Giáo trình Thực hành Vi sinh vật - ĐH Quốc tế TP.HCM (PGS. Trần Thị Mỹ Hạnh)

Giáo trình Vi sinh vật học: Hướng dẫn thực hành chi tiết từ giảng viên, ThS. Trần Thị Thanh. Tài liệu hữu ích cho sinh viên và người làm trong ngành.

• Người hướng dẫn: Assoc. Prof. Tran Thi My Hanh
• Trường học: HCMC International University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Microbiology Laboratory Manual
• Loại tài liệu: Laboratory Manual
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Ho Chi Minh City

Tóm tắt

I. Tổng quan giáo trình thực hành vi sinh vật của PGS

Tài liệu "Microbiology Laboratory Manual" do PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh và TS. Lê Thị Huỳnh Trâm biên soạn là một nguồn tài nguyên học thuật quan trọng cho sinh viên và giảng viên ngành Công nghệ Sinh học tại Đại học Quốc tế - ĐHQG TP.HCM. Cuốn sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh này được thiết kế để cung cấp nền tảng kiến thức và kỹ năng thực hành cốt lõi trong lĩnh vực vi sinh vật học. Nội dung bao quát từ các quy tắc cơ bản về an toàn phòng thí nghiệm sinh học đến những kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn phức tạp. Mỗi bài thực hành được trình bày một cách hệ thống, bắt đầu bằng mục tiêu, nguyên tắc, vật liệu cần thiết và quy trình thực hiện chi tiết. Tài liệu này không chỉ là một giáo trình thực hành vi sinh vật thông thường, mà còn là một công cụ hướng dẫn toàn diện, giúp người học tự tin thực hiện các thí nghiệm vi sinh vật học một cách chính xác và an toàn. Cấu trúc của giáo trình được chia thành sáu buổi thí nghiệm chính, mỗi buổi tập trung vào một nhóm kỹ năng cụ thể, từ chuẩn bị môi trường, kỹ thuật vô trùng, sử dụng kính hiển vi, cho đến các phương pháp đếm và định danh vi sinh vật. Đây là một tài liệu giảng dạy vi sinh chuẩn mực, được công nhận bởi khoa vi sinh đại học y và các tổ chức liên quan, đóng vai trò nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn.

1.1. Mục tiêu và cấu trúc của sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh

Mục tiêu chính của cuốn sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh là trang bị cho sinh viên những kỹ năng thực hành cơ bản và cần thiết nhất trong vi sinh vật học. Cấu trúc được thiết kế logic với 6 bài thí nghiệm chính. Bài 1 giới thiệu tổng quan về khóa học và quy tắc an toàn. Bài 2 tập trung vào kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn và cấy truyền. Bài 3 hướng dẫn sử dụng kính hiển vi và phương pháp nhuộm Gram. Bài 4 và 5 đi sâu vào các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và phương pháp đếm số lượng vi khuẩn. Cuối cùng, Bài 6 tổng kết và kiểm tra quá trình định danh vi sinh vật. Mỗi bài đều có phần câu hỏi ôn tập để củng cố kiến thức, giúp sinh viên chuẩn bị cho việc viết báo cáo thí nghiệm vi sinh.

1.2. Vai trò của tài liệu giảng dạy vi sinh trong đào tạo

Cuốn tài liệu giảng dạy vi sinh này đóng vai trò không thể thiếu trong chương trình đào tạo ngành Công nghệ Sinh học. Nó chuẩn hóa quy trình thực hành vi sinh, đảm bảo mọi sinh viên đều nắm vững các thao tác cơ bản và tuân thủ nghiêm ngặt quy định an toàn. Tài liệu do PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh chủ biên còn là nguồn tham khảo đáng tin cậy cho các giảng viên, giúp thống nhất phương pháp giảng dạy và đánh giá. Việc sử dụng một giáo trình duy nhất giúp tạo ra một môi trường học tập đồng bộ, hiệu quả, và là nền tảng vững chắc cho các môn học chuyên ngành và nghiên cứu khoa học sau này. Đây thực sự là một sách chuyên khảo vi sinh y học có giá trị thực tiễn cao.

II. Thách thức về an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật học

An toàn là yếu tố tiên quyết trong mọi thí nghiệm vi sinh vật học. Tài liệu của PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tuân thủ các quy tắc an toàn phòng thí nghiệm sinh học. Những thách thức chính bao gồm nguy cơ lây nhiễm chéo giữa các mẫu cấy, phơi nhiễm với vi sinh vật gây bệnh, và các tai nạn liên quan đến hóa chất hoặc thiết bị nhiệt. Cuốn sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh đã dành riêng Phụ lục 1 và 2 để trình bày chi tiết các quy tắc an toàn. Các quy định này yêu cầu người thực hành phải mặc áo choàng thí nghiệm, đeo găng tay, khử trùng khu vực làm việc trước và sau khi thực hành, và xử lý chất thải lây nhiễm đúng cách. Việc không tuân thủ các quy trình thực hành vi sinh an toàn có thể dẫn đến kết quả thí nghiệm sai lệch, gây nguy hiểm cho bản thân và cộng đồng. Giáo trình này cung cấp một khuôn khổ rõ ràng để giảm thiểu rủi ro, nhấn mạnh việc không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm và phải rửa tay kỹ lưỡng sau mỗi buổi thực hành. Việc xử lý sự cố tràn đổ vật liệu lây nhiễm cũng được hướng dẫn cụ thể, yêu cầu phải báo cáo ngay cho người hướng dẫn và sử dụng chất khử trùng phù hợp.

2.1. Top 10 quy tắc an toàn phòng thí nghiệm sinh học cốt lõi

Tài liệu nhấn mạnh các quy tắc an toàn phòng thí nghiệm sinh học cơ bản. 1. Luôn mặc áo choàng thí nghiệm. 2. Khử trùng bề mặt làm việc trước và sau khi sử dụng. 3. Rửa tay kỹ bằng xà phòng diệt khuẩn. 4. Không ăn uống, hút thuốc. 5. Xử lý vật liệu lây nhiễm và dụng cụ thủy tinh đã qua sử dụng vào đúng nơi quy định. 6. Cẩn thận khi sử dụng đèn cồn và các thiết bị nhiệt. 7. Báo cáo ngay mọi sự cố cho người hướng dẫn. 8. Không được tự ý thực hiện các thí nghiệm ngoài kế hoạch. 9. Dán nhãn tất cả các đĩa cấy và ống nghiệm. 10. Không đặt các vật dụng cá nhân không cần thiết trên bàn thí nghiệm. Việc tuân thủ nghiêm ngặt các quy tắc này là nền tảng của một quy trình thực hành vi sinh thành công.

2.2. Phương pháp xử lý chất thải và dụng cụ lây nhiễm

Việc xử lý chất thải đúng cách là một phần quan trọng của an toàn phòng thí nghiệm sinh học. Theo giáo trình thực hành vi sinh vật, tất cả các vật liệu đã tiếp xúc với vi sinh vật, như đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy, đều phải được khử trùng trước khi thải bỏ. Các dụng cụ thủy tinh tái sử dụng cần được ngâm trong dung dịch khử trùng mạnh như Lysol 5% trước khi rửa. Pipet đã sử dụng phải được đặt vào bình chứa dung dịch khử trùng riêng. Chất thải rắn lây nhiễm phải được cho vào túi hấp chuyên dụng và hấp tiệt trùng trước khi xử lý như rác thải thông thường. Quy trình này đảm bảo ngăn chặn sự phát tán của vi sinh vật ra môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và tuân thủ các quy định y tế.

III. Hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn từ sổ tay PGS

Chương 2 của sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh tập trung vào các kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn, một kỹ năng nền tảng cho mọi nhà vi sinh vật học. Kỹ thuật vô trùng (Aseptic technique) được xem là nguyên tắc vàng, đảm bảo mẫu cấy không bị tạp nhiễm từ môi trường và môi trường không bị ô nhiễm bởi mẫu cấy. Giáo trình của PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh hướng dẫn chi tiết từng bước trong quy trình cấy truyền, từ việc khử trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đỏ rực, thao tác mở nắp ống nghiệm và hơ miệng ống nghiệm qua lửa. Các bước này nhằm tạo ra một vùng làm việc vô trùng xung quanh khu vực thao tác. Tài liệu mô tả ba quy trình cấy truyền cơ bản: từ môi trường lỏng sang lỏng, từ môi trường rắn (thạch nghiêng) sang rắn, và từ đĩa thạch sang thạch nghiêng. Mỗi quy trình được minh họa bằng hình ảnh rõ ràng, giúp sinh viên dễ dàng theo dõi và thực hiện. Việc nắm vững các quy trình thực hành vi sinh này không chỉ giúp thu được các chủng vi sinh vật thuần khiết mà còn đảm bảo tính chính xác của các kết quả thí nghiệm vi sinh vật học sau này, chẳng hạn như trong quá trình định danh vi sinh vật.

3.1. Nguyên tắc cốt lõi của kỹ thuật vô trùng Aseptic Technique

Kỹ thuật vô trùng là nền tảng của mọi thao tác trong thí nghiệm vi sinh vật học. Nguyên tắc chính là ngăn chặn sự xâm nhập của các vi sinh vật không mong muốn vào môi trường nuôi cấy. Theo tài liệu, điều này đạt được thông qua một chuỗi các hành động: khử trùng khu vực làm việc, khử trùng que cấy bằng nhiệt độ cao (đốt trên ngọn lửa đèn cồn), hơ nóng miệng các vật chứa (ống nghiệm, bình) trước và sau khi lấy mẫu. Ngoài ra, việc hạn chế thời gian mở nắp đĩa Petri và giữ nắp che phía trên đĩa trong khi thao tác cũng là một phần quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn vô trùng.

3.2. Quy trình cấy truyền vi khuẩn trên các loại môi trường

Cuốn giáo trình thực hành vi sinh vật này mô tả chi tiết các bước cấy truyền. Khi cấy từ môi trường lỏng, cần lắc nhẹ ống nghiệm để phân tán đều vi khuẩn trước khi lấy mẫu. Khi cấy từ môi trường rắn như thạch nghiêng hoặc đĩa Petri, chỉ cần dùng que cấy hoặc que cấy đầu thẳng chạm nhẹ vào khuẩn lạc để lấy một lượng sinh khối rất nhỏ. Thao tác cấy lên môi trường thạch nghiêng mới cần thực hiện theo đường ziczac từ đáy lên trên bề mặt. Đối với đĩa Petri, kỹ thuật cấy ria được áp dụng để phân lập khuẩn lạc riêng rẽ. Mỗi bước đều yêu cầu sự tỉ mỉ và tuân thủ tuyệt đối kỹ thuật vô trùng.

3.3. Bí quyết cấy ria đĩa Streak Plate để phân lập khuẩn lạc

Phương pháp cấy ria là một kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn quan trọng nhằm mục đích phân lập các tế bào riêng lẻ từ một quần thể hỗn hợp, từ đó tạo ra các khuẩn lạc thuần khiết. Giáo trình giới thiệu bốn kỹ thuật cấy ria khác nhau (Quadrant Streak A, B, Radiant Streak, Continuous Streak). Kỹ thuật phổ biến nhất là cấy ria 4 góc (Quadrant Streak). Nguyên tắc là làm giảm dần mật độ vi khuẩn trên bề mặt thạch. Sau khi ria ở vùng đầu tiên, que cấy được khử trùng lại trước khi kéo một vài đường từ vùng 1 sang vùng 2. Quá trình này được lặp lại cho các vùng tiếp theo. Kết quả là ở vùng cuối cùng, các tế bào vi khuẩn sẽ nằm tách biệt và phát triển thành các khuẩn lạc đơn.

IV. Cách nhuộm Gram và định danh vi sinh vật trong giáo trình

Bài 3 trong giáo trình thực hành vi sinh vật của PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh là một chương quan trọng, giới thiệu hai kỹ năng không thể thiếu: sử dụng kính hiển vi và phương pháp nhuộm Gram. Nhuộm Gram là một kỹ thuật nhuộm phân biệt, chia vi khuẩn thành hai nhóm chính: Gram dương (bắt màu tím) và Gram âm (bắt màu hồng/đỏ). Quy trình này là bước đầu tiên và cơ bản nhất trong quá trình định danh vi sinh vật. Tài liệu hướng dẫn chi tiết bốn bước của quy trình: 1) Nhuộm sơ cấp bằng thuốc nhuộm Crystal Violet. 2) Cố định màu bằng dung dịch Iodine (chất gắn màu). 3) Tẩy màu bằng cồn 95%. 4) Nhuộm bổ sung bằng Safranin. Bước tẩy màu được coi là quan trọng nhất, quyết định kết quả nhuộm đúng hay sai. Các tế bào Gram dương có lớp peptidoglycan dày sẽ giữ lại phức hợp tím-iodine, trong khi tế bào Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng sẽ bị cồn tẩy màu và sau đó bắt màu hồng của Safranin. Cuốn sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh này không chỉ cung cấp quy trình thực hành vi sinh mà còn giải thích cơ chế hóa học đằng sau nó, giúp người học hiểu sâu sắc bản chất của phương pháp.

4.1. Hướng dẫn chi tiết các bước của phương pháp nhuộm Gram

Quy trình nhuộm Gram được chuẩn hóa trong sách chuyên khảo vi sinh y học này bao gồm các bước rõ ràng. Đầu tiên, vết bôi vi khuẩn đã được cố định nhiệt sẽ được phủ bằng Crystal Violet trong 30 giây, sau đó rửa nước. Tiếp theo, phủ dung dịch Gram's Iodine trong 1 phút rồi rửa lại. Bước quyết định là tẩy màu bằng cồn 95% trong 15-30 giây, cho đến khi không còn thấy màu tím trôi ra. Cuối cùng, nhuộm tương phản bằng Safranin trong 60-80 giây. Sau mỗi bước nhuộm hoặc tẩy đều có bước rửa nhẹ bằng nước cất để loại bỏ thuốc nhuộm thừa. Việc tuân thủ đúng thời gian ở mỗi bước là yếu tố then chốt để có kết quả chính xác.

4.2. Kỹ thuật làm tiêu bản và cố định mẫu vi khuẩn hiệu quả

Trước khi nhuộm, việc chuẩn bị một vết bôi (smear) tốt là rất quan trọng. Tài liệu giảng dạy vi sinh hướng dẫn cách lấy mẫu từ cả môi trường lỏng và rắn. Đối với môi trường lỏng, chỉ cần nhỏ một đến hai giọt canh khuẩn lên lam kính sạch. Đối với môi trường rắn, cần cho một giọt nước cất lên lam kính trước, sau đó dùng que cấy đầu thẳng lấy một lượng rất nhỏ sinh khối và hòa tan đều trong giọt nước. Vết bôi phải đủ mỏng để các tế bào nằm thành một lớp duy nhất. Sau khi để khô tự nhiên, tiêu bản được cố định bằng cách hơ nhanh qua ngọn lửa 2-3 lần. Quá trình cố định nhiệt giúp vi khuẩn chết và bám chặt vào lam kính, tránh bị rửa trôi trong quá trình nhuộm.

4.3. Phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm qua kính hiển vi

Sau khi nhuộm, việc quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính dầu (100x) sẽ cho phép phân loại vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím đậm do giữ lại phức hợp Crystal Violet-Iodine. Vi khuẩn Gram âm sẽ có màu hồng hoặc đỏ của thuốc nhuộm Safranin. Kết quả này, kết hợp với hình thái tế bào (cầu khuẩn, trực khuẩn) và cách sắp xếp (đơn, chuỗi, chùm), cung cấp những thông tin đầu tiên và vô cùng giá trị cho quá trình định danh vi sinh vật. Đây là một bước sàng lọc quan trọng trong các quy trình của khoa vi sinh đại học y.

V. Quy trình định danh vi sinh vật từ tài liệu PGS

Việc định danh vi sinh vật chưa biết là một trong những bài tập tổng hợp và thú vị nhất trong thí nghiệm vi sinh vật học. Giáo trình thực hành vi sinh vật của PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh cung cấp một lộ trình bài bản để sinh viên thực hiện nhiệm vụ này. Quá trình bắt đầu bằng việc thu thập thông tin về đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và đặc tính sinh lý - sinh hóa của vi sinh vật. Về hình thái, các bước quan trọng bao gồm thực hiện phương pháp nhuộm Gram để xác định phản ứng Gram và hình dạng tế bào (trực khuẩn, cầu khuẩn), quan sát sự sắp xếp tế bào, và kiểm tra khả năng di động. Về đặc điểm nuôi cấy, sinh viên phải quan sát và mô tả hình thái khuẩn lạc trên các môi trường khác nhau như thạch máu (BA) và MacConkey (MC), bao gồm các yếu tố như kích thước, hình dạng, màu sắc, bề mặt, và độ trong. Cuối cùng, các thử nghiệm sinh hóa như thử nghiệm Catalase sẽ được thực hiện để xác định sự hiện diện của các enzyme cụ thể, giúp phân biệt các nhóm vi khuẩn. Cuốn sổ tay phòng thí nghiệm vi sinh này cung cấp một sơ đồ phân loại (separation outline) rõ ràng, giúp sinh viên hệ thống hóa kết quả và đi đến kết luận cuối cùng về tên của vi sinh vật.

5.1. Các bước khảo sát đặc điểm hình thái và nuôi cấy

Quy trình thực hành vi sinh để định danh bắt đầu bằng việc quan sát đại thể và vi thể. Quan sát đại thể là mô tả khuẩn lạc trên đĩa Petri sau 24-48 giờ nuôi cấy. Các đặc điểm như hình dạng (tròn, không đều), bờ (nguyên, gợn sóng), bề mặt (trơn, nhám), và màu sắc được ghi lại chi tiết. Quan sát vi thể bao gồm nhuộm Gram để xác định hình dạng tế bào (cầu, trực), Gram âm hay dương, và cách sắp xếp (chuỗi, chùm). Kiểm tra tính di động cũng là một phần quan trọng, thường được thực hiện bằng phương pháp giọt treo hoặc cấy vào môi trường thạch mềm.

5.2. Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa Catalase trong phân loại

Các thử nghiệm sinh hóa là công cụ mạnh mẽ để định danh vi sinh vật. Thử nghiệm Catalase là một ví dụ điển hình được trình bày trong giáo trình. Enzyme catalase phân giải hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và oxy, gây ra hiện tượng sủi bọt khí. Thử nghiệm này rất hữu ích để phân biệt Staphylococci (catalase dương) với Streptococci (catalase âm). Bằng cách nhỏ một giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc, sự xuất hiện của bọt khí ngay lập tức cho thấy kết quả dương tính. Kết quả từ các thử nghiệm này giúp thu hẹp phạm vi các vi sinh vật nghi ngờ.

5.3. Sử dụng sơ đồ phân loại để xác định vi khuẩn chưa biết

Tài liệu của PGS. TS. Trần Thị Mỹ Hạnh cung cấp một sơ đồ phân loại hệ thống, được gọi là "Separation outline for gram-positive and gram-negative rods and cocci". Sơ đồ này hoạt động như một khóa phân loại. Dựa trên kết quả nhuộm Gram, vi khuẩn được chia thành hai nhánh lớn. Sau đó, dựa vào hình thái (cầu khuẩn/trực khuẩn) và các kết quả thử nghiệm sinh hóa (như Catalase), sinh viên có thể lần theo các nhánh của sơ đồ để đi đến nhóm hoặc chi vi khuẩn cụ thể. Ví dụ, một cầu khuẩn Gram dương, catalase dương, tụ thành chùm sẽ được định danh thuộc chi Staphylococcus. Đây là một công cụ trực quan và hiệu quả để tổng hợp dữ liệu và đưa ra kết luận cuối cùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HCMC INTERNATIONALUNIVERSITY SCHOOL OF BIOTECHNOLOGY MICROBIOLOGY LABORATORY MANUAL Instructor: Assoc. Tran Thi My Hanh Dr. Le Thi Huynh Tram Ho Chi Minh City, 2022 HCMC INTERNATIONALUNIVERSITY SCHOOL OF BIOTECHNOLOGY MICROBIOLOGY LABORATORY MANUAL S€ITSÍT: .- G Ăn eree Studentˆs Name: .--- - c5 5c cc << << << << sex CASS: .sssscsssesseseesessscececcescceesceeseceeeseeeeaes CONTENTS tk **% Course title: MICROBIOLOGY’s LAB Number of credits: 1 No. Experiment Page No.

Remark 01 | LABORATORY |: ¢ Allocation of laboratory place ¢ Introduction to the course ¢ Medium preparation 02 | LABORATORY 2: ¢ Aseptic technique * Culture technique ¢ Subculture 03. | LABORATORY 3: ¢ Use of the microscope e Prepare a wet mount ¢ Smear preparation * Gram stain 04 | LABORATORY 4: * Oxy requirement ¢ Temperature conditions ¢ Preparation and care of stock culture 05 | LABORATORY 5: ¢ Bacterial Population Counts ¢ Introduction to Bacterial identification process 06 | LABORATORY 6: ¢ Bacterial Population Counts (continuous) ¢ Introduction to Bacterial identification process (continuous) s® Test LABORATORY 1: Allocation of laboratory place Introduction to the course Medium preparation 1. ALLOCATION OF LABORATORY PLACE: Students should proceed to the appropriate laboratory where practical class groups will be organized 2. INTRODUCTION TO THE COURSE: Your demonstrator will outline the laboratory rules to you and answer any questions you have about them.

Demonstrators will also outline how materials should be discarded and inoculated See Appendix 1, Appendix 2 3. MEDIUM PREPARATION: Your tutor will explain the principles of microbiological culture media and guide you to prepare medium. Microbiological Culture Media The survival and growth of microorganisms depend on available nutrients and a favorable growth environment. In the laboratory, the nutrient preparations that are used for culturing microorganisms are called media (singular, medium).

Three physical forms are used: liquid or broth media; semisolid media; and solid media. The major difference among these media is that solid and semisolid media contain a solidifying agent (usually agar), whereas a liquid medium does not. Liquid media, such as nutrient broth, tryptic soy broth, or brain-heart infusion broth (figure 1.1la), can be used to propagate large numbers of microorganisms in fermentation studies and for various biochemical tests. Semisolid media can also be used in fermentation studies, in determining bacterial motility, and in promoting anaerobic growth.

Solid media, such as nutrient agar or blood agar, are used (1) for the surface growth of microorganisms in order to observe colony appearance, (2) for pure culture isolations, (3) for storage of cultures, and (4) to observe specific biochemical reactions. While in the liquefied state, solid media can be poured into either a test tube or Petri plate (dish). If the medium in the test tube is allowed to harden in a slanted position, the tube is designated an agar slant (figure 1.1b,c); if the tube is allowed to harden in an upright position, the tube is designated an agar deep tube (figure 1.1d); and if the agar is poured into a Petri plate, the plate is designated an agar plate (figure 1. Agar pours (the same as Agar deeps) containing about 15 to 16 ml of media are often used to prepare agar plates.

Microorganisms may be cultured using two different types of media. Chemically defined, or synthetic, media are composed of known amounts of pure chemicals. Such media are often used in culturing autotrophic microorganisms such as algae or nonfastidious heterotrophs. In routine bacteriology laboratory exercises, complex, or nonsynthetic, media are employed.

These are composed of complex materials that are rich in vitamins and nutrients. Three of the most commonly used components are beef extract, yeast extract, and peptones. Different forms of culture media with the proper volume in each. Thermometer La Test tube rack pel (a) Boiling water bath (b) 48° to 50° C water bath (c) Wipe tube with paper towel (d) Flame the top of the tube after removing cap Agar Figure 1.

Pouring agar plates Procedure: In this exercise, students will prepare 4 nutrient agar plates, 2 slant agars and 2 broth. The nutrient agar (containing beef extract, yeast extract, peptone, sodium chloride and agar), has been prepared and sterilized and is provided in melted form, held at 55°C in constant temperature bath. Materials: Bulk nutrient broth Bulk nutrient agar held in class water bath, 55°C Sterile tubes and plates Procedure: a. Label the base of each Petri dish with your group name, medium name and date.

Remove agar from water bath. Gently tip to mix agar. Wipe excess water from outside of bottle. Set out the plastic Petri dishes, lids uppermost, unscrew the cap of the bottle and cover the bottom of each dish with 15-20ml agar, holding the lid so as to provide as much protection as possible during the pouring operation.

Take care to avoid contaminating the opening of the bottle during the pouring operation and replace the lid as each dish is poured. Allow the agar to set before handling. Following the picture to prepare 2 nutrient broth tubes and 2 slant agar tubes Follow your demonstrator’s instruction of how and where to store the medium. Incubate all medium prepared at 37°C in 24 hrs, then put in a fridge.

Tell 10 main rules when working in microbiology Lab? 2. Tell different kinds of medium referring to medium’s liquid status and shapes? 3. Why do we have to incubate medium before storing in a fridge? LABORATORY 2: Aseptic technique Culture technique Subculture 1. ASEPTIC TECHNIQUE This exercise is concerned with those microorganisms which may be deposited on hands, bottles, etc.

through careless manipulations. To be a competent microbiologist, you must be able to transfer microorganisms from one container to another without contaminating the surrounding areas and objects. Aseptic transfer of a culture from one culture vessel to another is successful only if no contaminating microorganisms are introduced in the process. A transfer may involve the transport of organisms from an isolated colony on a plate of solid medium to a broth tube, or inoculating various media (solid or liquid) from a broth culture for various types of tests.

The general procedure is as follows: Work Area Disinfection. The work area is first treated with a disinfectant to kill any microorganisms that may be present. This step destroys vegetative cells and viruses; Endospores, however, are not destroyed in this brief application of disinfectant. Loops and Needles.

The transport of organisms will be performed with an inoculating loop or needle. To sterilize the loop or needle prior to picking up the organisms, heat must be applied with a Bunsen burner flame, rendering them glowing red-hot. Culture Tube Flaming. Before inserting the cooled loop or needle into a tube of culture, the tube cap is removed and the mouth of the culture tube flamed.

Once the organisms have been removed from the tube, the tube mouth must be flamed again before returning the cap to the tube. Liquid Medium Inoculation. If a tube of liquid medium is to be inoculated, the tube mouth must be flamed before inserting the loop into the tube. To disperse the organisms on the loop, the loop should be twisted back and forth in the medium.

If an inoculating needle is used for stabbing a solid medium, the needle is inserted deep into the medium. Once the inoculation is completed, the loop or needle is removed from the tube, flamed as before, and returned to a receptacle. These tools should never be placed on the tabletop. The inoculated tube is also flamed before placing the cap on the tube.

Petri Plate Inoculation. To inoculate a Petri plate, no heat is applied to the plate and a loop is used for the transfer. When streaking the surface of the medium, the cover should be held diagonally over the plate bottom to prevent air contamination of the medium. When all work is finished, the work area is treated with disinfectant to ensure that any microorganisms deposited during any of the procedures are eliminated.

To 7 gain some practice in aseptic transfer of bacterial cultures, three simple transfers will be performed here in this exercise: (1) broth culture to broth, (2) agar slant culture to agar slant, and (3) agar plate to agar slant. Proceed as follows: TRANSFER FROM BROTH CULTURE TO ANOTHER BROTH Do a broth tube to broth tube inoculation, using the following technique.1 illustrates the procedure for removing organisms from a culture, and figure 2.2 shows how to inoculate a tube of sterile broth. Inoculating loop is heated until Organisms in culture are dis- Tube enclosure is removed and it is red-hot. persed by shaking tube, mouth of tube is flamed.

A loopful of organisms is removed Loop is removed from culture Tube enclosure is returned to from tube. and tube mouth Is flamed. Procedure for removing organisms from a broth culture with inoculating loop. Materials: Broth culture of Escherichia coli Tubes of sterile nutrient broth Inoculating loop Bunsen burner Disinfectant for desktop China marking pencil 1.

Prepare your desktop by swabbing down its surface with a disinfectant. With a china marking pencil, label a tube of sterile nutrient broth with your initials and E. Sterilize your inoculating loop by holding it over the flame of a Bunsen burner until it becomes bright red. The entire wire must be heated.

See illustration 1, figure 2.Using your free hand, gently shake the tube to disperse the culture (illustration 2, figure 2. Grasp the tube cap with the little finger of your hand holding the inoculating loop and remove it from the tube. Flame the mouth of the tube as shown in illustration 3, figure 2. Insert the inoculating loop into the culture (illustration 4, figure 2.

1 Cap is removed from sterile broth 2 Unheated loop is inserted into 3 Loop is removed from broth and and tube mouth is flamed. tube of sterile broth. tube mouth is flamed. 4 Tube enclosure is returned to tube.

5 Loop is flamed and returned to receptacle. Procedure for inoculating a nutrient broth. Remove the loop containing the culture, flame the mouth of the tube again (illustration 5, figure 2.1), and recap the tube (illustration 6). Place the culture tube back on the test-tube rack.

Grasp a tube of sterile nutrient broth with your free hand, carefully remove the cap with your little finger, and flame the mouth of this tube (illustration 1, figure 2. Without flaming the loop, insert it into the sterile broth, inoculating it (illustration 2, figure 2. To disperse the organisms into the medium, move the loop back and forth in the tube. Remove the loop from the tube and flame the mouth (illustration 3, figure 2.

Replace the cap on the tube (illustration 4, figure 2. Sterilize the loop by flaming it (illustration 5, figure 2. Return the loop to its container. Incubate the culture you just inoculated at 37° C for 2448 hours.

TRANSFER OF BACTERIA FROM SLANT TO SLANT To inoculate a sterile nutrient agar slant from an agar slant culture, use the following procedure.3 illustrates the entire process. Materials: Agar slant culture of E. coli Sterile nutrient agar slant Inoculating loop Bunsen burner China marking pencil Prepare your desktop by swabbing down its surface with a disinfectant. With a china marking pencil label a tube of nutrient agar slant with your initials and E.

Sterilize your inoculating loop by holding it over the flame of a Bunsen burner until it becomes bright red (illustration 1, figure 2. The entire wire must be heated. Allow the loop to cool completely. Using your free hand, pick up the slant culture of E.

coli and remove the cap using the little finger of the hand that is holding the loop (illustration 2, figure 2. Flame the mouth of the tube and insert the cooled loop into the tube. Pick up some of the culture on the loop (illustration 3, figure 2.3) and remove the loop from the tube Flame the mouth of the tube (illustrations 4 and 5, figure 2.