Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Mai quang hưng tổng hợp một số n hydroxyhexanami

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ năm 2018 về tổng hợp dẫn xuất N-hydroxyhexanamid chứa khung 1-triazol-4-yl-methylindolin-2-on có hoạt tính kháng ung thư

• Tác giả: Mai Quang Hưng
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Hải Nam
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Tổng hợp một số N-hydroxyhexanamid mang khung 1-(triazol-4-yl) methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Khóa luận Mai Quang Hưng

Khóa luận tốt nghiệp của Mai Quang Hưng tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2018 tập trung vào tổng hợp N-hydroxyhexanamid mang khung 1-(triazol-4-yl) methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư. Đây là một công trình nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực hóa dược và hóa học dược phẩm. Dưới sự hướng dẫn của các giáo sư Đỗ Thị Mai Dung và Phan Thị Phương Dung, tác giả đã thực hiện các thí nghiệm tại Bộ môn Hóa Dược và các cơ sở nghiên cứu quốc tế. Công trình này không chỉ đóng góp vào lĩnh vực tổng hợp hóa học mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới cho các chất ức chế HDAC trong điều trị ung thư.

1.1. Bối cảnh và mục đích nghiên cứu

Tổng hợp N-hydroxyhexanamid là một hướng đi tiềm năng trong phát triển thuốc kháng ung thư mới. Khóa luận này nhằm tổng hợp các dẫn chất mới có khung indolin-2-on kết hợp với triazol để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Mục đích chính là đánh giá khả năng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư của các hợp chất được tổng hợp, từ đó phát triển các phương pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn.

1.2. Ý nghĩa của công trình

Công trình của Mai Quang Hưng có ý nghĩa quan trọng trong việc khám phá các chất ức chế HDAC mới (HDACi) với cấu trúc độc đáo. Sự kết hợp giữa acid hydroxamic và khung 1,2,3-triazol tạo ra các hợp chất tiềm năng cao trong việc chữa trị các bệnh ung thư. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quý báu về mối liên hệ cấu trúc-tác dụng của các hợp chất này.

II. Phương pháp tổng hợp và các chất được tổng hợp

Tổng hợp N-hydroxyhexanamid được thực hiện thông qua các phản ứng hóa học có kiểm soát cao, sử dụng phản ứng Click với xúc tác đồng để tạo vòng 1,2,3-triazol. Khóa luận này đã tiến hành khảo sát hiệu suất phản ứng với nhiều dung môi khác nhau như acetonitril (MeCN) và dimethylsulfoxid (DMSO). Quá trình tổng hợp được chia thành các bước chính: tổng hợp dẫn chất azid, phản ứng Click để tạo vòng triazol, và cuối cùng là tổng hợp N-hydroxyhexanamid. Các sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và khẳng định cấu trúc bằng NMR và HRMS.

2.1. Tổng hợp vòng 1 2 3 triazol bằng phản ứng Click

Phản ứng Click là phương pháp hiệu quả để tạo vòng 1,2,3-triazol. Trong công trình này, các nhà nghiên cứu sử dụng xúc tác [CuBr(PPh3)3] để thúc đẩy phản ứng giữa azid và alkyne. Khảo sát các dung môi cho thấy DMSO và acetonitril đạt hiệu suất tốt nhất. Phương pháp này cho phép kiểm soát chính xác vị trí và chỗ gắn nhưng của vòng triazol trên cấu trúc phân tử.

2.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

Acid hydroxamic được tổng hợp từ các dẫn chất ester thông qua phản ứng với hydroxylamine trong điều kiện kiềm. Phương pháp này đạt hiệu suất cao và cho phép tạo ra các hợp chất mang nhóm N-hydroxyamide cần thiết cho hoạt tính ức chế HDAC. Các sản phẩm được cấu trúc xác định bằng các phương pháp phân tích hiện đại như IR, 1H-NMR, 13C-NMR.

III. Đánh giá hoạt tính sinh học và kết quả thử nghiệm

Các dẫn chất được tổng hợp đã được đánh giá hoạt tính sinh học thông qua hai phương pháp chính: thử ức chế HDAC và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro. Khóa luận này kiểm tra tác dụng của các hợp chất trên các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm AsPC-1 (ung thư tuyến tụy), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), và SW620 (ung thư đại tràng). Kết quả cho thấy một số dẫn chất thể hiện hoạt tính kháng ung thư đáng chú ý, với IC50 ở mức nanoM. So sánh với chất tham chiếu SAHA (Acid sulberoylanillid hydroxamic) cho thấy một số hợp chất đạt hoạt tính tương đương hoặc cao hơn.

3.1. Thử hoạt tính ức chế HDAC

Ức chế HDAC là cơ chế tác dụng chính của các N-hydroxyhexanamid được tổng hợp. Phương pháp thử hoạt tính ức chế này sử dụng các enzyme HDAC được biệt lập từ tế bào. Kết quả cho thấy các dẫn chất VIa-d thể hiện khả năng ức chế HDAC khác nhau, phụ thuộc vào cấu trúc indolin-2-on và độ dài chuỗi hexanamid. Phân tích docking hóa học cho thấy tương tác mạnh mẽ giữa nhóm hydroxamic và kẽm tại vị trí hoạt động của enzyme.

3.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

Hoạt tính kháng tế bào ung thư được đánh giá thông qua thử MTT trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Các dẫn chất được kiểm tra cho khả năng cản trở sự tăng trưởng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy một số hợp chất có IC50 rất thấp (dưới 10 μM), chỉ ra tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc kháng ung thư mới. Các kết quả này hỗ trợ tiếp tục nghiên cứu những hợp chất này trong các giai đoạn phát triển dược lâm sàng.

IV. Kết luận và kiến nghị phát triển tiếp theo

Khóa luận tổng hợp N-hydroxyhexanamid của Mai Quang Hưng đã đạt được những kết quả quan trọng trong việc phát triển các chất ức chế HDAC mới với hoạt tính kháng ung thư cao. Công trình đã thành công trong việc tổng hợp hóa học các dẫn chất mới, khẳng định cấu trúc chi tiết, và đánh giá hoạt tính sinh học toàn diện. Các hợp chất được tổng hợp thể hiện tiềm năng lớn cho ứng dụng trong điều trị ung thư. Tuy nhiên, để tiến tới phát triển thuốc lâm sàng, cần thực hiện thêm các nghiên cứu về độc tính, dược động học, và hiệu quả in vivo. Kiến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo bao gồm tối ưu hóa cấu trúc, khảo sát SAR (Structure-Activity Relationship), và tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật.

4.1. Những đạt được chính của nghiên cứu

Công trình đã đạt được tổng hợp thành công 16 dẫn chất N-hydroxyhexanamid mang khung indolin-2-on-triazol. Tất cả các hợp chất đã được xác định cấu trúc bằng NMR và HRMS với độ tinh khiết cao (>95%). Kết quả sinh học cho thấy hoạt tính ức chế HDAC mạnh mẽ và hoạt tính kháng ung thư đáng khích lệ. Những phát hiện này đóng góp quan trọng vào lĩnh vực khoa học dược phẩm và phát triển thuốc kháng ung thư tại Việt Nam.

4.2. Hướng phát triển và ứng dụng tương lai

Các hợp chất được tổng hợp có tiềm năng trở thành thuốc kháng ung thư mới. Kiến nghị bao gồm: (1) Tối ưu hóa cấu trúc để tăng selectivity và giảm độc tính; (2) Nghiên cứu cơ chế tác dụng chi tiết tại mức độ phân tử; (3) Đánh giá dược động học và dược lực học in vivo; (4) Tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng trên các mô hình ung thư khác nhau để chuẩn bị cho giai đoạn thử nghiệm lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN 1. HDAC và các chất ức chế HDAC 1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc nhiễm sắc thế (NST) đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa và biểu hiện gen [26, 9]. Trong đó các enzym tham gia vào quá trình phiên mã và dịch mã của NST như: kinase, methyltranferase, histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) đóng vai trò quan trọng do sự tác động của chúng lên cấu trúc phần đuôi histon của NST.

Histon transferase (HAT) là nhóm các enzym có tác dụng acetyl hóa lên đầu N (nhóm ε-NH2 của lysin), gây trung hòa điện tích, làm giảm khả năng liên kết tĩnh điện với ADN (mang điện tích âm), do đó làm cấu trúc của chromatin duỗi ra và tháo xoắn. HAT là enzym khởi đầu cho quá trình phiên mã [15]. Đối lập với HAT, histon deacetylase (HDAC) gây deacetyl hóa đầu N của histon, do đó tạo thành điện tích trên đầu N và làm NST xoắn lại do tương tác tĩnh điện, làm ức chế quá trình phiên mã [14]. Hai enzym này có tác dụng ngược nhau nhưng có vai trò cực kì quan trọng trong quá trình điều hòa và biểu hiện gen.

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự hoạt động quá mức của enzym HDAC có thể tác động đến quá trình gây ung thư, bao gồm cả việc hình thành nên các khối u ác tính [34]. Chính vì vậy, ức chế hoạt động quá mức của HDAC có tác động tốt trong việc điều trị một số bệnh ung thư như: u lympho tế bào B, T, ung thư biểu mô thận, u trung biểu mô, ung thư biểu mô vẩy. Phân loại các HDAC Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra cấu trúc của 18 loại enzym HDAC khác nhau có trong cơ thể người và chia thành 4 nhóm chính [6, 24, 5] (xem hình 1.1): - Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8. - Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10.

- Nhóm III: Sirtuin 1-7. - Nhóm IV: HDAC-11. Phân loại các HDAC. Nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển” - là những enzym phụ thuộc Zn2+.

Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy vì có cơ chế hoạt động khác phụ thuộc vào NAD+ [5]. Cấu trúc của HDAC và cơ chế deacetyl hóa Việc xác định cấu trúc của HDAC là vô cùng quan trọng trong việc tìm hiểu cơ chế tác dụng và thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC. Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X đã xác định được cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC gồm 2 phần chính là: kênh enzym và ion Zn2+.

- Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, có khả năng tạo nhiều liên kết Van der Waals với cơ chất. Túi được tạo thành từ các acid amin có nhân thơm như: phenylalanin (Phe), tyrosin (Tyr), histidin (His) và prolin (Pro). Đáy túi có một vài 2 phân tử nước làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo liên kết hydro trong trường hợp không có mặt nhóm -OH của Tyr. Túi có kích thước khá linh động, có thể biến đổi sao cho phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau.

Chiều rộng của túi được giới hạn bởi 2 vòng thơm được tìm thấy ở cùng một vị trí ở các HDAC khác nhau. Trên bề mặt túi có một vành nhỏ được tạo thành bởi một vài vòng xoắn của protein. Vành nhỏ này sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của các chất ức chế. Các hợp chất hydroxamic có chiều dài cầu nối khoảng 5- 6 liên kết carbon là tối ưu với chiều dài của kênh enzym [31].

- Ion Zn2+ là coenzym quan trọng của HDAC, được tìm thấy ở đáy kênh enzym. Đây là thành phần tham gia tạo liên kết mạnh nhất với đầu N của histon thông qua liên kết phối trí. Kết quả phân tích kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X đã xác định ion Zn2+ có thể tạo được tối đa 5 liên kết phối trí, trong đó 1 liên kết với nguyên tử oxy của nhóm acetyl-lysin, 4 liên kết còn lại được tạo với các nguyên tử oxy, nitơ ở đáy túi giúp cố định coenzym. Cơ chế ức chế HDAC của các acid hydroxamic là tạo liên kết phối trí mạnh với ion Zn2+, ngăn cản ion Zn2+ này tạo liên kết với nhóm acetyl đầu N của histon, do đó ức chế việc đóng xoắn của NST.

Các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [31]. Các chất ức chế HDAC (HDACi) 1. Phân loại các chất ức chế HDAC Trichostatin A (TSA) là chất ức chế HDAC đầu tiên được tìm thấy bởi nhà khoa học Yoshida vào năm 1990 [30]. Từ đó đến nay, rất nhiều hợp chất khác có tác dụng ức chế HDAC đã được tìm thấy.

Về cấu trúc hóa học, các hợp chất này có thể chia thành 6 nhóm chính [28, 36]: - Các acid hydroxamic: một số chất quan trọng có thể kể đến như: trichostatin A (TSA), SAHA, belinostat và panobinostat. Trong đó, TSA là hydroxamic đầu tiên được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC và cho đến nay vẫn là một trong số rất ít các chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh [11]. Tuy nhiên do chi phí sản xuất cao và hiệu suất tổng hợp thấp nên ít được sử dụng (xem hình 1. Một số acid hydroxamic ức chế HDAC.

- Các aminobenzamid: đại diện là các chất như MS-275, CI-994 và MGCD0103. Trong đó, MS-275 có tác dụng ức chế HDAC1, HDAC2 và HDAC3 ở nồng độ μM. MGCD0103 là benzamid thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc trên HDAC nhóm I và IV, không có tác dụng trên HDAC nhóm II [23] (xem hình 1. Một số aminobenzamide ức chế HDAC.

- Các muối carboxylat mạch ngắn: tác dụng ức chế HDAC của nhóm này tương đối yếu, gồm các dẫn chất như các muối butyrat, phenylbutyrat, acid valproic (có tác dụng ở nồng độ mM) [18] (xem hình 1. Một số muối carboxylat ức chế HDAC. - Các peptid vòng: đại diện của nhóm này là depsipeptid, đã được FDA cấp phép cho điều trị u lympho T ở da (CTCL) năm 2009. Depsipeptid là dạng tiền thuốc, khi vào tế bào chuyển hoá thành dạng chứa nhóm sulfhydryl hoạt động, có khả năng 4 gắn Zn2+ ức chế HDAC, đặc biệt là HDAC1, HDAC2 [13] (xem hình 1.

Cấu trúc depsipeptid. - Các epoxyceton: trapoxin B, HC-toxin và acid 2-amino-8-oxo-9,10- epoxydecanoic (AOE) là các chất này có khả năng ức chế HDAC mạnh ở nồng độ cỡ nM. Cơ chế tác động là do sự thay đổi vị trí hoạt động ái nhân với nhóm epoxy và hình thành liên kết hydro với nhóm ceton làm mất hoạt động của những phân tử này. Sự phối hợp của peptid vòng và epoxyceton dẫn đến ức chế hoạt động của HDAC ở nồng độ nM [10] (xem hình 1.

Một số epoxyceton ức chế HDAC. - Các phân tử lai: có cấu trúc peptid vòng gắn với hydroxamat no mạch thẳng, điển hình là CHAP31 và CHAP50. Các chất này có khả năng ức chế HDAC tốt ở nồng độ cỡ 1 - 5 nM. Cầu nối tối ưu nhất trong các dẫn chất này đều có 5 nhóm methylen, giống như những mô tả trước đó của các hydroxamat [10].

Cấu trúc các chất ức chế HDAC Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC thường gồm 3 phần chính [12] (xem hình 1.7): - Nhóm nhận diện bề mặt hay còn gọi là nhóm mũ kỵ nước (hydrophobic cap 5 group - HCG): thường là các peptid vòng hoặc vòng thơm, có vai trò tham gia vào quá trình nhận diện acid amin tại bề mặt của enzym. - Vùng cầu nối (hydrophobic linker - HYL): thường là các nhóm sơ nước như hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hay mạch vòng, no hoặc không no. Phần này có vai trò trong việc tạo liên kết Van der Waals với vùng thân túi của kênh enzym. - Nhóm liên kết gắn với kẽm (Zinc-binding moiety - ZBM): có thể là các acid hydroxamic, các thiol hay o-aminoanilin của benzamid… Nhóm này có vai trò tạo liên kết với ion Zn2+ ở đáy túi enzym ức chế quá trình gắn với acetyl-histon.

Một số nghiên cứu cho thấy các chất ức chế HDAC thuộc nhóm acid hydroxamic còn có thể có thêm nhóm liên kết (connecting unit) có nhiệm vụ kết nối nhóm nhận diện bề mặt với vùng cầu nối sơ nước như nhóm amid ở SAHA [14]. Chú thích: HCG (hydrophobic cap group): nhóm mũ kỵ nước. HYL (hydrophobic linker): cầu nối kỵ nước. ZBM (Zinc-binding moiety): nhóm liên kết gắn kẽm.

Mô hình mô tả cấu trúc chung của hợp chất ức chế HDAC. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC 1. Ảnh hưởng của cấu trúc nhóm nhận diện bề mặt Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt có ảnh hưởng lớn đối với hoạt tính kháng 6 ung thư của các HDACi. Các phân tử không có nhóm bề mặt kỵ nước sẽ cho hoạt tính yếu hơn hẳn [32].

Dựa trên cấu trúc của SAHA, Julave và cộng sự đã đi đến kết luận rằng sự có mặt của nhóm phenyl ở vùng nhận diện bề mặt làm tăng hoạt tính của dẫn chất. Đối với các nhóm thế nếu thêm một nhóm thế thân nước vào vùng cầu nối gần nhóm phenyl cũng làm tăng hoạt tính. Tuy nhiên, nếu nhóm này nằm cạnh nhóm khóa hoạt động (acid hydroxamic) thì sẽ làm giảm hoạt tính đi đáng kể. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc thay thế nhóm phenyl bằng các nhóm giàu mật độ electron khác đều góp phần làm tăng hoạt tính [17].

Ảnh hưởng của cấu trúc vùng cầu nối - Ảnh hưởng của chiều dài vùng cầu nối: Vùng hoạt động của HDAC có dạng hình túi hẹp, chiều dài từ 4-6 C, kỵ nước, với phần đáy túi là ion Zn2+. Do vậy, chiều dài vùng cầu nối của các HDACi là rất quan trọng quyết định đến hoạt tính của dẫn chất. Chiều dài phù hợp sẽ đưa nhóm khóa hoạt động đến vị trí thích hợp để tạo liên kết với ion Zn2+ và đặt nhóm nhận diện bề mặt ở vị trí tạo liên kết thuận lợi với bề mặt túi enzym. Chính vì thế, các HDACi có chiều dài vùng cầu nối 4-6 C thường cho hoạt tính tốt hơn [16].

Trong một nghiên cứu của Andriannov và cộng sự thực hiện vào năm 2009, khi thiết kế tổng hợp khoảng 40 dẫn chất amid ngược (AH8) của SAHA (hình 1.8), tác giả đã đi đến kết luận các chất có vùng cầu nối 5-6 C cho hoạt tính tốt hơn cả [3]. Các dẫn chất amid ngược của SAHA.