HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐÀO THỊ NHƯ QUỲNH ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG, NĂNG SUẤT VÀ HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA ĐEN MỚI CHỌN TẠO Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: GS. Phan Hữu Tôn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, Ngày 31 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đào Thị Như Quỳnh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các cá nhân, tập thể và đơn vị khác.
Nhân dịp hoàn thành luận văn cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS. Phan Hữu Tôn (người hướng dẫn khoa học) và thầy giáo ThS. Nguyễn Quốc Trung đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban quản lý đào tạo, thầy giáo, cô giáo và các cán bộ Bộ môn Sinh học phân tửvà CNSH ứng dụng-Khoa Công nghệ sinh học-Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu cây trồng Việt Nam-Nhật Bản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 2 năm học qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên (Tống Thị Khánh Dương- K58CHSNB; Phan Thị Kiều Anh-K58CNSHE) nhóm nghiên cứu khoa học bộ môn sinh phân tửvà CNSH ứng dụngđã tham gia giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình và toàn thể bạn bè đã luôn ở bên, chăm sóc, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn Thạc sĩ này. Hà Nội, Ngày 31 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đào Thị Như Quỳnh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan.
ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. v Danh mục bảng. vi Danh mục đồ thị, hình, sơ đồ, ảnh.
vii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu.
Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây lúa.
Giới thiệu cây lúa. Các giai đoạn phát triển. Năng suất và các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất. Cấu tạo hạt lúa.
Giới thiệu chung về anthocyanin. Cấu trúc hóa học của anthocyanin. Tính chất của anthocyanin. Sự tổng hợp anthocyain ở gạo.
Vai trò của anthocyanin. Sự phân bố của anthocyanin. Cơ sở di truyền của quá trình tổng hợp anthocyanin. Công tác chọn tạo giống lúa đen.
Tình hình chọn tạo giống lúa đen ở thế giới và Việt Nam. 27 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Vật liệu và phương pháp. Vật liệu, hóa chất, và trang thiết bị nghiên cứu.
Vật liệu nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.
Thí nghiệm ngoài đồng ruộng. Đánh giá các đặc điểm nông sinh học và đo năng suất. Phương pháp đo anthocyanin. Phương pháp xác định gen Rc và Rd.
Phương pháp đo mức độ chống oxy hóa. Kết quả và thảo luận. Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học. Kết quả đánh giá năng suất.
Kết quả xác định hàm lượng anthocyanin. Màu sắc thân, lá, vỏ, hạt lúa. Kết quả đánh giá hàm lượng anthocyanin. Kết quả xác định gen Rc và gen Rd.
Kết quả xác định gen Rc. Kết quả xác định gen Rd. Kết quả xác định khả năng chống oxi hóa. Kết luận và kiến nghị.
70 Tài liệu tham khảo. 75 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AC Anthocyanin bHLH Basic helix-loop-helix CT Công thức DFR Dihydroflavonol-4-reductase DNA Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2 -diphenyl -1-picrylhydrazyl MAS Marker Assisted-Selection PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative trait loci RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SD Standard Deviation- Độ lệch chuẩn SSR Simple Sequence Repeat v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Màu sắc anthocyanin trong các môi trường pH khác nhau. Các anthocyanin trong một số nguồn thực vật.
Các gen lúa tham gia vào tổng hợp flavonoid. Danh sách 36 dòng/giống lúa nghiên cứu. Trình tự primer PCR. Điều kiện nhiệt độ trong các chu kỳ PCR.
Các đặc điểm nông sinh học của các dòng. Các yếu tố cấu thành nên năng suất. Năng suất của các dòng. Các nhóm dòng phân theo màu sắc vỏ lụa.
Kết quả xác định hàm lượng anthocyanin trong 36 dòng lúa đen. Nhóm mẫu giống phân theo hàm lượng anthocyanin (%). Hàm lượng anthocyanin và màu sắc vỏ lụa của 36 dòng lúa đen. Bảng so sánh tương quan giữa sự có mặt của gen Rc với hàm lượng anthocyanin.
Phần trăm loại bỏ DPPH 10 dòng lúa đen. Giá trị IC50 ở 10 mẫu AC lúa đen. 66 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH, SƠ ĐỒ, ẢNH Hình 2. Mô hình cây lúa.
Hình dạng của các hạt thóc. Cánh đồng lúa nếp than Yên Bái - Hà Giang. Sơ đồ phát triển cây lúa. Cấu tạo hạt lúa.
Hình Cấu tạo vỏ trấu. Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin của anthocyanin. Thay đổi về cấu trúc, màu sắc anthocyanin trong môi trường pH khác nhau. Con đường sinh tổng hợp anthocyanin.
Sự tạo phức giữa cyanidin và DNA. Kiểu hình và bản đồ chi tiết của Rc. Sơ đồ mô tả vị trí tương đối và các marker DNA trên locus Rc trên nhiễm sắc thể số 7. Gạo đen Trung Quốc.
Kết quả của phép lai giữa giống Koshihikari với giống Hong Xie Nuo. Giống Nếp cẩm mới ĐH6. Phản ứng trung hòa DPHH. Biểu đồ thể hiện ngày trỗ của các dòng.
Biểu đồ thể hiện chiều cao cây cuối cùng các dòng. Biểu đồ thể hiện chiều dài lá đòng của các dòng. Biểu đồ thể hiện chiều rộng lá đòng của các dòng. Biểu đồ thể hiện tổng số hạt/bông của các dòng.
Biểu đồ thể hiện chiều dài bông lúa của các dòng. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ hạt chắc/bông (%) của các dòng. Biều đồ thể hiện khối lượng 1000 hạt (g) của các dòng. Biểu đồ thể hiện năng suất của các dòng.
Cây lúa đen có gốc tím đen, thân và lá màu xanh. 49 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sự khác biệt về màu sắc hạt lúa của các dòng khác nhau. Màu sắc vỏ trấu của 36 dòng lúa đen.
Màu sắc vỏ lụa của 36 dòng lúa đen. Hàm lượng anthocyanin 36 dòng lúa đen. Hình ảnh 2 dòng có hàm lượng athocyanin cao nhất. Hình ảnh 2 dòng có hàm lượng anthocyanin thấp nhất.
Hình ảnh 5 dòng không đo được hàm lượng anthocyanin. Mẫu phân tích BR14, BR17, BR11, BR15, BR26, BR29, BR27, BR3 và BR4 để đo quang phổ. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 36 mẫu dòng với mồi qPC7. Sơ đồ biểu diễn của các locus trong tổng hợp pro-anthocyanidin trong hạt gạo.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của 36 mẫu dòng với mồi RM11292. Hình ảnh dịch chiết AC thu được từ 10 dòng. DPPH sau khi ủ 30 phút trong bóng tối. Biểu đồ thể hiện khả năng loại bỏ gốc tự do của 10 mẫu AC.
66 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đào Thị Như Quỳnh Tên Luận văn: Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, năng suất và hàm lượng anthocyanin của một số dòng lúa đen mới chọn tạo. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm chọn lọc được những dòng lúa đen mới có năng suất và hàm lượng anthocyanin cao từ 36 dòng lúa đen mới chọn tạo tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng Việt Nam và Nhật Bản (CIPR); nhằm phát triển ra sản xuất các giống lúa có giá trị dược liệu. Gạo đen là loại gạo có hàm lượng dinh dưỡng cao: protein, chất béo, caroten, axit amin, anthocyanin và các nguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể. Anthocyanin là chất có khả năng kháng oxy hóa cao và có hàm lượng cao trong lúa đen, ngoài ra có lợi cho sức khỏe của con người và ngăn ngừa một số bệnh nguy hiểm.
Phương pháp nghiên cứu Để tiến hành đề tài ta thực hiện các thí nghiệm sử dụng phương pháp bố trí thí nghiệm để đánh giá năng suất và các chỉ tiêu nông sinh học thu được. Tiếp tục xác định hàm lượng anthocyanin của 36 mẫu gạo đen dựa theo Yang et al. Đồng thời thực hiện các nghiên cứu di truyền phân tử để phân tích di truyền các gen tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin. Kết quả chính và kết luận Kết quả thu được các dòng lúa đen có hàm lượng anthocyanin cao nhất: BR14, BR17, BR30, BR6, BR35, BR8, BR1, BR5, trong đó năng suất thực thu của 4 dòng khá cao: BR6 (6,05 tấn/ha), BR8 (8,67 tấn/ha), BR1 (4,43 tấn/ha), BR17 (4,51 tấn/ha).
Kết quả xác định gen bằng chỉ thị phân tử đã xác định được 14 dòng mang gen Rc, 14 dòng mang gen Rd và 17 dòng không mang gen Rc và Rd. Kết hợp việc thực hiện đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng DPPH của 10 dòng điển hình kết quả cuối cùng thu được dòng BR6 và BR8 có năng suất, hàm lượng anthocyanin và hoạt tính chống oxi hóa cao có thể ứng dụng vào trong sản xuất. Các số liệu thu được trong nghiên cứu này cung cấp những thông tin quan trọng cho việc chọn lọc giống lúa dược liệu đặc sản và chất lượng áp dụng vào sản xuất. Từ khóa: lúa đen, hàm lượng anthocyanin, chống oxi hóa, năng suất, nông sinh học.