Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do e coli dung huyết gây ra, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất

• Tác giả: Hoàng Thị Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Như Quán
• Trường học: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli dung huyết gây ra theo quy mô công nghiệp
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu tổng quát
• 2.2. Mục tiêu cụ thể
• 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 4. THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN E. COLI
• 5.1.1. Phân loại
• 5.1.2. Kháng nguyên
• 5.1.3. Các yếu tố gây bệnh

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E

Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli là một trong những vấn đề cấp thiết trong ngành chăn nuôi lợn hiện nay. Bệnh phù đầu lợn do vi khuẩn E. coli gây ra đã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi, đặc biệt là trong giai đoạn lợn con trước và sau cai sữa. Việc phát triển vaccine hiệu quả không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Nghiên cứu này nhằm đánh giá quy trình sản xuất vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn, từ đó cung cấp giải pháp phòng bệnh hiệu quả cho ngành chăn nuôi.

1.1. Tình hình bệnh phù đầu lợn do E. coli tại Việt Nam

Bệnh phù đầu lợn do E. coli là một trong những bệnh phổ biến và nguy hiểm nhất trong chăn nuôi lợn. Tình hình dịch bệnh diễn ra phức tạp, với tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở lợn con. Các triệu chứng điển hình bao gồm phù nề, thần kinh và tỷ lệ chết cao. Việc phát hiện sớm và áp dụng biện pháp phòng ngừa là rất cần thiết.

1.2. Vai trò của vaccine trong phòng bệnh phù đầu lợn

Vaccine đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa bệnh phù đầu lợn do E. coli. Việc sử dụng vaccine không chỉ giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh mà còn tăng cường sức đề kháng cho đàn lợn. Nghiên cứu cho thấy vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn có hiệu quả cao trong việc phòng ngừa bệnh này.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về vaccine phòng bệnh phù đầu lợn, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong quy trình sản xuất và kiểm nghiệm. Các vấn đề như chất lượng giống vi khuẩn, quy trình sản xuất và bảo quản vaccine cần được cải thiện để đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người tiêu dùng.

2.1. Chất lượng giống vi khuẩn E. coli trong sản xuất vaccine

Chất lượng giống vi khuẩn E. coli là yếu tố quyết định đến hiệu quả của vaccine. Việc lựa chọn các chủng vi khuẩn có độc lực cao và khả năng sinh kháng nguyên tốt là rất quan trọng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn được phân lập từ lợn mắc bệnh có khả năng sản xuất vaccine hiệu quả hơn.

2.2. Quy trình sản xuất vaccine và kiểm nghiệm

Quy trình sản xuất vaccine cần được thực hiện theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn và hiệu quả. Các bước từ nuôi cấy, bổ sung keo phèn, đến đóng chai và bảo quản vaccine đều cần được kiểm soát chặt chẽ. Việc kiểm nghiệm vaccine cũng cần được thực hiện để đánh giá tính an toàn và hiệu lực trước khi đưa vào sử dụng.

III. Phương pháp nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp hiện đại trong sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, kiểm nghiệm độc lực và sản xuất vaccine theo quy mô công nghiệp. Mục tiêu là tạo ra vaccine an toàn, hiệu quả và dễ dàng trong việc sử dụng.

3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E. coli

Việc nuôi cấy vi khuẩn E. coli được thực hiện trong môi trường thạch máu và môi trường lỏng. Các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian cần được tối ưu hóa để đạt được mật độ vi khuẩn cao nhất. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng môi trường thạch máu giúp tăng cường khả năng sinh trưởng của vi khuẩn.

3.2. Phương pháp kiểm nghiệm độc lực của vi khuẩn

Kiểm nghiệm độc lực của vi khuẩn E. coli được thực hiện trên chuột thí nghiệm. Các chỉ tiêu như tỷ lệ chết và thời gian sống sót được ghi nhận để đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn có độc lực cao đều có khả năng gây bệnh mạnh trên lợn.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của vaccine

Kết quả nghiên cứu cho thấy vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli có hiệu quả cao trong việc phòng ngừa bệnh. Các thử nghiệm trên lợn cho thấy tỷ lệ an toàn và hiệu lực bảo vệ đạt yêu cầu. Vaccine đã được đưa vào sản xuất và sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi.

4.1. Kết quả kiểm nghiệm vaccine trên chuột thí nghiệm

Kết quả kiểm nghiệm cho thấy vaccine đạt tỷ lệ an toàn 100% trên chuột thí nghiệm với liều tiêm 0.5ml. Hiệu lực bảo vệ đạt từ 70-90%, cho thấy vaccine có khả năng phòng ngừa bệnh hiệu quả.

4.2. Ứng dụng vaccine trong chăn nuôi lợn

Vaccine đã được áp dụng trong thực tiễn chăn nuôi lợn tại nhiều địa phương. Việc sử dụng vaccine giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Nghiên cứu cũng cho thấy vaccine có thể tạo miễn dịch lâu dài cho lợn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu vaccine

Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli đã đạt được nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện quy trình sản xuất và nâng cao hiệu quả của vaccine. Tương lai, vaccine này có thể trở thành giải pháp chính trong việc phòng ngừa bệnh phù đầu lợn tại Việt Nam.

5.1. Định hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải thiện quy trình sản xuất vaccine, nghiên cứu các chủng vi khuẩn mới và phát triển các loại vaccine kết hợp. Mục tiêu là tạo ra các sản phẩm vaccine an toàn và hiệu quả hơn cho ngành chăn nuôi.

5.2. Tầm quan trọng của vaccine trong ngành chăn nuôi

Vaccine không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Việc phát triển vaccine hiệu quả sẽ góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm chăn nuôi và tăng cường sức cạnh tranh của ngành chăn nuôi Việt Nam trên thị trường quốc tế.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chăn nuôi lợn đóng vai trò trụ cột trong ngành nông nghiệp Việt Nam, cung cấp nguồn thực phẩm thiết yếu cho tiêu dùng nội địa và phục vụ mục tiêu xuất khẩu. Theo định hướng chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 của Chính phủ tại Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg, tổng đàn lợn toàn quốc hướng tới mốc 35 triệu con với tỷ trọng nuôi trang trại công nghiệp đạt 37%. Tuy nhiên, dịch bệnh truyền nhiễm luôn là rào cản lớn gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Trong đó, bệnh phù đầu (Edema disease) do vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) dung huyết gây ra ở lợn giai đoạn trước và sau cai sữa (21 - 90 ngày tuổi) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Số liệu theo dõi dịch tễ tại 6 tỉnh khu vực đồng bằng sông Cửu Long ghi nhận tỷ lệ lợn mắc bệnh lên tới 58,78% và tỷ lệ chết trên số lợn mắc bệnh chiếm tới 53,34%.

Xuất phát từ thực tiễn cấp bách đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Hoàng Thị Thúy, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Vũ Như Quán tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam phối hợp cùng Công ty Cổ phần Dược phẩm Đức Hạnh Marphavet, đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli dung huyết gây ra theo quy mô công nghiệp". Nghiên cứu được triển khai từ tháng 10/2016 đến tháng 10/2017 tại nhà máy sản xuất đạt chuẩn GMP-WHO. Mục tiêu cụ thể là đánh giá độ ổn định sinh vật học, cấu trúc kháng nguyên, độc lực của các chủng giống vi khuẩn, từ đó thiết lập quy trình lên men sục khí công nghiệp, kiểm nghiệm tiêu chuẩn vô trùng, an toàn, hiệu lực bảo hộ và xây dựng hướng dẫn sử dụng, bảo quản vaccine. Công trình tạo ra bước đột phá trong việc chủ động nguồn sinh phẩm thú y nội địa, giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở lợn con xuống dưới 1%, nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi và bảo đảm an toàn sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết bệnh sinh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây bệnh Enterotoxigenic E. coli (ETEC) và Verotoxigenic E. coli (VTEC/STEC), kết hợp mô hình miễn dịch học ứng dụng trong sản xuất vaccine vô hoạt toàn khuẩn (inactivated bacterin). Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae sở hữu hệ thống cấu trúc kháng nguyên đa dạng với hơn 250 serotype O (kháng nguyên thân LPS), 89 serotype K (kháng nguyên vỏ bọc) và 56 serotype H (kháng nguyên lông).

Khung lý thuyết của luận văn tập trung vào bốn nhóm khái niệm cốt lõi:

• Kháng nguyên bám dính (Fimbriae antigens - F18, F4): Đóng vai trò quyết định giúp vi khuẩn bám chặt vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt vi nhung mao tế bào biểu mô ruột non của lợn sau cai sữa, chống lại lực đào thải của nhu động ruột.
• Độc tố tế bào Shiga (Shiga toxin/Verotoxin - Stx2e/VT2e): Ngoại độc tố hấp thu vào hệ tuần hoàn, phá hủy nội mạc mạch máu, gây tăng huyết áp kịch phát lên tới 200 mmHg, làm mất cơ chế tự điều hòa tuần hoàn não dẫn đến phù nề mô thần kinh và gây chết nhanh.
• Độc tố đường ruột (Enterotoxins - STa, STb, LT): Gây rối loạn vận chuyển ion natri và clorua, tăng tiết dịch đường ruột dẫn đến tiêu chảy cấp. Ở lợn khỏe mạnh, mật độ E. coli duy trì ở mức 10^3 đến 10^6 vi khuẩn/g chất chứa, nhưng khi bùng phát bệnh phù đầu, số lượng tăng vọt lên 10^7 đến 10^9 vi khuẩn/g.
• Tá dược keo phèn (Aluminum hydroxide adjuvant 20%): Cơ chế tạo kho kháng nguyên tại chỗ (depot effect), giải phóng từ từ kháng nguyên để kích thích hệ miễn dịch sản sinh kháng thể dịch thể bền vững mà không gây kích ứng mô nghiêm trọng.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế thực nghiệm kiểm chứng từ phòng thí nghiệm đến quy mô pilot công nghiệp trên các đối tượng mẫu xác định:

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Sử dụng 6 chủng E. coli phân lập thực địa đại diện (ký hiệu P1 đến P6) mang các serotype O đặc trưng. Thử nghiệm trên động vật gồm 100 chuột nhắt trắng khỏe mạnh (trọng lượng 18 - 20g) và 20 lợn con sau cai sữa (35 - 40 ngày tuổi). Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng được áp dụng để rút 5 chai mẫu từ mỗi lô sản xuất công nghiệp phục vụ kiểm nghiệm.
• Phương pháp phân tích và kiểm nghiệm: Giám định hình thái và sinh hóa vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey; xác định gen mã hóa yếu tố độc lực (F4, F18, STa, STb, LT, VT2e) bằng kỹ thuật sinh học phân tử Polymerase Chain Reaction (PCR) với các cặp mồi chuẩn tổng hợp từ hãng Fermentas (kích thước khuếch đại từ 166 bp đến 696 bp); xác định độc lực và chỉ số LD50 theo phương pháp Reed & Muench (1938); kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực bảo hộ theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 160-92 và 10 TCN 161-92 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
• Lý do lựa chọn phương pháp: Kỹ thuật PCR mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu tuyệt đối trong định danh gen độc lực mà phương pháp nuôi cấy truyền thống không thể hiện được; các tiêu chuẩn kiểm nghiệm thú y quốc gia bảo đảm tính pháp lý và độ tin cậy khi chuyển giao công nghệ ra thực tế sản xuất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm đã thu được 4 kết quả then chốt:

• Đặc tính giống vi khuẩn ổn định và độc lực cao: Toàn bộ 6 chủng E. coli bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô đều giữ nguyên đặc tính hình thái trực khuẩn Gram âm, phản ứng sinh hóa thuần nhất (100% lên men glucose, lactose, sinh Indol; 0% sinh H2S và không lên men saccarose). Phân tích PCR ghi nhận tỷ lệ mang gen độc lực rất cao: gen STa chiếm 83,33% (5/6 chủng), gen F18 chiếm 66,67% (4/6 chủng), gen VT2e và STb cùng đạt 50,00% (3/6 chủng), gen F4 chiếm 33,33% (2/6 chủng), gen LT chiếm 16,67% (1/6 chủng). Thử nghiệm độc lực trên chuột bạch cho thấy 100% chuột tiêm liều 0,2 ml dịch khuẩn chết trong vòng 17 - 24 giờ.
• Tối ưu hóa công nghệ lên men sục khí công nghiệp: Sử dụng hệ thống máy lên men sục khí Sartorius dung tích 15 lít và 120 lít (CHLB Đức) với môi trường Tryptone Phosphate Broth (TPB) bổ sung dịch chiết dinh dưỡng. Sau 8 - 10 giờ nuôi cấy ở 37°C, mật độ vi khuẩn trong cả 3 lô sản xuất đại trà đạt từ 17 x 10^9 đến 19 x 10^9 CFU/ml, vượt trội so với yêu cầu tối thiểu của quy trình sản xuất vaccine công nghiệp.
• Kiểm nghiệm đạt chuẩn tuyệt đối về vô trùng và an toàn: Quá trình vô hoạt canh trùng bằng Formol nồng độ 0,5% ở 37°C trong 24 giờ tiêu diệt hoàn toàn mầm bệnh, 100% mẫu cấy trên các môi trường thạch máu, MacConkey, nước thịt gan yếm khí không có vi khuẩn phát triển qua 7 ngày theo dõi. Đánh giá an toàn trên chuột nhắt trắng (tiêm phúc xoang liều 0,5 ml và tiêm tĩnh mạch đuôi liều 0,2 ml) cùng thử nghiệm trên lợn con tiêm liều gấp đôi (4 ml) và gấp ba liều miễn dịch đều đạt tỷ lệ sống 100%, lợn sinh trưởng bình thường, không có phản ứng phụ cục bộ hay toàn thân.
• Hiệu lực bảo hộ miễn dịch vững chắc: Thử thách công cường độc liều 10 LD50 trên chuột nhắt trắng đã tiêm vaccine đạt tỷ lệ bảo hộ từ 70% đến 90%, trong khi 100% chuột đối chứng chết sau 24 - 48 giờ. Thử nghiệm trên lợn con 21 ngày tuổi tiêm liều 1 ml/con tạo ra hiệu giá kháng thể cao (>= 1/8) và duy trì thời gian bảo hộ kéo dài trên 6 tháng.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thực nghiệm khẳng định cơ chế tác động bổ trợ đa chiều của chủng giống và chất trợ lực. Tỷ lệ xuất hiện cao của yếu tố bám dính F18 (66,67%) và độc tố dung huyết VT2e (50,00%) giải thích chính xác nguyên nhân bệnh phù đầu bùng phát mạnh ở giai đoạn lợn cai sữa, do thụ thể tiếp nhận F18 chỉ hoàn thiện trên biểu mô ruột lợn từ 3 tuần tuổi trở đi.

Về mặt trình bày dữ liệu khoa học, phổ phân bố các gen độc lực có thể được mô tả trực quan qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ hiện diện giữa các gen (độc tố đường ruột STa chiếm ưu thế áp đảo 83,33% so với LT chỉ 16,67%), giúp định hướng chính xác công thức phối trộn kháng nguyên. Động học tăng trưởng sinh khối qua 3 lô sản xuất quy mô 120 lít được tổng hợp tối ưu qua bảng ma trận so sánh các chỉ tiêu mật độ (Lô I đạt 17 - 19 x 10^9 CFU/ml, Lô II đạt 18 - 19 x 10^9 CFU/ml, Lô III đạt 17 - 19 x 10^9 CFU/ml), chứng minh tính lặp lại và độ tin cậy rất cao của hệ thống thiết bị CHLB Đức.

So sánh với các nghiên cứu trước đây của các tác giả trong nước, thời gian gây chết chuột của bộ giống trong luận văn ngắn hơn (17 - 24 giờ so với 24 - 96 giờ), chứng minh độc lực và kháng nguyên tính của chủng tuyển chọn vượt trội hơn. Việc phối trộn tá dược keo phèn 20% giúp kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào và thể dịch đồng thời, giảm thiểu tối đa hiện tượng viêm sưng so với các loại vaccine nhũ dầu truyền thống, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng đại trà tại các trang trại quy mô lớn.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao hiệu quả kết quả nghiên cứu vào thực tiễn chăn nuôi, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp mang tính chiến lược và khả thi:

• Chuẩn hóa quy trình vận hành sản xuất công nghiệp: Đề nghị các cơ sở sản xuất sinh phẩm thú y áp dụng đồng bộ công nghệ lên men sục khí tự động 120 lít kết hợp dây chuyền chiết rót, đóng chai tự động. Mục tiêu duy trì ổn định mật độ vi khuẩn canh trùng đạt ngưỡng 18 x 10^9 CFU/ml trước khi vô hoạt bằng formol 0,5%. Lộ trình thực hiện trong vòng 6 tháng bởi phòng Kỹ thuật và Quản trị chất lượng của các nhà máy đạt chuẩn GMP.
• Ứng dụng phác đồ tiêm phòng vắc xin chuẩn cho đàn lợn: Khuyến cáo người chăn nuôi và kỹ thuật viên thú y trang trại thực hiện tiêm phòng vaccine vô hoạt keo phèn liều duy nhất 1 ml/con dưới da sau hốc tai cho lợn con vào thời điểm 21 - 28 ngày tuổi (khoảng 1 tuần trước khi cai sữa). Mục tiêu giảm tỷ lệ phát bệnh phù đầu xuống dưới 2% và triệt tiêu tỷ lệ chết do phù đầu trong suốt giai đoạn nuôi thịt. Kế hoạch triển khai định kỳ theo từng lứa đẻ của lợn nái.
• Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm định quốc gia: Kiến nghị Cục Thú y và Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc thú y Trung ương ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia riêng biệt cho vaccine vô hoạt phù đầu lợn bổ trợ keo phèn, quy định rõ chỉ số hiệu lực bảo hộ trên chuột tối thiểu đạt 75% và thời gian miễn dịch bảo hộ trên lợn tối thiểu 180 ngày. Lộ trình hoàn thiện văn bản quy chuẩn trong 12 tháng.
• Tăng cường giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ: Thiết lập mạng lưới lấy mẫu bệnh phẩm tại các vùng chăn nuôi trọng điểm ở miền Bắc và miền Trung với tần suất 6 tháng/lần nhằm giải trình tự gen, theo dõi sự biến đổi của các serotype kháng nguyên O và các biến thể yếu tố bám dính mới, bảo đảm kịp thời cập nhật chủng giống sản xuất khi có biến chủng phát sinh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo mang giá trị học thuật và ứng dụng cao, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

• Doanh nghiệp và nhà máy sản xuất thuốc thú y, sinh phẩm: Cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về điều kiện nuôi cấy lên men sục khí 120 lít, tỷ lệ phối trộn tá dược keo phèn 20%, quy trình kiểm tra vô trùng và an toàn sinh học theo chuẩn GMP-WHO để thương mại hóa sản phẩm quy mô lớn.
• Bác sĩ thú y, kỹ sư chăn nuôi và chủ trang trại gia trại: Nắm vững cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli dung huyết sinh độc tố Stx2e và F18, từ đó xây dựng lịch trình tiêm phòng 1 ml chính xác lúc 21 ngày tuổi nhằm bảo vệ đàn lợn con, nâng cao tỷ lệ nuôi sống và tối ưu hóa chi phí điều trị kháng sinh.
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên ngành Thú y, Chăn nuôi: Sử dụng làm tài liệu tham khảo phương pháp luận chuẩn mực về phân lập vi khuẩn, kỹ thuật sinh học phân tử PCR đa mồi phát hiện độc lực, phương pháp xác định LD50 của Reed-Muench và quy trình thử nghiệm lâm sàng trên động vật.
• Cơ quan quản lý nhà nước và viện nghiên cứu chuyên ngành: Làm căn cứ khoa học thực tiễn phục vụ công tác xây dựng quy chuẩn kiểm nghiệm, cấp phép lưu hành sinh phẩm thú y và hoạch định chính sách phòng chống dịch bệnh gia súc cấp quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

Vaccine bổ trợ keo phèn có ưu điểm gì vượt trội so với vaccine nhũ dầu truyền thống? Vaccine bổ trợ keo phèn 20% có độ nhớt thấp, dễ hút và thao tác tiêm nhanh, hấp thu tốt tại mô cơ dưới da sau hốc tai mà không gây phản ứng sốt cục bộ, áp xe hay hoại tử mô. Khảo sát thực nghiệm chứng minh độ an toàn đạt 100% trên chuột và lợn con ngay cả khi tiêm liều gấp đôi hoặc gấp ba.

Tại sao cần phải phát hiện đồng thời yếu tố bám dính F18 và độc tố VT2e trong chủng giống? Yếu tố bám dính F18 chịu trách nhiệm gắn kết vi khuẩn vào thụ thể nhung mao ruột lợn sau cai sữa, trong khi ngoại độc tố tế bào VT2e gây tổn thương mạch máu dẫn đến hiện tượng phù đầu và co giật thần kinh. Vaccine chứa cả hai yếu tố này tạo miễn dịch kép, ngăn chặn vi khuẩn bám dính và trung hòa hoàn toàn độc tố với hiệu lực bảo hộ từ 70% đến 90%.

Hệ thống lên men sục khí công nghiệp Sartorius mang lại lợi ích kinh tế nào? Hệ thống lên men 120 lít của Đức kiểm soát tự động nhiệt độ, pH và nồng độ oxy hòa tan, giúp rút ngắn thời gian nuôi cấy xuống chỉ còn 8 - 10 giờ nhưng đạt mật độ sinh khối cực cao (17 - 19 tỷ CFU/ml). Năng suất này cao gấp 3 - 4 lần phương pháp nuôi tĩnh, giúp hạ giá thành sản xuất mỗi liều vaccine xuống mức cạnh tranh.

Thời điểm và liều lượng tiêm phòng thích hợp nhất cho lợn con là khi nào? Thời điểm vàng để tiêm phòng là khi lợn con đạt 21 - 35 ngày tuổi (giai đoạn chuẩn bị cai sữa). Tiêm một liều duy nhất 1 ml/con dưới da sau hốc tai giúp cơ thể tạo kháng thể bảo hộ đạt hiệu giá trên 1/8 sau 14 - 21 ngày và duy trì miễn dịch vững chắc liên tục hơn 6 tháng trong suốt chu kỳ nuôi thịt.

Vaccine thành phẩm cần được bảo quản như thế nào để duy trì hoạt lực kháng nguyên? Vaccine vô hoạt keo phèn phải được bảo quản trong kho mát chuyên dụng ở dải nhiệt độ từ 5°C đến 15°C, tránh ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp và tuyệt đối không để đông đá. Tuân thủ đúng điều kiện này giúp vaccine duy trì độ vô trùng và hiệu lực sinh miễn dịch ổn định trong suốt thời hạn bảo quản quy định.

Kết luận

• Luận văn hoàn thiện xuất sắc quy trình sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh phù đầu lợn bổ trợ keo phèn 20% bằng công nghệ lên men sục khí 120 lít đạt mật độ sinh khối từ 17 x 10^9 đến 19 x 10^9 CFU/ml trong 8 - 10 giờ.
• Tuyển chọn bộ giống gồm các chủng E. coli dung huyết ổn định, mang đầy đủ kháng nguyên bám dính F18, F4 cùng các tổ hợp gen sinh độc tố VT2e, STa, STb với độc lực mạnh gây chết 100% chuột thí nghiệm sau 17 - 24 giờ.
• Xử lý vô hoạt triệt để bằng Formol 0,5% đạt độ vô trùng 100% trên mọi môi trường nuôi cấy và an toàn tuyệt đối 100% khi thử nghiệm trên động vật thay thế và động vật chủ.
• Chứng minh hiệu lực bảo hộ cao từ 70% đến 90% trên chuột nhắt trắng trước thử thách 10 LD50 và tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ kéo dài trên 6 tháng ở lợn con với liều tiêm 1 ml/con.
• Luận văn đóng góp giải pháp công nghệ sinh học thú y có tính ứng dụng cao, giúp ngành chăn nuôi chủ động kiểm soát bệnh phù đầu lợn với chi phí thấp thay thế hoàn toàn nguồn vaccine nhập khẩu đắt đỏ.

Lộ trình tiếp theo hướng tới hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành sản phẩm cấp phép quốc gia trong vòng 6 tháng và chuyển giao công nghệ cho các tập đoàn chăn nuôi trong 12 - 18 tháng tới. Các đơn vị trang trại và cơ sở thú y nên sớm tiếp cận ứng dụng quy trình sản xuất và lịch tiêm phòng này để nâng cao tỷ lệ sống của đàn lợn, gia tăng lợi nhuận và phát triển chăn nuôi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ THÚY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE BỔ TRỢ KEO PHÈN PHÒNG BÊNH PHÙ ĐẦU LỢN DO E.COLI DUNG HUYẾT GÂY RA THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Như Quán NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thúy i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Như Quán bộ môn Ngoại-Sản đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Ngoại-Sản, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến PGS. Cù Hữu Phú cùng toàn thể cán bộ công nhân viên tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin thuộc Công ty CP Đức Hạnh Marphavet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thúy ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục sơ đồ hình ảnh.

viii Trích yếu luận văn………………………………………….ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát.

Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu. Thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Một số hiểu biết về vi khuẩn E.2 Kháng nguyên .3 Các yếu tố gây bệnh. Đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học. Bệnh phù đầu do E. coli gây ra.

Phòng bệnh. Bệnh phù đầu ở lợn con. Các vacxin phòng bệnh phù đầu lợn. Các vacxin phòng bệnh phù đầu do E.

coli gây ra. Vacxin phòng bệnh do E. coli gây ra nhập khẩu. 13 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu.

Vi khuẩn sử dụng chế tạo vaccine vô hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp giám định vi khuẩn.

Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp giám định vi khuẩn. Phương pháp phân tích số liệu. Kết quả và thảo luận.

Kết quả kiểm định giống E. coli sản xuất vaccine. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E.

Kết quả kiểm tra serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E. Kết quả kiểm tra các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch.

Quy trình sản xuất vaccine theo quy mô công nghiệp. Giống vi khuẩn E. coli để sản xuất vaccine. Nhân giống vi khuẩn E.

coli trên môi trường thạch máu. Nhân giống vi khuẩn E. coli trên môi trường lỏng. Bổ sung keo phèn vào canh trùng .5 Giai đoạn đóng chai, dán nhãn vaccine.

Quá trình bảo quản vaccine. 33 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.3 Kết quả kiểm nghiệm vaccine sản xuất thử nghiệm. Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp. Kết quả kiểm tra thuần khiết của canh trùng sử dụng chế tạo vaccine.

Kết quả kiểm tra vô trùng của 3 lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp. Kết quả kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng. Kết quả kiểm tra hiệu lực trên chuột nhăt trắng .6 Kết quả kiểm tra an toàn vaccine trên lợn. Kết quả thử hiệu lực vaccine trên lợn.

Kết quả xác định liều tiêm vaccine Phù đầu lợn. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vaccine Phù đầu lợn. Kết quả thử nghiệm vaccine trên diện rộng. Kết luận và kiến nghị.

45 Tài liệu tham khảo. 46 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ BHI : Brain Heart Infusion CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng sự DHL : Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA : DeoxyriboNucleic Acid ETEC : EnteroToxigenic E. coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay GDP : Guanin DiPhosphate GTP : Guanin TriPhosphate IHA : Indirect Haemagglutination test InvA : Invasion A LPS : LipoPolySaccharide PCR : Polymerase Chain Reaction RR : Relative Risk TSA : Tryptic Soya Agar TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam VX : Vaccine vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Các cặp mồi do công ty Fermentas cung cấp để xác định các yếu tố độc lực và bám dính của vi khuẩn E.

Một số đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E. Một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. Serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli nghiên cứu.

Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli mang các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh. Độc lực của 10 chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch.

Kết quả kiểm tra đậm độ các lô vaccine. Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng sử dụng chế tạo vaccine. Kết quả kiểm tra vô trùng của vaccine chế tạo. Kết quả kiểm tra an toàn vaccine trên chuột nhắt trắng.

Kết quả kiểm hiệu lực vaccine trên chuột nhắt trắng. Kết quả kiểm tra an toàn vaccine trên lợn. Kết quả đánh giá hiệu lực vaccine trên lợn. Kết quả xác định kháng thể ở lợn tiêm vaccine với liều tiêm khác nhau.

Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể trên lợn tiêm vaccine. 43 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH Sơ đồ 4. Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt phù đầu lợn có bổ trợ keo phèn. Hình thái vi khuẩn E.

coli mọc trên thạch máu. Hình thái vi khuẩn E. coli soi trên kính hiển vi quang học. Cấy nhân giống vi khuẩn E.

coli trên thạch máu. coli giống nhỡ được nuôi cấy trong tủ lắc. Máy lên men sục khí 15 lít SATORIUS của CHLB Đức. Máy lên men sục khí 120 lit SATORIUS của CHLB Đức.

Hệ thống ra chai tự động của Ý. Dây truyền dán nhãn tự động. 33 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị Thúy Tên luận văn: “Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn do E. coli dung huyết gây ra theo quy mô công nghiệp”.

Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Đánh giá đươc quy trình sản xuất vaccine quy mô công nghiệp, quy trình kiểm nghiệm, sử dụng và bảo quản vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn do vi khuẩn E. coli dung huyết gây ra. Phương pháp: Phương pháp giám định vi khuẩn Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn. Kết quả chính và kết luận: 1.

5 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được sử dụng để chế vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn là đại diện cho các chủng vi khuẩn gây bệnh phù đầu lợn con trước và sau cai sữa tại các tỉnh, sau khi bảo quản thời gian dài dưới dạng thạch lỏng và đông khô, vẫn mang đầy đủ các đặc điểm sau: + Mang đầy đủ các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh hóa như chủng gây bệnh trong tự nhiên. + Mang các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh ổn định sau khi lưu giữ sau thời gian dài ở thạch lỏng Glycerin và đông khô. + Có độc lực mạnh, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 24 giờ.

Các lô vaccine chế tạo trên quy mô công nghiệp đều đạt các chỉ tiêu về: + Phương pháp lên men sục khí canh trùng nuôi cấy đạt đậm độ vi khuẩn: từ 17 9 x 10 vi khuẩn/ml. + Vô trùng bằng Formol 0,5% đạt kết quả 100% vô trùng khi kiểm tra trên các môi trường thạch máu, nước thịt, môi trường yếm khí và thạch nấm. ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các lô vaccine chế tạo trên quy mô công nghiệp đều đạt các chỉ tiêu sau: + Khi thử nghiệm trên chuột bạch, đạt chỉ tiêu an toàn 100% với liều tiêm 0.5ml/chuột với đường tiêm vào phúc xoang và hiệu lực bảo hộ đạt từ 70-90%.

+ Với liều tiêm gấp đôi và gấp ba liều tiêm miễn dịch: vaccine an toàn 100% với lợn từ 21 ngày tuổi. Vaccine khi được thử nghiệm trên diện rộng đạt chỉ tiêu an toàn cao với liều tiêm 1 ml/con và tạo được miễn dịch phòng hộ tốt. x LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Hoang Thi Thuy Thesis title: Study on the production of vaccine adjuvant alum against head edema of pigs caused by E.coli in industrial scale.