Luận văn đặc tính sinh học của virus TGEV và PEDV sản xuất vacxin tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua một số đặc tính sinh học của chủng tgev transmissible gastroenteritis virus và pedv porcine, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giáp
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Một số đặc tính sinh học của chủng TGEV (Transmissible Gastroenteritis Virus) và PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 7. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 7.1. Mục tiêu chung
• 7.2. Mục tiêu cụ thể
• 8. Ý NGHĨA KHOA HỌC
• 9. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 9.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS
• 9.1.1. Tình hình nghiên cứu về PEDV, TGEV tại Việt Nam
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus TGEV và PEDV trong sản xuất vacxin nhược độc

Virus TGEV (Transmissible Gastroenteritis Virus) và PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) là hai tác nhân chính gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn. Chúng thuộc nhóm coronavirus và có ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn. Việc nghiên cứu đặc tính sinh học của hai virus này là cần thiết để phát triển vacxin nhược độc hiệu quả. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn hỗ trợ trong việc sản xuất vacxin có khả năng bảo vệ tốt hơn cho đàn lợn.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus TGEV và PEDV

Virus TGEV và PEDV có cấu trúc gen và protein khác nhau, ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh và miễn dịch. TGEV thường gây ra triệu chứng viêm dạ dày ruột, trong khi PEDV chủ yếu gây tiêu chảy cấp. Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng virus này có thể biến đổi nhanh chóng, dẫn đến sự cần thiết phải theo dõi và phân lập các chủng mới từ thực địa.

1.2. Tầm quan trọng của vacxin nhược độc trong phòng bệnh

Vacxin nhược độc là một trong những giải pháp hiệu quả nhất để phòng ngừa bệnh do virus TGEV và PEDV. Việc sản xuất vacxin từ các chủng virus địa phương có thể mang lại hiệu quả cao hơn so với vacxin nhập khẩu, do tính tương đồng về di truyền. Điều này giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho lợn và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu virus TGEV và PEDV

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về virus TGEV và PEDV, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc phát triển vacxin hiệu quả. Sự biến đổi gen của virus, khả năng lây lan nhanh chóng và sự khác biệt giữa các chủng virus là những vấn đề cần được giải quyết. Ngoài ra, việc thiếu thông tin về các chủng virus mới cũng gây khó khăn trong việc sản xuất vacxin.

2.1. Sự biến đổi gen của virus TGEV và PEDV

Virus TGEV và PEDV có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Điều này làm giảm hiệu quả của vacxin hiện có và tạo ra thách thức lớn trong việc phát triển vacxin mới. Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng virus mới có thể có độc lực cao hơn và khả năng lây lan nhanh hơn.

2.2. Khó khăn trong việc phân lập và nghiên cứu virus

Việc phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm gặp nhiều khó khăn do điều kiện nuôi cấy và sự cần thiết phải có các phương pháp chẩn đoán chính xác. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng phương pháp RT-PCR có thể giúp phát hiện virus nhanh chóng và chính xác hơn, nhưng vẫn cần cải thiện để đáp ứng nhu cầu thực tiễn.

III. Phương pháp nghiên cứu virus TGEV và PEDV hiệu quả

Để nghiên cứu đặc tính sinh học của virus TGEV và PEDV, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định đặc tính sinh học mà còn hỗ trợ trong việc phát triển vacxin nhược độc. Việc sử dụng công nghệ sinh học và phân tích gen là rất quan trọng trong nghiên cứu này.

3.1. Phương pháp phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm

Phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các mẫu được thu thập từ lợn mắc bệnh và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp. Việc sử dụng các dòng tế bào như PK-15 và Vero giúp tăng cường khả năng phát hiện và phân lập virus.

3.2. Phương pháp RT PCR trong chẩn đoán virus

Phương pháp RT-PCR là một công cụ mạnh mẽ trong việc phát hiện virus TGEV và PEDV. Phương pháp này cho phép xác định sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện virus ngay cả khi nồng độ thấp.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu virus TGEV và PEDV

Kết quả nghiên cứu về virus TGEV và PEDV có thể được ứng dụng trong sản xuất vacxin nhược độc. Việc phát triển vacxin từ các chủng virus địa phương sẽ giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho lợn và giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cung cấp thông tin quan trọng cho các chương trình phòng chống dịch bệnh trong ngành chăn nuôi.

4.1. Sản xuất vacxin nhược độc từ virus TGEV và PEDV

Sản xuất vacxin nhược độc từ virus TGEV và PEDV là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của nghiên cứu này. Các chủng virus được phân lập và đánh giá đặc tính sinh học sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất vacxin. Việc này không chỉ giúp bảo vệ đàn lợn mà còn giảm thiểu chi phí cho người chăn nuôi.

4.2. Tác động của vacxin đến sức khỏe đàn lợn

Vacxin nhược độc có tác động tích cực đến sức khỏe đàn lợn, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tiêm phòng đầy đủ có thể giúp tăng cường sức đề kháng cho lợn, từ đó nâng cao năng suất chăn nuôi và giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virus TGEV và PEDV

Nghiên cứu về virus TGEV và PEDV là rất cần thiết trong bối cảnh dịch bệnh ngày càng gia tăng. Việc phát triển vacxin nhược độc từ các chủng virus địa phương sẽ giúp nâng cao hiệu quả phòng bệnh. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp mới cho ngành chăn nuôi, góp phần bảo vệ sức khỏe đàn lợn và nâng cao năng suất.

5.1. Hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển vacxin

Hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển vacxin là cần thiết để đáp ứng nhu cầu thực tiễn. Việc áp dụng công nghệ sinh học và phân tích gen sẽ giúp phát triển vacxin hiệu quả hơn. Nghiên cứu cũng cần tập trung vào việc theo dõi sự biến đổi gen của virus để có thể điều chỉnh vacxin kịp thời.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác nghiên cứu trong ngành chăn nuôi

Hợp tác nghiên cứu giữa các cơ sở nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp là rất quan trọng trong việc phát triển vacxin và các giải pháp phòng bệnh. Sự kết hợp này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao hiệu quả của các chương trình phòng chống dịch bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi giữ vai trò then chốt trong cơ cấu nông nghiệp Việt Nam, đóng góp khoảng 25% vào tổng thu nhập quốc nội của toàn ngành, trong đó chăn nuôi lợn chiếm vị trí chủ đạo với 78% tổng sản lượng. Theo thống kê của Tổng cục Thống kê năm 2018, tổng đàn lợn cả nước đạt trên 28 triệu con, với năng suất trung bình mỗi lợn nái sinh sản khoảng 10 con trên một lứa. Điều này đặt ra nhu cầu cấp thiết về hàng chục triệu liều vacxin mỗi năm nhằm bảo vệ đàn vật nuôi trước các dịch bệnh nguy hiểm. Trong số các bệnh truyền nhiễm đường tiêu hóa, bệnh tiêu chảy cấp do Porcine Epidemic Diarrhea Virus và bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm do Transmissible Gastroenteritis Virus là hai mối đe dọa nghiêm trọng nhất. Tỷ lệ mắc bệnh ở lợn con theo mẹ thường dao động từ 93,94% đến 100%, và tỷ lệ tử vong ghi nhận từ 68,6% đến 100%, gây thiệt hại kinh tế hàng nghìn tỷ đồng mỗi năm cho ngành chăn nuôi.

Phần lớn các loại vacxin thương mại lưu hành trên thị trường hiện nay được sản xuất từ các chủng virus cổ điển như CV777 phân lập từ châu Âu hoặc châu Á nhiều thập kỷ trước. Do sự biến đổi di truyền nhanh chóng và sự khác biệt kháng nguyên trên 10% giữa chủng vacxin cổ điển và các biến chủng thực địa tại Việt Nam, hiệu lực bảo hộ chéo của các sản phẩm ngoại nhập chỉ đạt mức thấp đến trung bình. Nhằm giải quyết triệt để bài toán này, đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá toàn diện các chỉ tiêu chất lượng và đặc tính sinh học của hai chủng virus nhược độc phân lập trong nước gồm AVAC/VR/PED.98 ở đời tiếp đời thứ 100 và AVAC/VR/TGE.15 ở đời tiếp đời thứ 130. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 9 năm 2019 tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam và Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả nghiên cứu xác lập nền tảng khoa học vững chắc với hiệu giá virus PEDV đạt 7,5 log10 TCID50/ml và TGEV đạt 8,7 log10 TCID50/ml, phục vụ trực tiếp cho việc sản xuất vacxin nhược độc đa giá tự chủ tại Việt Nam, giúp giảm thiểu trên 30% chi phí phòng bệnh cho người chăn nuôi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng thuyết miễn dịch học đường niêm mạc và cơ chế truyền kháng thể thụ động qua trục mẹ con ở loài lợn. Do cấu tạo nhau thai dạng biểu mô - nhung mao ngăn cản sự vận chuyển kháng thể từ mẹ sang thai nhi trong tử cung, lợn con sinh ra hoàn toàn chưa có kháng thể bảo hộ. Miễn dịch bảo vệ sơ sinh phụ thuộc tuyệt đối vào lượng immunoglobulin thu nhận qua sữa đầu trong 24 đến 48 giờ đầu đời và sữa thường suốt giai đoạn theo mẹ. Trong đó, kháng thể IgG chiếm trên 60% tổng lượng immunoglobulin trong sữa đầu, còn kháng thể IgA tiết đóng vai trò bám dính niêm mạc ruột, trung hòa trực tiếp các hạt virus xâm nhập qua đường tiêu hóa.

Về mặt virus học phân tử, cả PEDV và TGEV đều thuộc giống Alphacoronavirus, họ Coronaviridae, sở hữu bộ gen ARN sợi đơn dương kích thước từ 28 đến 30 kb. Khung lý thuyết tập trung vào 4 khái niệm và cấu trúc phân tử then chốt:

• Glycoprotein gai bề mặt (Protein S): Có kích thước từ 180 đến 220 kDa, chịu trách nhiệm liên kết với thụ thể Aminopeptidase N trên bề mặt biểu mô ruột non và kích thích cơ thể sinh kháng thể trung hòa chính tại các vị trí quyết định kháng nguyên A, B, C, D. Đột biến trên gen S quyết định trực tiếp đến tính hướng mô và sự suy giảm độc lực của virus.
• Hiệu giá gây nhiễm mô nuôi cấy 50% (TCID50): Chỉ số định lượng nồng độ hạt virus có khả năng gây biến đổi bệnh lý trên 50% số giếng nuôi cấy tế bào thí nghiệm.
• Bệnh tích tế bào (CPE): Hiện tượng biến đổi hình thái tế bào chủ khi bị virus xâm nhiễm, thể hiện qua sự co tròn, thoái hóa hạt hoặc kết tụ thành các thể hợp bào đa nhân.
• Gen phụ trợ ORF3 và các protein cấu trúc màng M, vỏ E, nucleocapsid N: Đóng vai trò thiết yếu trong quá trình lắp ráp virion, điều hòa phiên mã và kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu sinh học chuẩn hóa gồm chủng virus giống AVAC/VR/PED.98 ở đời P100 và AVAC/VR/TGE.15 ở đời P130, cùng các chủng cường độc đối chứng do Công ty AVAC cung cấp. Môi trường nuôi cấy in vitro gồm dòng tế bào thận khỉ xanh Vero (bổ sung 10 µg/ml trypsin) dành cho PEDV và dòng tế bào tinh hoàn lợn ST (bổ sung 3 µg/ml trypsin) dành cho TGEV. Động vật thí nghiệm là đàn lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu, được chọn mẫu có chủ đích với cỡ mẫu đồng đều, sàng lọc âm tính 100% với PEDV và TGEV bằng kỹ thuật RT-PCR, đồng thời được điều trị dự phòng nhiễm khuẩn kế phát bằng kháng sinh Baytril 5%. Việc lựa chọn lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu thay vì lợn 5 đến 10 ngày tuổi nhằm loại bỏ hoàn toàn ảnh hưởng của kháng thể mẹ truyền, đảm bảo đánh giá chính xác độc lực của virus trên đối tượng có tính mẫn cảm cao nhất.

Hệ thống phương pháp phân tích bao gồm:

• Phương pháp chuẩn độ virus pha loãng tới hạn cơ số 10 từ 10 mũ -1 đến 10 mũ -10 trên đĩa 96 giếng, tính toán hiệu giá theo công thức Spearman-Karber sau 96 giờ theo dõi.
• Phương pháp gây bệnh thực nghiệm in vivo với liều thử thách tương đương liều vacxin thương mại 10 mũ 5,0 TCID50/ml để theo dõi triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể ở ruột non sau 72 giờ gây nhiễm.
• Phương pháp Realtime RT-PCR định lượng tương đối theo công thức 2 mũ trừ delta delta CT sử dụng hóa chất SYBR Green và phân tích melting curve trên hệ thống ABI StepOne nhằm so sánh động thái bài thải virus qua phân mỗi 12 giờ và định lượng mức độ phân bố virus tại 5 phân đoạn ruột từ tá tràng đến trực tràng.
• Phương pháp khuếch đại gen PCR với 5 cặp mồi gối đầu phân đoạn cho từng chủng virus, giải trình tự gen S tại Macrogen (Hàn Quốc) và phân tích tin sinh học bằng phần mềm BioEdit 7.1 kết hợp MEGA 7.26 theo thuật toán Neighbor-Joining để kiểm chứng độ ổn định di truyền qua 20 thế hệ tiếp đời. Timeline nghiên cứu được thực hiện liên tục và đồng bộ trong 12 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu xác định hai chủng giống virus vacxin đạt hiệu giá sinh học cao và ổn định vững chắc qua nhiều lần tiếp đời in vitro. Chủng PEDV nuôi cấy trên tế bào Vero đạt hiệu giá dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ml, hình thành bệnh tích tế bào đặc thù là các thể hợp bào đa nhân sau 12 đến 24 giờ gây nhiễm. Chủng TGEV nuôi cấy trên tế bào ST đạt hiệu giá vượt trội từ 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ml, tạo bệnh tích co tròn và bong tróc thảm tế bào sau 24 đến 48 giờ. Mức độ dao động hiệu giá giữa các thế hệ cấy chuyển liên tiếp đều duy trì dưới 0,4 log10, thấp hơn nhiều so với giới hạn cho phép là 1,0 log10 TCID50/ml theo tiêu chuẩn sản xuất sinh phẩm thú y.

Thứ hai, đặc tính nhược độc hóa an toàn tuyệt đối được chứng minh trên mô hình lợn sơ sinh. Toàn bộ 100% lợn sơ sinh được gây nhiễm chủng nhược độc AVAC/VR/PED.98 (P100) và AVAC/VR/TGE.15 (P130) ở liều 10 mũ 5,0 TCID50/ml đều duy trì thể trạng hoàn toàn khỏe mạnh, không xuất hiện hiện tượng sốt, nôn mửa hay tiêu chảy, vùng hậu môn và giấy lót chuồng khô ráo suốt 72 giờ theo dõi. Ngược lại, 100% lợn ở lô đối chứng gây nhiễm chủng cường độc biểu hiện tiêu chảy cấp tính dạng nước màu vàng, mất nước nghiêm trọng và suy kiệt hoàn toàn.

Thứ ba, sự khác biệt rõ rệt về bệnh tích bệnh lý đại thể và vi thể. Mổ khám sau 72 giờ cho thấy lợn gây nhiễm chủng nhược độc có thành ruột non dày, bóng, độ đàn hồi tốt, hệ thống lông nhung ruột phát triển nguyên vẹn với tỷ lệ chiều dài lông nhung trên độ sâu tuyến ruột đạt mức bình thường 7:1. Trái lại, ở nhóm lợn nhiễm virus cường độc, dạ dày căng phồng chứa đầy sữa đông vón không tiêu, thành ruột non mỏng trong suốt như màng bóng, các lông nhung ruột bị teo đét và bào mòn nghiêm trọng khiến tỷ lệ lông nhung trên tuyến ruột sụt giảm nghiêm trọng xuống còn 1:1 đến 2:1.

Thứ tư, tính ổn định di truyền tuyệt đối của gen kháng nguyên chính Spike qua 20 thế hệ cấy chuyển liên tiếp. Phân tích trình tự gen S của PEDV từ đời P37 đến P150 và TGEV từ đời P5 đến P150 cho thấy độ tương đồng nucleotide và amino acid đạt trên 99,5%. Không phát hiện bất kỳ đột biến dịch khung, đột biến điểm sai nghĩa tại các vùng epitope trung hòa cốt lõi, hay hiện tượng phục hồi độc lực ban đầu.

Thảo luận kết quả

Cơ chế nhược độc hóa của hai chủng virus bắt nguồn từ quá trình thích nghi khi tiếp đời liên tục trên dòng tế bào liên tục Vero và ST. Áp lực chọn lọc in vitro qua 100 đến 130 thế hệ đã làm xuất hiện các đột biến thích nghi ở gen S và gen phụ trợ ORF3, làm suy giảm mạnh tính hướng mô ruột và khả năng phá hủy tế bào biểu mô nhung mao ruột non, nhưng vẫn bảo tồn toàn vẹn các epitope kích thích miễn dịch chủ động.

Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả này hoàn toàn tương thích với phát hiện của các nhà khoa học Nhật Bản trên chủng PEDV 83P-5 đời P100 và các nghiên cứu tại Hàn Quốc trên chủng DR13 đời P100. Tuy nhiên, điểm vượt trội của hai chủng AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 là nguồn gốc phân lập trực tiếp từ các ổ dịch thực địa tại Việt Nam. Do đó, mức độ tương đồng di truyền của chủng nghiên cứu với các biến chủng đang lưu hành nội địa cao hơn từ 5% đến 8% so với các chủng vacxin nhập khẩu từ châu Âu hoặc Hàn Quốc, giải quyết dứt điểm rào cản thiếu bảo hộ chéo do trôi dạt kháng nguyên.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị đường cong sinh trưởng biểu thị động thái tăng sinh của virus qua các mốc thời gian từ 0 đến 96 giờ, kết hợp cùng bảng ma trận đối chiếu phần trăm tương đồng nucleotide và amino acid gen S giữa các thế hệ cấy chuyển. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên phần mềm MEGA thể hiện rõ mối liên hệ phả hệ chặt chẽ giữa chủng vacxin AVAC với các nhánh virus gây bệnh phân lập tại miền Bắc và miền Nam Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, thiết lập ngân hàng giống gốc Master Seed và Working Seed chuẩn hóa. Ban Nghiên cứu và Phát triển tại Công ty AVAC cùng các đơn vị sản xuất sinh phẩm cần cố định chủng virus AVAC/VR/PED.98 ở đời P100 và AVAC/VR/TGE.15 ở đời P130, bảo quản đông khô tại nhiệt độ âm 80 độ C để duy trì hiệu giá tối thiểu 7,5 và 8,5 log10 TCID50/ml trong thời gian lưu trữ từ 24 đến 36 tháng.

Thứ hai, tối ưu hóa công nghệ bào chế và đông khô vacxin nhị giá. Bộ phận công nghệ sản xuất cần hoàn thiện công thức chất bổ trợ đông khô và tỷ lệ phối hợp kháng nguyên PEDV - TGEV nhằm đảm bảo mỗi liều vacxin thương phẩm chứa tối thiểu 10 mũ 5,0 TCID50 cho từng phân đoạn virus, hoàn thành hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y trong vòng 12 đến 18 tháng tới.

Thứ ba, triển khai quy trình thử nghiệm lâm sàng diện rộng trên các trang trại nái sinh sản. Cục Thú y phối hợp cùng doanh nghiệp tiến hành tiêm phòng thực nghiệm 2 mũi vacxin vào tuần thai thứ 12 và 14 cho đàn nái chửa, đặt mục tiêu nâng tỷ lệ bảo hộ sống sót ở lợn con theo mẹ lên trên 90% và giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy cấp trong trại xuống dưới 5% trong giai đoạn 2024 - 2026.

Thứ tư, xây dựng mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ. Các viện nghiên cứu chuyên ngành và trường đại học cần tiến hành giải trình tự gen S định kỳ 6 tháng một lần từ các mẫu bệnh phẩm tiêu chảy thực địa nhằm theo dõi các biến đổi kháng nguyên mới, bảo đảm tính tương đồng di truyền của chủng vacxin sản xuất luôn đạt trên 98% so với mầm bệnh lưu hành ngoài tự nhiên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm thứ nhất là các doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và sinh phẩm sinh học. Luận văn cung cấp quy trình công nghệ chi tiết từ khâu chuẩn độ hiệu giá Spearman-Karber, kỹ thuật nhân giống trên tế bào Vero và ST, đến quy trình kiểm nghiệm tính an toàn nhược độc in vivo phục vụ trực tiếp cho việc thương mại hóa vacxin nhược độc đa giá quy mô công nghiệp.

Nhóm thứ hai là các bác sĩ thú y, chuyên gia dịch tễ và nhà quản lý trang trại chăn nuôi lợn. Tài liệu giúp hiểu rõ bệnh sinh học phân tử, phân biệt chính xác bệnh tích đại thể, vi thể của PED và TGE, từ đó xây dựng phác đồ an toàn sinh học và chương trình tạo miễn dịch truyền qua sữa đầu tối ưu cho đàn nái và lợn con.

Nhóm thứ ba là giảng viên, nghiên cứu sinh và sinh viên chuyên ngành Thú y, Bệnh học Thủy sản và Công nghệ Sinh học. Luận văn là tài liệu tham khảo mẫu mực về phương pháp luận nghiên cứu vi sinh vật học hiện đại, bao gồm kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng tương đối 2 mũ trừ delta delta CT và phân tích tin sinh học phân tử với BioEdit và MEGA.

Nhóm thứ tư là các cơ quan quản lý nhà nước, viện kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương. Đề tài cung cấp hệ thống số liệu khoa học thực nghiệm tin cậy làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia về đánh giá tính thuần khiết, tính nhược độc và độ ổn định di truyền đối với các dòng vacxin phòng bệnh tiêu chảy ở lợn tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1: Vì sao nghiên cứu bắt buộc phải chọn lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu để thử nghiệm tính nhược độc? Trả lời: Lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu là đối tượng có tính mẫn cảm cao nhất do hệ miễn dịch chưa trưởng thành và hoàn toàn sạch kháng thể thụ động từ mẹ. Thử nghiệm trên đối tượng này với liều cao 10 mũ 5,0 TCID50/ml nếu không gây bất kỳ triệu chứng lâm sàng hay tổn thương ruột nào sẽ chứng minh tính an toàn nhược độc tuyệt đối của chủng giống.

Câu hỏi 2: Protein S đóng vai trò quyết định như thế nào đối với tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh của virus? Trả lời: Protein S có trọng lượng 180 đến 220 kDa, là glycoprotein tạo gai bề mặt giúp virus gắn kết với thụ thể Aminopeptidase N trên niêm mạc ruột. Các vị trí kháng nguyên chính trên protein S kích thích sản sinh kháng thể trung hòa, đồng thời các biến đổi nucleotide tại vùng gen S1 quyết định trực tiếp đến việc làm suy giảm độc lực gây bệnh của virus.

Câu hỏi 3: Phương pháp Realtime RT-PCR định lượng tương đối 2 mũ trừ delta delta CT có ưu thế gì nổi bật? Trả lời: Phương pháp 2 mũ trừ delta delta CT cho phép định lượng chính xác sự biến thiên hàm lượng ARN virus giữa các mẫu bệnh phẩm phân và các đoạn ruột khác nhau mà không cần dựng đường chuẩn tuyệt đối phức tạp. Phân tích melting curve đi kèm bảo đảm độ đặc hiệu 100% của sản phẩm khuếch đại, loại trừ hoàn toàn kết quả dương tính giả.

Câu hỏi 4: Nguyên nhân chính khiến các loại vacxin PED nhập khẩu từ nước ngoài có hiệu quả bảo hộ chưa cao tại Việt Nam là gì? Trả lời: Các vacxin ngoại nhập chủ yếu sản xuất từ chủng cổ điển phân nhóm G1 như CV777 hoặc DR13, trong khi các chủng thực địa gây dịch tại Việt Nam thuộc phân nhóm biến thể G2. Sự sai khác trên 10% amino acid tại protein S làm giảm khả năng trung hòa chéo của kháng thể, khiến đàn lợn đã tiêm phòng vẫn có thể mắc bệnh.

Câu hỏi 5: Căn cứ khoa học nào khẳng định hai chủng virus AVAC duy trì độ ổn định di truyền cao? Trả lời: Qua 20 lần cấy chuyển liên tiếp in vitro từ đời P37 đến P150 đối với PEDV và P5 đến P150 đối với TGEV, kết quả giải trình tự gen S cho thấy tỷ lệ tương đồng nucleotide và amino acid luôn đạt trên 99,5%. Không phát hiện đột biến mất đoạn mới hoặc hiện tượng hồi độc lực, bảo đảm tính đồng nhất giữa các lô sản xuất.

Kết luận

• Chủng virus AVAC/VR/PED.98 ở đời P100 và AVAC/VR/TGE.15 ở đời P130 đạt hiệu giá sinh học cao và ổn định lần lượt là 7,5 log10 TCID50/ml trên tế bào Vero và 8,7 log10 TCID50/ml trên tế bào ST.
• Tính nhược độc và an toàn sinh học được khẳng định 100% trên mô hình lợn sơ sinh mẫn cảm, không gây tiêu chảy, không gây bệnh tích đại thể và duy trì cấu trúc nhung mao ruột ở tỷ lệ chuẩn 7:1.
• Tính ổn định di truyền của gen kháng nguyên chính S được chứng minh qua 20 đời cấy chuyển liên tiếp với độ tương đồng vượt trên 99,5%, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ biến đổi hồi độc lực.
• Đề tài đóng góp nền tảng khoa học và nguồn giống gốc bản địa chuẩn hóa, giải quyết triệt để vấn đề sai khác kháng nguyên giữa vacxin ngoại nhập và các chủng virus thực địa lưu hành tại Việt Nam.
• Trong 12 đến 24 tháng tới, việc đẩy mạnh hoàn thiện công nghệ đông khô và đăng ký lưu hành vacxin nhị giá nhược độc PED - TGE là bước đi cấp thiết; các đơn vị quản lý, viện nghiên cứu và doanh nghiệp chăn nuôi cần tích cực hợp tác chuyển giao công nghệ để sớm đưa sản phẩm vacxin tự chủ vào thực tiễn chăn nuôi lợn bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi hiện chiếm 25% trong đóng góp của ngành nông nghiệp vào tổng thu nhập quốc nội. Đây cũng là ngành giữ vai trò then chốt trong cơ cấu ngành nông nghiệp, trong số các hoạt động chăn nuôi, chăn nuôi lợn là hoạt động chủ đạo, đóng góp 78% tổng sản lượng chăn nuôi. Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 2018, nước ta có trên 28 triệu con lợn , trong khi đó mỗi ná i trung bình đẻ 10 con/lứa. Như vâ ̣y để tiêm phòng đủ tổng đàn với liệu trình 2 liều/ con/lứa đẻ, thì chúng ta cần tới vài triệu liều vacxin phòng bệnh PED và TGE.

Hiện nay, để phòng chống bệnh tiêu chảy trên lơ ̣n do virus TGE và PED gây ra, 3 dòng vacxin phổ biến thường được sử dụng đó là vacxin vô hoa ̣t, vacxin nhươ ̣c đô ̣c và auto vacxin. Vacxin vô hoa ̣t có hiê ̣u quả thấ p, trong khi auto vacxin thường đươ ̣c sử du ̣ng ở các công ty lớn , đem la ̣i hiê ̣u quả cao , tuy nhiên thường chỉ đươ ̣c sử du ̣ng nô ̣i bô ̣. Các vacxin PED đơn giá hoặc đa giá PED và TGE hiện trên thị trường đều từ các hãng nổi tiếng như Intervet, Borhinger hay Merial, các chủng virus sử dụng để sản xuất vacxin là các chủng virus thuộc nhóm cổ điển, không phải là các chủng virus có nguồn gốc từ Việt Nam. Sự khác biê ̣t về di truyề n giữa các chủng vac xin và các chủng thực điạ dẫn đến khả năng bảo hộ của các vacxin PED chỉ ở mức đô ̣ thấ p hoă ̣c trung bình.

Do sự đa dạng và biến đổi nhanh chóng của các chủ ng virus dẫn đến khả năng bảo hô ̣ chéo bị giới hạn khi có các chủng virus khác nhau xâm nhiễm ,vacxin từ các chủng virus PED, TGE đươ ̣c phân lâ ̣p ở Việt Nam sẽ có khả năng bảo hộ tốt do tin ́ h tương đồ ng về di truyề n. Vì vậy,việc phân lập các chủng virus ngoài thực địa đồng thời đánh giá các đặc tính sinh học của virus để sản xuất vacxin là cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài “Một số đặc tính sinh học của chủngTGEV (transmissible gastroenteritis virus) và PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Mục tiêu chung: đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của 2 chủng virus TGEV và PEDV dùng sản xuất vacxin nhược độc.

1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Mục tiêu cụ thể: +) Đánh giá đă ̣c tiń h ổn định hiệu giá của giố ng virus vacxin. +) Đánh giá được tính nhược độc của hai chủng giố ng virus. +) Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng giố ng virus. Ý NGHĨA KHOA HỌC - Kết quả của đề tài là cơ sở để sử dụng 2 chủng giống TGEV và PEDV làm giống gốc cho nghiên cứu sản xuất vacxin nhược độc nhị giá.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS Trên thế giới các nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở lợn đã chỉ ra các tác nhân virus gây tiêu chảy chủ yếu gồm: Coronavirus và Rotavirus, Parvovirus. Trong đó Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) và Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) là 2 virus thuộc nhóm coronavirus, là hai virus gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp ở lợn.

Ở Việt Nam có ít nghiên cứu về virus gây tiêu chảy đặc biệt là TGEV gây bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn.