ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, tình hình gia tăng các loại bệnh hiểm nghèo đang là mối lo ngại của các quốc gia trên trế giới. Các nhà khoa học đang dày công nghiên cứu, tìm ra các liệu pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề trên. Con ngƣời đang dần chuyển hƣớng từ việc sử dụng các loại thuốc đƣợc tổng hợp hóa học sang ƣu tiên sử dụng các loại thực phẩm chức năng, các loại thuốc có nguồn gốc hữu cơ từ thiên nhiên. Và các loài nấm dƣợc liệu là đối tƣợng đƣợc chú ý nhiều nhất vì sự đa dạng về các hợp chất sinh học mà chúng chứa trong sinh khối.
Từ xƣa, con ngƣời đã biết sử dụng một số loại nấm bổ sung trong các phƣơng thuốc cổ truyền để chữa bệnh cũng nhƣ bồi bổ sức khỏe, nhƣ nấm linh chi, nấm lim xanh, nấm tuyết (mộc nhĩ trắng), v.v, và đặc biệt là nấm Đông trùng hạ thảo. Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps là loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng. Hơn 400 phân loài nấm thuộc chi Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 loài đƣợc nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al. Trong số những loài này, chỉ có loài C.
militaris đã đƣợc trồng thành công ở quy mô lớn và có chứa nhiều các chất có hoạt chất sinh học (Li et al, 2006). militaris, phân bố ở vùng núi có độ cao từ 2.000 m so với mực nƣớc biển, có chứa hàm lƣợng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể nhƣ: cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise và nhiều thành phần hoạt chất quý khác. Nhờ các hợp chất sinh học giá trị này nên loại nấm C. militaris đƣợc quan tâm nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt là các công trình nghiên cứu về lâm sàng, nhƣ: nghiên cứu kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thƣ máu (Kim et al.,2005), ung thƣ phổi, ung thƣ vú (Ahn Y.
Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J., 2001), sự LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S. Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J., 2005), Nấm này có khả năng duy trì tốt chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính (Das et al. sinensis hiện nay đang đƣợc nghiên cứu rất nhiều về nuôi trồng, lên men, chiết xuất và sản xuất các dƣợc chất; do có giá tri dƣợc liệu và giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al. sinensis là một loại nấm dƣợc liệu có phân bố rất hạn chế trong tƣ nhiên và đến nay chƣa có công trình nào báo cáo nuôi cấy thành công nên rất khan hiếm.
militaris chứa các hợp chất sinh học tƣơng tự nhƣ loài C.sinensis, nhƣng dễ dàng nuôi trồng trong môi trƣờng nhân tạo (Li et al. 1995; Dong et al. Do giá tri dƣợc liệu, giá trị kinh tế cao nên hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nuôi trồng loài nấm C. militaris đã đƣợc công bố và áp dụng vào sản xuất.
Tuy nhiên, hầu hết các công trình công bố là nuôi trồng nấm C. militaris trên môi trƣờng tổng hợp bổ sung bột nhộng tằm, pepton, cao nấm men hoặc nuôi cấy trên ký chủ nhộng tằm. Với mong muốn, tạo ra một sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C. militaris có chất lƣợng tốt, gần giống với tự nhiên; chúng tôi tiến hành đề tài hiên cứu: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo 1. Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo Trong lịch sử phát triển của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo (nấm ĐTHT) là một loại thuốc quý đƣợc sử dụng từ hàng ngàn năm trƣớc và chỉ dùng cho các bậc vua chúa. Theo đông y Trung Quốc, loại nấm này có tác dụng hỗ trợ chữa nhiều bệnh nhƣ bệnh về phổi, về thận, đổ mồ hôi trộm, đau lƣng, yếu sinh lý.
Chính vì vậy, nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc ngƣời Trung Quốc xem nhƣ nhân sâm (Theo Sách y học cổ truyền Trung Quốc). Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) là chỉ các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng. Vào mùa đông, sâu non, sâu trƣởng thành của một số loài nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết. Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh phát triển ở dạng hệ sợi.
Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhƣng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Vì mùa đông nấm ký sinh trên côn trùng, mùa hạ mọc thành quả thể nấm nên có tên Đông trùng hạ thảo. Để thu hoạch nấm ngƣời ta thƣờng đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc. Ngày nay, hiệu quả sử dụng của các chất dinh dƣỡng trong nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc khoa học chứng minh.
Nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên, nuôi trồng để làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho con ngƣời. Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps. Loài này đƣợc Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi, 1982). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lƣợng loài và phổ ký chủ.
Ƣớc tính có hơn 400 loài trong chi này (Mains, 1958; Kobayasi et al, 1982; Stensrud et al. militaris thuộc giới Nấm, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps và loài C. Tên khoa học Cordyceps militaris (L. Nấm Đông trùng hạ thảo C.
militaris là loài nấm ký sinh trên sâu bƣớm, quả thể có màu cam, chiều dài 8 - 10 cm. Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng, quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa. Các nang bào tử dài từ 300 - 510 µm, bề rộng 4 µm. Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thƣớc 3,5 - 6 1 – 1,5 µm.
Các bào tử nang này trong điều kiện ngh o dinh dƣỡng s đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp. Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc M , châu Âu và châu Á (Paul et al, 2008). Đông trùng hạ thảo C. militaris ngoài tự nhiên.
Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy đƣợc vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000 m nhƣ cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam, v. Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo. Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và châu Úc. Tuy nhiên, cho đến nay ngƣời ta mới chỉ nghiên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 cứu nhiều 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dƣợc liệu tốt với con ngƣời.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của Đông trùng hạ thảo vào cơ thể côn trùng Vào mùa đông, bào tử nấm ĐTHT có trong đất s dính vào bên ngoài sâu hay nhộng của các loài bƣớm khác nhau.
Sau đó bào tử nấm s nảy mầm thành ống có các thể bám. Các ống này s tiết các enzyme kitanase, lipase, protease phá hủy vỏ ngoài ký chủ, xâm nhập vào mô bên trong cơ thể. Trong cơ thể ký chủ, hệ sợi nấm hút chất dinh dƣỡng và phát triển mạnh m chiếm toàn bộ cơ thể, gây chết ký chủ, vỏ cứng lại để bảo vệ sợi nấm. Đến mùa hè, hệ sợi nấm s nảy chồi, s làm nứt vỏ kitin của sâu, rồi phát triển thành quả thể.
Quả thể sinh sản hình thành bào tử trong các túi bào tử. Sau đó túi bào tử nứt ra, bào tử phóng thích ra môi trƣờng. Đến mùa đông, trứng côn trùng nở thành sâu, nhộng, ngẫu nhiên bị bào tử xâm nhập.Vòng đời cứ thế tiếp tục (Kobayasi et al, 1982; Kamble et al, 2012). Qủa thể nấm C.
militaris thƣờng có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng et al. Sự lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng Theo Bách khoa toàn thƣ thì nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể sâu đến nay vẫn chƣa rõ nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dƣỡng trong cơ thể sâu.
Đến một giai đoạn nhất định, nấm phát triển thành quả thể nấm (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính: (1) Giai đoạn xâm nhập Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tƣơng ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ dày nhƣ Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, Naxetylglucosaminidase, cenlulase. Các enzyme này đƣợc tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài (Nguyễn Lân Dũng et al., 2006) Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein).
Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kém phần quan trọng. Nhƣng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng. (2) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm.