, màng tế bào, thích hợp dùng làm hệ phân phối thụ động các đại phân tử tích điện như DNA, RNA [35,47]. + Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [35,47]. + Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp ứng miễn dịch cho cơ thể [6,8].

+ Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat hóa tạo hỗn dịch liposome [47]. + Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol, isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [47]. + Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri cholat,…) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm. Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi là transferosome [47].

+ Niosome: sử dụng chất diện hoạt không ion hóa thay cho phospholipid như Span 80, Span 60, Tween 80,. Độ ổn định có thể cao hơn, hiệu suất gắn dược chất cao hơn, rẻ tiền hơn so với liposome. Niosome gần đây được phát triển như một chất mang thuốc tương tự liposome, cải thiện sinh khả dụng cho các dược chất ít tan, thấm kém, tăng độ ổn định cho các dược chất kém bền [35]. +Arsonoliposome: là dạng liposome sử dụng arsonolipid thay cho phospholipid, dùng trong điều trị ung thư và diệt ký sinh trùng vì khả năng tăng độc tính với tế bào ung thư và đơn bào [35].

Thành phần cấu tạo liposome 1. PL là loại lipid chứa phospho, một đầu phân cực, một đầu không phân cực nên nó có khả năng tự tạo thành lớp màng kép trong môi trường nước. PL là nguyên liệu tách chiết từ tự nhiên hoặc tổng hợp, có cấu trúc tương đồng sinh học với tế bào sống, do đó an toàn, tăng khả năng vận chuyển thuốc, dễ xâm nhập vào các tổ chức đích. PL là thành phần chính của liposome.