MỞ ĐẦU Hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa (Postweaning multisystemic wasting syndrome-PMWS) chủ yếu do Porcine Circovirus (PCV) type 2gây ra. Ngoài hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa, PCV2 cũng là nguyên nhân có liên quan đến Hội chứng viêm da và viêm thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS), Hội chứng viêm đƣờng hô hấp (porcine respiratory diseases complex), và Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (porcine reproductive disorders). Trong số các bệnh trên lợn có liên quan đến porcine circovirus gây ra ở trên thì hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa (PMWS) là bệnh phổ biến nhất và đƣợc coi là bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất cho ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới (Chae, 2012b). Vacxin là yếu tố quyết định trong công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm.
Năm 2004, 13 năm sau kể từ khi trƣờng hợp PMWS đầu tiên đƣợc phát hiện tại Canada, vacxin phòng hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa lần đầu tiên đã đƣợc phép sản xuất và tiêu thụ tại Đức và Pháp (Charreyre et al. Trong những năm gần đây một số loại vacxin phòng PMWS đã đƣợc sản xuất và lƣu hành trên thế giới. Vacxin đã và đang đƣợc sử dụng phổ biến và đƣợc coi là công cụ hữu hiệu nhất trong việc phòng chống PMWS do PCV2 gây ra (Cline et al., 2008; Fachinger et al., 2008; Fort et al., 2008; Horlen et al., 2008; Kixmoller et al., 2008; Segales et al. Hiện nay trong nƣớc chƣa có nghiên cứu nào về vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con đƣợc sản xuất từ các chủng lƣu hành tại Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự về việc nghiên cứu chọn chủng virus Porcine circovirus type 2 (PCV2) để sản xuất vắc xin phòng bệnh còi cọc ở lợn con đã bƣớc đầu thành công trong việc xây dựng ngân hàng giống virus PCV2 phân lập đƣợc, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng PCV2 dùng làm giống gốc để sản xuất vacxin, nghiên cứu bảo quản và xác định các đặc tính của giống vacxin PCV2 sau bảo quản. Việc tiếp theo là tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con do PCV2 gây ra. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định chỉ tiêu an toàn và hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô hoạt porcine circovirus type 2 sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập tại Việt Nam” 5 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của lợn khi đƣợc tiêm thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CĂN BỆNH (PCV2) Porcine circovirus (PCV) là một ADN virus thuộc họ Circoviridae, bao gồm Porcine circovirus type 1 (PCV1) và Porcine circovirus type 2 (PCV2). Dựa trên kết quả giải trình tự gen thấy mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide giữa PCV1 và PCV2 là 68 – 76% (Hamel et al. PCV1 lần đầu tiên đƣợc phân lập tại Đức vào năm 1974, là một virus tạp nhiễm trên môi trƣờng tế bào thận lợn (PK15), không có khả năng gây bệnh ở lợn (nonpathogenic). Năm 1991 tại Canada, một loại virus mới phân lập đƣợc là PCV type 2 (PCV2) đƣợc xác định là nguyên nhân gây hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa và sau đó đƣợc ghi nhận ở nhiều nƣớc trên thế giới.
Hình thái, cấu trúc PCV2 PCV2 là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài. Với đƣờng kính hạt virus trong khoảng 12 - 23 nm, PCV2 đƣợc biết đến là virus có kích thƣớc nhỏ nhất gây bệnh ở động vật có vú. Bộ gen của virus PCV2 thƣờng dài 1767-1768 nucleotide, có ít nhất 4 khung đọc mở (ORF1- ORF4) đã đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm ( Nawagitgul et al. ORF1 mã hóa cho protein có bản chất là enzyme sao chép vật chất di truyền (replicases protein, rep và rep’) cần thiết cho sự nhân lên của virus; ORF2, mã hóa cho capsid (Cap) protein, là protein cấu trúc của virus; và ORF3 và ORF4 mã hóa các protein không cần thiết cho sự nhân lên của virus, nhƣng có thể đóng vai trò trong độc lực của virus, đƣợc cho là có liên quan đến hiện tƣợng apoptosis ở tế bào nhiễm virus.
Phân loại PCV2 Về phân loại virus, căn cứ vào kết quả giải trình tự gen và phân tích đặc điểm tiến hóa, trƣớc năm 2014 PCV2 đƣợc chính thức công nhận gồm có 3 genotype, ký hiệu từ PCV2a, PCV2b và PCV2c (Segales et al. Trong đó PCV2a chiếm ƣu thế trƣớc khi các vụ dịch chính xảy ra trên thế giới, sau đó PCV2b là genotype chiếm ƣu thế. PCV2a và PCV2b có mối tƣơng quan gần về trình tự nucleotide ở gen rep (97-100%) và cap gen (91-100%) và cũng tƣơng đƣơng về trình tự amino acid, với tỷ lệ 97-100% với Rep và 89-100% với Cap. 7 Nghiên cứu của (Guo et al., 2010) về sự lƣu hành của PCV2 ở Trung Quốc đã phát hiện một nhánh mới (đƣợc đặt tên là PCV2d) bao gồm các chủng đƣợc thu thập trong năm 2007 và 2008 ở lợn có biểu hiện lâm sàng của hội chứng PMWS.
Tuy nhiên, chỉ đến thời điểm hiện tại, trên cơ sở phân tích 1680 trình tự gen mã hóa capsid protein (ORF2), công bố của (Xiao et al., 2015) mới đƣa ra đƣợc bằng chứng khẳng định PCV2d thực sự là một genotype mới. Genotype PCV2d hiện đƣợc xác định lƣu hành rộng rãi ở châu Âu, châu Mỹ và châu Á, gồm các quốc gia nhƣ: Thụy Sỹ, Bỉ, Đức, Phần Lan, Romani, Serbia; Mỹ, Uruguay; Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc (Xiao et al., 2015, Ramos et al. Nhƣ vậy, cho tới năm 2015 PCV2 có 4 genotype (PCV2a, PCV2b, PCV2c và PCV2d) và 8 nhánh di truyền (cluster) 2A-2E và 1A-1C (Olvera et al., 2007) đƣợc công nhận. Tính chất nuôi cấy Môi trƣờng tế bào thận lợn PK15 đƣợc xác định là thích hợp để nuôi cấy PCV2, virus nhân lên trong nhân tế bào, nhƣng không gây bệnh tích tế bào.
Vì PCV2 chỉ mã hóa cho hai loại protein nên ngƣời ta cho rằng virus phải dựa vào protein của tế bào vật chủ để nhân lên, nghĩa là chúng nhân lên tốt trong tế bào đang phân chia. Tischer et al., (1987) cho biết tế bào PK15 đƣợc xử lý với glucosamine sẽ giúp cho sự nhân lên của PCV2 tốt hơn. Phân lập PCV2 trên môi trƣờng tế bào PK15 thƣờng mất rất nhiều công sức và thời gian do đặc điểm nhân lên rất chậm và thấp của virus, thƣờng chỉ áp dụng trong nghiên cứu để sản xuất vacxin phòng bệnh. Vì không gây bệnh tích tế bào nên để khẳng định sự nhân lên của virus cần phải làm phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc PCR.
Sức đề kháng Nghiên cứu in vitro cho thấy PCV2 có khả năng đề kháng tốt với nhiệt độ. Nhiệt độ > 75oC trong 1 giờ mới làm giảm hiệu giá virus. Do đó PCV2 có khả năng tồn tại một thời gian dài trong điều kiện tại các trang trại. Khả năng đề kháng với chất sát trùng cũng đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu trong điều kiện in vitro.
Trong khi potassium peroxymonosulfate (KHSO5), sodium hydroxide (NaOH) khiến cho PCV2 bị bất hoạt trong thời gian ngắn thì hỗn dịch NH4/glutaraldehyde cần phải thời gian dài hơn mới bất hoạt đƣợc virus này (Kim et al. Formaldehyde có hiệu quả kém hơn so với các chế phẩm trong thành phần có iodine và phenol, mà không ảnh hƣởng đến hiệu 8 giá của virus (Martin et al. Nhìn chung, việc giảm hiệu giá của PCV2 trong điều kiện in vitro khi sử dụng sản phẩm có chứa chất oxy hóa, halogen hoặc NaOH là rõ rệt hơn so với các chế phẩm có iodine, alcohol, phenol hoặc formaldehyde (Royer et al. Việc bất hoạt hoàn toàn PCV2 trong điều kiện in vitro rất khó khăn và đòi hỏi thời gian dài (Yilmaz and Kaleta, 2004).
Dịch tễ học mô tả về PCV2 Mặc dù đƣợc phát hiện năm 1991 nhƣng nhiều kết quả nghiên cứu hồi cứu với các mẫu bệnh phẩm cho thấy đã có sự lƣu hành của PCV2 ở đàn lợn từ năm 1969 tại Bỉ, năm 1970 tại Anh, năm 1973 tại Ireland, năm 1983 tại Canada (trích theo Gillespie et al., (2009)), và năm 1983 tại Tây Ban Nha (Rodriguez-Arrioja et al. Hiện nay không có bằng chứng huyết thanh học cho thấy PCV2 nhiễm trên ngƣời, gia cầm, cừu, dê và ngựa. Dữ liệu hiện có cho thấy PCV2b đang chiếm ƣu thế trên toàn thế giới. Về đặc điểm dịch tễ học phân tử, các genotype khác nhau của PCV2 có mức độ lƣu hành rất khác biệt.
Genotype PCV2c chỉ có ở mẫu bệnh phẩm thu thập những năm 1989-1990 ở Đan Mạch (Dupont et al. Đối với genotype PCV2a và PCV2b, các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện đƣợc sự chuyển dịch genotype lƣu hành phổ biến (genotypic shift) từ PCV2a sang PCV2b diễn ra trên phạm vi toàn cầu từ năm 2003 (Cortey et al., 2011, Dupont et al. Trong một nghiên cứu vào năm 2008, 218 bộ gen đầy đủ của PCV2 đƣợc giải trình tự và đăng ký trên Genbank tháng 3 năm 2007 đã đƣợc phân tích và các tác giả cũng kết luận có sự dịch chuyển (shift) từ PCV2a sang PCV2b trên toàn cầu trong giai đoạn năm 2003 (Dupont et al., 2008), và có thể cho thấy PCV2b có độc lực cao hơn so với PCV2a mặc dù những kết quả nghiên cứu thực nghiệm chƣa khẳng định giả thuyết này. Trong vài năm trở lại đây, ngƣời ta cho rằng có một sự dịch chuyển genotype lƣu hành phổ biến sang PCV2d do sự phân bố rộng rãi của nó ở các nƣớc chăn nuôi lợn và sự tăng về số lƣợng các trình tự gen PCV2d đƣợc công bố (Xiao et al.
Kể từ khi đƣợc phát hiện, PCV2 và bệnh liên quan đến PCV2 (PCVAD) đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng bệnh liên quan và đặc biệt là nghiên cứu phát triển các loại vacxin để phòng bệnh. PCV2 đƣợc ghi nhận ở rất nhiều nƣớc trên thế giới và bệnh PMWS đã đƣơc chẩn đoán ở cả 5 châu lục. Con đƣờng truyền lây của các genotype PCV2 đã xây dựng lại (Vidigal et al., 2012) nhƣ mô tả ở hình 2.
Đƣờng truyền lây của các genotype PCV2 - Châu Á: vụ dịch gần giống PMWS đƣợc mô tả tại Đài Loan năm 1995. Từ đó đến nay PCV2 và PCVAD đƣợc xác định lƣu hành ở Nhật Bản (Takahagi et al., 2008), Hàn Quốc (An et al., 2007), Thái Lan (Jantafong et al., 2011) và Malaysia (Jaganathan et al. Tại Trung Quốc, (Wang et al.