Luận án: Xây dựng CSDL metagenome dạ cỏ dê & nghiên cứu endo-xylanase

Nghiên cứu xây dựng CSDL DNA metagenome từ hệ vi khuẩn dạ cỏ dê nhằm khai thác, phân tích đặc tính và tiềm năng ứng dụng của enzyme endo-xylanase.

• Tác giả: Đào Trọng Khoa
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dê và khai thác, nghiên cứu tính chất của endo-xylanase
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Kỹ thuật Metagenomics và ứng dụng trong khai thác gene

Metagenomics là một kỹ thuật tiên tiến cho phép các nhà khoa học khai thác và phân tích trực tiếp các gene từ các cộng đồng vi khuẩn trong môi trường tự nhiên mà không cần nuôi cấy từng chủng riêng lẻ. Kỹ thuật này đã mở ra những cơ hội mới trong việc khám phá các enzyme mới và những tính chất sinh học quý giá. Trong lĩnh vực sinh công nghệ, metagenomics được ứng dụng rộng rãi để tìm kiếm các gene mã hóa cho enzyme phân hủy lignocellulose, đặc biệt là từ các hệ vi khuẩn đặc thù như dạ cỏ dê. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh hiệu quả của kỹ thuật này trong việc phát hiện các gene xylanase tiềm năng, góp phần phát triển các ứng dụng công nghiệp trong sản xuất nhiên liệu sinh học và xử lý chất thải.

1.1. Sơ lược chung về kỹ thuật Metagenomics

Metagenomics là phương pháp phân tích toàn bộ thành phần gene của một cộng đồng vi khuẩn. Kỹ thuật này cho phép trích xuất DNA metagenome từ mẫu môi trường, sau đó tiến hành giải trình tự và phân tích bằng các công cụ tin sinh học hiện đại. Ưu điểm chính là khám phá được các chủng vi khuẩn khó nuôi cấy và các gene mới chưa được biết đến.

1.2. Tình hình ứng dụng trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới, metagenomics được ứng dụng phổ rộng trong khai thác enzyme cellulose và xylanase từ các hệ vi khuẩn đa dạng. Tại Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ đã tiến hành các luận án tiến sĩ về xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome dạ cỏ dê, đánh dấu bước tiến quan trọng trong nghiên cứu và khai thác gene enzyme mới.

II. Dạ cỏ dê kho tàng vi khuẩn phân hủy lignocellulose

Dạ cỏ dê là một hệ sinh thái vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng, chứa hàng triệu chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lignocellulose hiệu quả. Các vi khuẩn này sống trong môi trường kỵ khí, phối hợp chặt chẽ để chuyển hóa các thành phần phức tạp của thực vật cellulose, hemicellulose và lignin. Nghiên cứu metagenome dạ cỏ dê giúp xác định và phân lập các gene mã hóa cho enzyme endo-xylanase - những enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy. Sử dụng kỹ thuật metagenomics, các nhà khoa học có thể tạo cơ sở dữ liệu DNA metagenome toàn diện, từ đó khai thác được những gene enzyme mới có tiềm năng ứng dụng cao trong công nghiệp sinh học và sản xuất năng lượng tái tạo.

2.1. Thành phần vi khuẩn trong dạ cỏ dê

Dạ cỏ dê chứa một cộng đồng vi khuẩn cực kỳ phong phú với hàng trăm loài khác nhau. Các vi khuẩn này hoạt động phối hợp để phân hủy các polysaccharide phức tạp thành các hợp chất đơn giản hơn mà dê có thể hấp thụ. Metagenome dạ cỏ dê là một kho tàng vô giá chứa đựng các gene enzyme tiềm năng chưa được khai thác.

2.2. Vai trò của dạ cỏ dê trong nghiên cứu enzyme

Dạ cỏ dê là nguồn lý tưởng để tìm kiếm enzyme endo-xylanase vì tính đa dạng cao và khả năng phân hủy lignocellulose mạnh mẽ. Bằng cách xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome từ dạ cỏ dê, các nhà nghiên cứu có thể phát hiện các gene mới với hiệu suất cao hơn các enzyme hiện biết, mở ra những ứng dụng mới trong công nghiệp.

III. Enzyme endo xylanase tính chất và ứng dụng

Endo-xylanase là một loại enzyme hemicellulase có vai trò quan trọng trong việc phân hủy xylan - một thành phần chính của hemicellulose trong tường tế bào thực vật. Enzyme này hoạt động bằng cách cắt ngẫu nhiên các liên kết nội trong chuỗi xylan, tạo ra những đoạn xylo-oligosacharid và xyloza. Endo-xylanase được phân loại thành nhiều nhóm glycoside hydrolase khác nhau dựa trên độ đặc hiệu và cơ chế tác dụng. Các tính chất của enzyme endo-xylanase như nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, độ bền nhiệt, và hoạt tính động học đều ảnh hưởng đáng kể đến khả năng ứng dụng công nghiệp của nó. Hiện nay, endo-xylanase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, giấy, dệt, và đặc biệt là trong sản xuất nhiên liệu sinh học từ lignocellulose.

3.1. Phân loại và cơ chế hoạt động

Endo-xylanase được phân loại dựa trên độ đặc hiệu cắt, với các loại chính là Glycoside Hydrolase (GH) gia đình 10, 11 và 30. Mỗi loại có cơ chế tác dụng khác nhau: GH11 cắt ngẫu nhiên trên xương sống xylan, trong khi GH10 có độ đặc hiệu thấp hơn. Tính chất động học của mỗi enzyme khác nhau, ảnh hưởng đến hiệu quả phân hủy lignocellulose.

3.2. Ứng dụng công nghiệp của endo xylanase

Endo-xylanase có nhiều ứng dụng công nghiệp quan trọng: trong công nghiệp giấy, enzyme này giúp tăng độ trắng và cải thiện độ dẫn nước; trong công nghiệp dệt, nó loại bỏ hemicellullose từ sợi vải; trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme giúp phân hủy lignocellulose hiệu quả hơn, giảm chi phí xử lý.

IV. Phương pháp khai thác và nghiên cứu tính chất enzyme từ metagenome

Quy trình khai thác enzyme endo-xylanase từ metagenome dạ cỏ dê bao gồm nhiều bước liên tiếp. Đầu tiên, tách chiết DNA metagenome từ mẫu dạ cỏ dê, sau đó thực hiện giải trình tự gene và phân tích bằng các công cụ tin sinh học như HMM (Hidden Markov Model) để xác định các gene endo-xylanase tiềm năng. Các gene được tổng hợp và chèn vào vector biểu hiện để biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Protein được tinh chế bằng sắc kí ái lực và các tính chất được đánh giá chi tiết. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại lên hoạt tính enzyme, cùng với xác định độ bền nhiệt và thông số động học là những bước quan trọng để hiểu rõ tính chất của endo-xylanase. Những kết quả này cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng công nghiệp enzyme trong các lĩnh vực khác nhau.

4.1. Tách chiết và xác định gene từ metagenome

Bước đầu tiên là tách chiết DNA metagenome từ mẫu dạ cỏ dê bằng các phương pháp sinh học phân tử tiêu chuẩn. Sau đó, sử dụng giải trình tự đa hệ gene và công cụ chú giải gene như HMM, các gene mã hóa endo-xylanase được xác định. Cơ sở dữ liệu DNA metagenome được xây dựng để lưu trữ và tìm kiếm các gene mới.

4.2. Biểu hiện tinh chế và đánh giá tính chất enzyme

Các gene endo-xylanase được tổng hợp và chèn vào vector để biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Protein được tinh chế bằng sắc kí ái lực His-tag, sau đó xác định hoạt tính enzyme, ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại, độ bền nhiệt và thông số động học bằng các phương pháp hóa sinh tiêu chuẩn để đánh giá toàn diện tính chất của enzyme.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Thực tế hiện nay, nhiên liệu hóa thạch (than đá, dầu mỏ, khí đốt.) vẫn đóng vai trò lớn chi phối sự phát triển của kinh tế thế giới nhiều năm qua. Qua nhiều năm khai thác, các nguồn nhiên liệu này đang ngày càng cạn kiệt và việc sử dụng chúng gây ra nhiều hậu quả tiêu cực về môi trường sống. Nhằm điều chỉnh thích ứng với biến đổi khí hậu, kiềm chế sự nóng lên toàn cầu, bảo đảm phát triển bền vững, nhiều quốc gia trên thế giới đã đi theo hướng sử dụng nhiên liệu tái tạo thay thế cho nhiên liệu hóa thạch và trong đó phải kể đến nhiên liệu sinh học [1]. Lignocellulose, một trong những nguồn nguyên liệu tái tạo dồi dào trên Trái Đất tích trữ trong các phụ phẩm sản xuất nông lâm nghiệp như thân cây, lá cây… Phần lớn các loại rác thải này bị đốt bỏ, gây lãng phí và ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng môi trường sống cũng như sức khỏe của người dân.

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, lignocellulose có thể được chuyển hóa thành nhiên liệu sinh học và các chất có giá trị khác thay thế cho nguồn nguyên, nhiên liệu không thay thế, phục vụ phát triển kinh tế xã hội. Điển hình, furfural và 5- hydroxymethylfurfural - một trong những sản phẩm được chuyển hóa từ lignocellulose - được dùng để điều chế rất nhiều loại dung môi, polymer, nhiên liệu và các hợp chất hữu ích khác [2]. Vì vậy, việc tận dụng nguồn nguyên liệu dư thừa này không những làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn góp phần giải quyết nhu cầu năng lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập tại chỗ cho nông dân. Trong những năm gần đây, chúng ta đã có nhiều giải pháp để tận dụng được nguồn sinh khối trên.

Tuy nhiên, trên thực tế, lignocellulose là sinh khối rắn chắc khó chuyển hóa và đường hóa. Việc chuyển hóa lignocellulose trong công nghiệp hiện nay chủ yếu bằng các phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, có giá thành cao và chưa thực sự hiệu quả và khó xử lý các chất thải hóa học. Hướng xử lý phân giải lignocellulose bằng phương pháp sinh học thân thiện với môi trường ngày càng được xem trọng và ứng dụng rộng rãi. Vấn đề khai thác những enzyme phân giải lignocellulose (gọi chung là lignocellulase) có hoạt tính cao đã và đang là một trong những hướng nghiên cứu trọng tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới.

Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng đã từ lâu được nghiên cứu chứng minh có rất nhiều ứng dụng thực tiễn trong các lĩnh vực của đời sống con người bao gồm sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, xử lý môi trường, khai thác vật liệu mới, sản xuất các chế phẩm y dược học… Vi khuẩn khu trú trong các khu hệ giàu lignocellulose như mùn đất [3], đường tiêu hóa của động vật nhai lại [4],… được xác định là những nguồn tiềm năng để khai thác gene nói chung và gene phân giải 2 lignocellulose nói riêng vì sự đa dạng và phong phú của chúng. Tuy nhiên, thực tế hiện tại 99% các loài vi sinh vật vẫn chưa thể phân lập và nuôi cấy được. Để khắc phục hạn chế đó, kỹ thuật Metagenomics cho phép nghiên cứu và đánh giá trực tiếp và tổng thể tất cả các loài vi sinh vật trong mẫu mà không cần nuôi cấy [5]. Vì vậy đây là nguồn gene quan trọng cho khai thác các gene mã hóa lignocellulase.

Trong tự nhiên, nhiều loài sinh vật có khả năng thủy phân lignocellulose nhờ cấu trúc hệ cellulosome gồm nhiều loại enzyme thủy phân lignocellulose tạo cấu trúc theo trật tự phân cắt nhất định gắn trên bề mặt tế bào. Ví dụ cellulosome của C. cellulovorans có mang các enzyme cellulase, hemicellulase, pectinase, chitinase và nhiều enzyme phụ trợ khác để phân giải thành tế bào thực vật [6]. Các vi khuẩn thuộc ngành Bacteroidetes đặc biệt là chi Prevotella lại có các vùng sử dụng polysaccharide (PUL-polysaccharide ultilization loci) mang một chuỗi gene mã hóa nhiều loại enzyme khác nhau giúp tế bào chuyển hóa lignocellulose thành đường đơn.

Cellulosome và PUL được tìm thấy rất phong phú, đa dạng trong dạ cỏ dê, tuần lộc nhưng celulosome chưa tìm thấy trong dạ cỏ của động vật nhai lại khác như trâu, bò. Vì vậy, hệ sinh thái mini của dạ cỏ dê nuôi ở Việt Nam là một trong những hệ rất tiềm năng, chưa được nghiên cứu nhiều. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện để giải mã DNA đa hệ gene vi khuẩn trong dạ cỏ dê (giải mã tạo bộ dữ liệu nhỏ, thông thường (dung lượng khoảng 8-10 Gb) và giải mã sâu (dung lượng trên 40 Gb) để đánh giá khả năng khai thác gene của cả hai bộ dữ liệu) và tìm cách tiếp cận mới nhằm khai thác hiệu quả enzyme phân giải lignocellulose, bao gồm các nhóm enzyme tiền xử lý, enzyme phân giải cellulose, hemicellulose và lignin. Do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài luận án: “Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dê và khai thác, nghiên cứu tính chất của endo- xylanase”.

 Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng được bộ dữ liệu DNA metagenome của hệ vi khuẩn dạ cỏ dê; - Biểu hiện và nghiên cứu được tính chất của một endo-xylanase mã hóa từ gene trong bộ dữ liệu gene chức năng phân giải lignocellulose từ mẫu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê.  Nội dung nghiên cứu: Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu chính sau: 1. Nghiên cứu giải mã DNA đa hệ gene của vi khuẩn trong dạ cỏ dê với dung lượng 3 thông thường (8-10 Gb) và dung lượng lớn (giải mã sâu, 45-50 Gb), xây dựng bộ dữ liệu và đánh giá đa dạng vi khuẩn trong dạ cỏ dê; 2. Khai thác gene và thiết lập công cụ HMM chú giải chức năng gene cho khai thác gene mã hóa enzyme/protein tham gia chuyển hóa lignocellulose.

Nghiên cứu lựa chọn gen, biểu hiện và xác định đặc điểm endo-xylanase mã hóa bởi gene trong dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê.  Ý nghĩa khoa học thực tiễn của Luận án: * Ý nghĩa khoa học: - Bộ dữ liệu giải mã sâu DNA metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê là bộ dữ liệu rất lớn, với sự đa dạng của vi khuẩn và gene mã hóa các loại enzyme tham gia vào nhiều con đường chuyển hóa khác nhau. Bộ dữ liệu là nguồn gene giá trị cho việc khai thác tìm kiếm các enzyme/protein mới có thể ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp và y dược. - Đã làm chủ phương pháp xây dựng mô hình Markov ẩn (HMM), thiết lập thành công quy trình khai thác, chú giải gene dựa trên các công cụ tin sinh để khai thác nhanh và chính xác các enzyme/protein mới từ dữ liệu DNA đa hệ gen.

- Xác định được vai trò quan trọng của chi vi khuẩn Prevotella sinh enzyme/protein phân giải lignocellulose giúp tăng cường chuyển hóa thức ăn của dê dựa trên kết quả khai thác gene từ dữ liệu DNA đa hệ gen. * Ý nghĩa thực tiễn: - Đã biểu hiện được enzyme endo-xylanase có hoạt tính cao, có thể sử dụng để phối trộn với các enzyme khác để làm tăng chuyển hóa lignocellulose thành đường, phục vụ cho thử nghiệm sản xuất ethanol.  Những đóng góp mới của Luận án: 1. Đã xây dựng được bộ dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê với dung lượng 48,66 Gb và lần đầu tiên vai trò của Prevotella trong việc tăng cường tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ dê đã được phân tích sâu và gợi ý làm rõ.

Lần đầu tiên, luận án đã xây dựng được công cụ mô hình Markov ẩn (HMM) cho chú giải chức năng của nhóm gene mã hóa vùng liên kết carbohydrate (CBM) và một số enzyme tham gia tiền xử lý lignocellulose, cellulase, hemicellulase. Endo-xylanase EXL mã hóa từ gene của vi khuẩn Prevotella trong dạ cỏ dê đã được biểu hiện, tinh sạch thành công với hoạt tính cao. Kỹ thuật Metagenomics nhằm khai thác hiệu quả gene tiềm năng 1. Sơ lược chung về kỹ thuật Metagenomics Thuật ngữ ”Metagenomics” được sử dụng lần đầu vào năm 1998 để chỉ các nghiên cứu về toàn bộ hệ gene của tất cả các vi sinh vật trong một khu hệ môi trường, ngược với hướng tiếp cận chỉ phân lập và nuôi cấy một loài vi sinh vật duy nhất in vitro [7].

Kỹ thuật Metagenomics khắc phục được nhược điểm của những phương pháp nghiên cứu truyền thống về phân lập, với thực tế là hiện nay, vẫn chưa có phương pháp thích hợp để nuôi cấy và phân lập thành công hơn 99% số vi sinh vật trong sinh quyển [5]. Về nguyên tắc, bất kỳ nghiên cứu nào hướng đến đối tượng là tất cả các cá thể trong một quần xã vi sinh vật như là một nguồn DNA duy nhất đều được coi là nghiên cứu metagenomics [8]. Hiện nay kỹ thuật Metagenomics đã và đang được sử dụng ngày càng nhiều để nghiên cứu đa dạng vi sinh vật của nhiều khu hệ sinh thái như môi trường suối nước nóng [9], môi trường biển [10], môi trường đất [11], môi trường bên trong cơ thể người và động vật - hệ vi sinh vật khu trú trong hệ tiêu hóa của người [12] hay các động vật nhai lại [13]. Mối tương tác giữa các loài sinh vật cộng sinh trong đường tiêu hóa của động vật nhai lại được thể hiện mạnh mẽ trong quá trình phân giải các hợp chất lignocellulose, vì vậy đây là đối tượng tiềm năng cho việc nghiên cứu khai thác các gene mới mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa sinh khối thực vật [14].

Phương pháp nghiên cứu metagenomics gồm hai hướng tiếp cận chính, bao gồm hướng tiếp cận theo chức năng và hướng tiếp cận theo trình tự. Hướng tiếp cận theo chức năng dựa vào việc xây dựng một thư viện vật lý các đoạn trình tự DNA từ mẫu DNA metagenome sau khi đã được tách chiết, trong đó các đoạn trình tự này được tách dòng trong các vector có thể chèn những đoạn kích thước lớn (vector cosmid hoặc fosmid) [15], biểu hiện trong hệ vật chủ phổ biến sau đó tiến hành sàng lọc để tìm những dòng thể hiện hoạt tính sinh học mong muốn. Hạn chế lớn của phương pháp này là hầu hết các gene không được biểu hiện, tạo sản phẩm protein hoàn chỉnh trong những chủng vi khuẩn xác định chuyên dùng để tách dòng, ví dụ như E. coli, mặc dù có rất nhiều gene từ các nguồn vi sinh vật khác nhau đã được biểu hiện thành công trong đối tượng này [16].

Đây vẫn là rào cản cực lớn khiến cho việc thu nhận thông tin nghiên cứu metagenome bằng phương pháp này bị hạn chế. Một hạn chế nữa của phương pháp này là tần số dòng có hoạt tính mong 5 muốn từ thư viện DNA metagenome là rất thấp.