Luận án TS. Dương Tiến Anh: Tổng hợp Dẫn chất Ức chế HDAC kháng ung thư

Luận án Tiến sĩ Dược học tổng hợp và đánh giá các dẫn chất mới có tác dụng kháng ung thư thông qua cơ chế ức chế Histon Deacetylase (HDAC).

• Tác giả: Dương Tiến Anh
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Hải Nam
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Tổng Hợp Và Đánh Giá Tác Dụng Kháng Ung Thư Của Một Số Dẫn Chất N-Hydroxyheptanamid, N-Hydroxypropenamid Và N-Hydroxybenzamid Mới Hướng Ức Chế Histon Deacetylase
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Ức chế HDAC và Tầm quan trọng trong Điều trị Ung thư

Ức chế HDAC (Histone Deacetylase Inhibitors) đã trở thành một hướng nghiên cứu tiềm năng trong phát triển chất kháng ung thư mới. Histon deacetylase là các enzyme quan trọng điều chỉnh biểu hiện gen thông qua cơ chế hủy bỏ acetyl groups trên các histone proteins. Khi hoạt động bất thường, các enzyme này góp phần vào sự phát triển của các tế bào ung thư. Việc ức chế HDAC giúp phục hồi hoạt động của các gen ức chế khối u, từ đó kích hoạt apoptosis trong tế bào ung thư. Luận án của Dương Tiến Anh tập trung vào tổng hợp dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid mới, mở ra những cơ hội mới trong phát triển thuốc chống ung thư hiệu quả hơn và an toàn hơn cho bệnh nhân.

1.1. Cơ chế hoạt động của Histon Deacetylase

Histon deacetylase hoạt động bằng cách loại bỏ các nhóm acetyl khỏi histone, dẫn đến nén chặt DNA và làm giảm biểu hiện gen. Các enzyme này được chia thành các nhóm I, II, và IV với những đặc điểm sinh học khác nhau. Ức chế HDAC làm tăng acetylation của histone, mở rộng cấu trúc chromatin và cho phép các gen ức chế khối u hoạt động trở lại. Cơ chế này đặc biệt hữu ích trong điều trị các bệnh ung thư được điều khiển bởi epigenetic.

1.2. Ý nghĩa lâm sàng của chất kháng ung thư mới

Những chất kháng ung thư mới từ nhóm ức chế HDAC mang lại hy vọng trong điều trị nhiều loại ung thư. So với các liệu pháp truyền thống, những dẫn chất này có khả năng gây tác dụng phụ ít hơn và hiệu quả cao hơn. Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy chúng có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng, ung thư máu và nhiều loại ung thư khác.

II. Cấu trúc Hóa học của Dẫn chất N hydroxyheptanamid N hydroxypropenamid và N hydroxybenzamid

Trong luận án tiến sĩ của Dương Tiến Anh, việc tổng hợp các dẫn chất mới được thực hiện thông qua các phản ứng hóa học phức tạp. Nhóm N-hydroxyheptanamid chứa một chuỗi heptanoyl dài, trong khi N-hydroxypropenamid có chuỗi ngắn hơn. Các dẫn chất N-hydroxybenzamid lại sở hữu nhóm benzene tạo nên tính chất thơm. Sự khác biệt về cấu trúc này ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính ức chế HDAC và tác dụng kháng ung thư. Những hợp chất này được thiết kế dựa trên nguyên tắc rằng nhóm N-hydroxy là yếu tố thiết yếu để ức chế các enzyme deacetylase hiệu quả. Việc thay đổi các nhóm thay thế trên phân tử cho phép tinh chỉnh hoạt tính sinh học.

2.1. Đặc điểm cấu trúc của N hydroxyheptanamid

Dẫn chất N-hydroxyheptanamid là những hợp chất với nhóm hydroxamic acid dài gắn với chuỗi heptanoyl. Chuỗi lipophilic này cho phép dễ dàng xuyên qua màng tế bào và tiếp cận với HDAC trong hạt nhân. Các thay đổi về vị trí nhóm thay thế trên vòng aromatic tạo ra một loạt các dẫn chất với hoạt tính khác nhau, từ đó cho phép tối ưu hóa các tính chất dược động học.

2.2. Đặc tính riêng của N hydroxypropenamid và N hydroxybenzamid

N-hydroxypropenamid có chuỗi ngắn hơn, dẫn đến tính tan trong nước cao hơn và sự hấp thu nhanh hơn. N-hydroxybenzamid kết hợp nhóm benzamide với N-hydroxy, tạo ra sự cân bằng tốt giữa lipophilicity và hydrophilicity. Những khác biệt này làm cho chúng có tiềm năng ứng dụng khác nhau trong các thí nghiệm in vitro và in vivo.

III. Phương pháp Tổng hợp và Kỹ thuật Xác định Cấu trúc

Tổng hợp các dẫn chất ức chế HDAC trong luận án liên quan đến nhiều phản ứng hóa học phức tạp. Phản ứng Heck được sử dụng để tạo các liên kết C-C giữa các hợp chất aromatic thông qua xúc tác palladi. Phản ứng N-acyl hóa giới thiệu nhóm hydroxamic acid cần thiết cho hoạt tính ức chế. Các phản ứng ngưng tụ như Niementowski condensation tạo ra các khung quinazolin-4(3H)-on phức tạp. Sau khi tổng hợp, các hợp chất được tinh sạch thông qua chromatography cột và xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật phân tích. Độ tinh khiết được kiểm tra bằng HPLC để đảm bảo chất lượng cao cho các thử nghiệm sinh học.

3.1. Phản ứng Heck trong Tổng hợp dẫn chất

Phản ứng Heck là một công cụ mạnh mẽ trong tổng hợp hóa học hiện đại, cho phép tạo liên kết carbon-carbon giữa halogenoalkene và alkene. Trong luận án, phản ứng này được tối ưu hóa với xúc tác palladi hiệu quả cao và phối tử thích hợp. Cơ chế liên quan đến các giai đoạn insertion, migratory insertion và β-hydride elimination.

3.2. Xác định cấu trúc bằng Phổ NMR và MS

Các hợp chất được xác định cấu trúc sử dụng ¹H-NMR và ¹³C-NMR spectroscopy để khảo sát các hiệp hóa học và liên kết. Phổ khối lượng được dùng xác định khối lượng phân tử chính xác. Phổ hồng ngoại cung cấp thông tin về các nhóm chức năng. Sự kết hợp các kỹ thuật này đảm bảo xác định cấu trúc hoàn toàn cho mỗi dẫn chất mới.

IV. Hoạt tính Sinh học và Tiềm năng Lâm sàng của Chất kháng ung thư mới

Các chất kháng ung thư mới được tổng hợp trong luận án đã được đánh giá hoạt tính ức chế HDAC thông qua các thử nghiệm enzymatic in vitro. Những hợp chất này thể hiện hoạt tính ức chế mạnh mẽ đối với HDAC2 và các isoforms khác. Các thử nghiệm kháng tế bào được tiến hành trên dòng tế bào ung thư buồng trứng 2780AD kháng thuốc adriamycin, cho thấy một số dẫn chất có hoạt tính kháng ung thư vượt trội. Đánh giá ảnh hưởng chu kỳ tế bào cho thấy các hợp chất này gây dừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G1/S hoặc G2/M. Kích hoạt apoptosis được xác nhận qua các thử nghiệm flow cytometry và western blot. Các dự đoán thông số dược động học cho thấy các dẫn chất có độ hấp thu tốt và độc tính thấp, mở ra triển vọng ứng dụng lâm sàng trong tương lai.

4.1. Hoạt tính Ức chế HDAC in vitro

Các chất kháng ung thư được đánh giá khả năng ức chế HDAC bằng các assay enzymatic sử dụng HDAC recombinant. Kết quả cho thấy những dẫn chất với nhóm N-hydroxy và chuỗi lipophilic dài thể hiện hoạt tính ức chế mạnh mẽ nhất. IC50 của một số hợp chất đặc biệt có thể đạt nanoM range, so sánh được với các thuốc tham chiếu như Vorinostat và Panobinostat.

4.2. Hoạt tính kháng ung thư và cơ chế tác dụng

Các thử nghiệm MTT và hoạt tính kháng tế bào cho thấy chất kháng ung thư mới có hiệu quả rõ rệt trên tế bào ung thư. Mechanism studies chứng minh chúng gây apoptosis qua cơ chế tăng acetylation histone. Một số dẫn chất thậm chí thể hiện tác dụng trên các tế bào chịu kháng thuốc, mở ra hướng mới cho điều trị ung thư chịu thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là một trong những bệnh hiểm nghèo và có tỉ lệ tử vong cao, làm hao tổn chi phí cũng như sức lực của bệnh nhân và xã hội. Những năm trước đây, các thuốc điều trị ung thư thường được lựa chọn là những thuốc có độc tính cao như doxorubicin, 5-fluorouracin, busulfan, methotrexat… Hiện nay, cùng những thành tựu mang tính đột phá trong lĩnh vực sinh học thì hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống ở mức độ tế bào, mức độ phân tử ngày càng được làm rõ. Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính so với các phương pháp hóa trị cổ điển. Một số đích tác dụng mà các thuốc chống ung thư hiện nay đang hướng đến như các protein kinase, protein gây ung thư Bcl-2, HAT, HDAC… trong đó đích HDAC đang mở ra nhiều triển vọng.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [71], [107]. Trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt, trong đó điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL), có cấu trúc kiểu N-hydroxyheptanamid [45]. Sau đó là belinostat (Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư, có cấu trúc N-hydroxypropenamid [45]. Một số dẫn chất N-hydroxybenzamid khác như givinostat, abexinostat, tubastatin A, nexturastat A… đang tiếp tục được thử nghiệm lâm sàng ở các pha khác nhau với các loại ung thư khác nhau [100].

Ngoài ra, một số thuốc khác thuộc nhóm ức chế HDAC có cấu trúc benzamid. Điều này cho thấy các kiểu dẫn chất trên đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà hóa dược. Trên cơ cở những nghiên cứu về các chất ức chế HDAC ở Việt Nam cũng như trên thế giới, luận án “Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid mới hướng ức chế histon deacetylase” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp được khoảng từ 40 đến 50 dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N- hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid mới hướng ức chế histon deacetylase.

Đánh giá được tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp. Giới thiệu về histon deacetylase Quá trình acetyl hóa/deacetyl hóa nhờ các enzym của histon được quan sát lần đầu tiên vào những năm 1960. Trong cùng khoảng thời gian này, vai trò của nhiễm sắc thể (NST) trong điều hòa gen, mối quan hệ giữa sự thay đổi trong quá trình acetyl hóa histon và quá trình truyền thông tin di truyền trong ADN bắt đầu được phát hiện [202]. Ngày nay, người ta đã chứng minh rằng quá trình acetyl hóa thuận nghịch của histon cùng với quá trình methyl hóa và phosphoryl hóa ADN là những yếu tố điều chỉnh quan trọng nhất của quá trình sao chép gen, liên quan đến khả năng tiếp cận ADN.

Do đó, đây là một cơ chế quan trọng trong di truyền học biểu sinh của phiên mã gen [154]. Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC). Quá trình acetyl hóa histon được thực hiện bởi enzym HAT. Enzym này tác động lên nhóm ε-NH2 của lysin tận cùng, có mặt trong bốn loại histon H2A, H2B, H3 và H4 [72].

Quá trình acetyl hóa dẫn đến mất điện tích dương ở chuỗi bên và do đó làm mất tương tác ion với nhóm phosphat tích điện âm trong các nucleotid của ADN. Điều này làm cho nhiễm sắc thể tháo xoắn và giúp cho quá trình phiên mã dễ dàng hơn. Hơn nữa, quá trình acetyl hóa có thể làm xáo trộn tương tác protein-protein (protein-protein interaction - PPI) giữa các histon khác nhau trong nucleosom và do đó làm thay đổi cấu trúc của vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin). HDAC, có thể được gọi là protein deacetylase (PDAC) vì một số mục tiêu của chúng là protein không chứa histon, là một nhóm gồm mười một enzym phụ thuộc kẽm đang trở thành một trong các mục tiêu điều trị trong nghiên cứu ung thư.

Biểu hiện bất thường của chúng trong nhiều tế bào ung thư làm thay đổi biểu hiện của gen ức chế khối u (TSG) và các gen liên quan đến chức năng tế bào bình thường. Việc tác động lên các tế bào ung thư bằng các chất ức chế HDAC là một điểm khởi đầu để tái chuẩn hóa biểu hiện TSG, dẫn đến quá trình apoptosis của tế bào ung thư [145]. Các HDAC chịu trách nhiệm loại bỏ nhóm acetyl của lysin từ các protein bao gồm histon và một nhóm protein lớn liên quan đến các chức năng khác nhau như các yếu tố phiên mã (p53, Rb và hơn 60 loại khác), chính các HAT và HDAC, các enzym xử lý ARN (RNA processing enzyme), EF1α tham gia vào quá trình dịch mã, các enzym chuyển hóa, protein của bộ xương tế bào (cytoskeleton) như α-tubulin, actin, cortactin, protein liên quan đến tín hiệu tế bào, apoptosis, sửa chữa ADN, tái tổ hợp và sao chép, protein chaperon và protein virus [141], [232]. Do đó, quá trình deacetyl của histon giúp ức chế biểu sinh và đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã cũng như tiến trình phát triển của chu kỳ tế bào.

Phân loại Siêu họ enzym histon deacetylase bao gồm các histon deacetylase của sinh vật nhân thực (eukaryot), protein sử dụng acetoin (acetoin utilization proteins - ACUC) ở vi khuẩn và acetylpolyamin amidohydrolase (APHA) ở vi khuẩn và một số sinh vật nhân thực (eukaryot) [117]. Cho đến thời điểm hiện tại, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người và chúng được chia thành 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men [54], [56], [76], [145], [169]: - Nhóm I: Các HDAC nhóm này có sự tương đồng với enzym HDA của nấm men, bao gồm các HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. - Nhóm II: Các HDAC nhóm này có sự tương đồng với enzym HDB của nấm men, được chia làm hai phân nhóm nhỏ hơn: + Phân nhóm IIa: bao gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9. + Phân nhóm IIb: bao gồm HDAC6, HDAC10.

- Nhóm III: Các HDAC nhóm này có sự tương đồng với protein nấm men Sir2 còn được gọi là các sirtuin. Chúng là các HDAC hoạt động phụ thuộc vào NAD+, không 3 liên quan đến cấu trúc hoặc cơ chế xúc tác với các nhóm khác và sẽ không được thảo luận trong luận án này. Chúng bao gồm các sirtuin 1-7. - Nhóm IV: Nhóm này chỉ có duy nhất một đại diện là HDAC11.

Cấu trúc của HDAC11 không có sự tương đồng với HDA hay HDB của nấm men. Các HDAC nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển”, là những enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [73].

Các HDAC khác nhau có chiều dài khác nhau, chuỗi acid amin thay đổi từ 347 ở HDAC11 (HDAC có chiều dài ngắn nhất) đến 1215 ở HDAC6 (HDAC có chiều dài lớn nhất). Tuy nhiên, cấu trúc vùng xúc tác cho quá trình deacetyl hóa được bảo tồn. Sự khác biệt giữa các HDAC được tìm thấy ở cấu trúc lối vào của trung tâm hoạt động. Các HDAC nhóm I có một khoang phụ nằm bên trong trung tâm hoạt động, có vai trò là lối vào của phân tử nước và là lối ra của phân tử acid acetic.

Khoang phụ này không được tìm thấy ở các HDAC nhóm II, phân tử nước và acid acetic có thể đi qua lối vào/lối ra khác. Đối với các HDAC nhóm III, nhóm acetyl loại bỏ được liên kết với ADP-ribose trong cuối phản ứng xúc tác. Vị trí phân bố của các HDAC cũng có sự khác biệt, HDAC nhóm I và nhóm IV chủ yếu được tìm thấy ở nhân tế bào, nhóm IIb được tìm thấy chủ yếu ở bào tương, nhóm IIa được tìm thấy ở nhân và bào tương và nhóm III được tìm thấy ở cả ở nhân, bào tương và ty thể [169]. Cơ chế xúc tác của các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV Đã có rất nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của các enzym histon deacetylase phụ thuộc Zn2+ như nghiên cứu của Finnin năm 1999 [67], nghiên cứu của Vanommeslaeghe năm 2005 [201], nghiên cứu của Corminboeuf năm 2006 [50] và gần đây nhất là nghiên cứu của Gantt năm 2016 [68].

Các nghiên cứu này dựa vào cấu trúc tinh thể của protein tương tự HDAC ở người (HDLP) để nghiên cứu cơ chế xúc tác cho phản ứng deacetyl hóa của chúng. Trong cấu trúc vùng xúc tác của cả HDLP và HDAC8 đều đặc trưng bởi sự bao bọc ion Zn2+ bằng 2 dipeptid His131-Asp166 và His132-Asp173. Cơ chế xúc tác ban đầu được đề xuất cho HDLP và sau đó được chứng minh là đúng cho cả HDAC8 [185]. Do cấu trúc vị trí xúc tác của HDAC có sự tương đồng với các zinc protease và serin protease nên các nhà khoa học đã đề xuất cơ chế xúc tác của HDAC dựa trên cơ chế của các enzym này.

Bước đầu tiên, tương tự như các protease 4 chứa kẽm, nhóm carbonyl của N-acetyl amid của cơ chất được acetyl hóa tương tác với ion Zn2+ ở vị trí xúc tác, làm cho liên kết C=O phân cực do đó làm tăng tính ái điện tử của C nhóm carbonyl. Ngoài ra, phân tử nước được phối trí với ion Zn2+ [67], [185]. Quá trình tấn công ái nhân từ phân tử nước phối trí với Zn2+ vào carbonyl được tạo điều kiện thuận lợi bởi sự tương tác với cặp acid amin histidin-aspartat His142- Asp176 theo cách tương tự như ở serin protease. Sau quá trình này, hợp chất trung gian carbon tứ diện được hình thành và được ổn định bằng cả Tyr306 và liên kết phối trí với ion Zn2+.

Cuối cùng, liên kết C-N bị bẻ gãy và quá trình này được hỗ trợ bởi dipeptid thứ hai His143-Asp183. Cặp acid amin này còn giúp chuyển một proton lên nguyên tử N, tạo thành chức amin của sản phẩm [44], [68], [225]. Cho đến nay, các mô hình khác nhau của cơ chế xúc tác được đề xuất cho HDAC8 do isoform này dễ thao tác in vitro và trở thành một đối tượng cho nghiên cứu về HDAC xúc tác phụ thuộc Zn2+.