Luận án tiến sĩ nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh cứng ăn lá chrysomelidae và mối qjuan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường vườn quốc gia núi chúa tỉnh ninh thuận bằng phương pháp sinh học phân tử

Nghiên cứu đa dạng họ bọ cánh cứng Chrysomelidae và mối quan hệ với thực vật tại vườn quốc gia Núi Chúa, Ninh Thuận bằng phương pháp sinh học phân tử.

• Tác giả: Nguyễn Thị Định
• Người hướng dẫn: Tiến Sĩ Jesús Gómez-Zurita
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh thái học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Dạng Họ Bọ Cánh Cứng Ăn Lá Tại Vườn Quốc Gia Núi Chúa, Ninh Thuận
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Các vấn đề liên quan đến luận án
• 1.2. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học
• 1.3. Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan
• 1.4. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để tăng tốc độ đánh giá đa dạng sinh học
• 1.5. Sự không đồng nhất của môi trường và ảnh hưởng của nó đến đa dạng sinh học
• 1.6. Chrysomelidae là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng sinh học và nghiên cứu sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái
• 1.7. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae ở Việt Nam
• 1.8. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới
• 1.9. Khái quát về điều kiện tự nhiên – kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu
• 1.9.1. Vị trí địa lý
• 1.9.2. Khí hậu, thủy văn
• 1.9.3. Đặc điểm sinh thái thảm thực vật
• 1.9.4. Hệ động, thực vật
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp thu mẫu và phân chia sinh cảnh ở VQG Núi Chúa
• 2.2. Thiết kế và thu thập mẫu vật
• 2.3. Phân chia sinh cảnh trong khu vực thu mẫu ở VQG Núi Chúa
• 2.4. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.4.1. Phương pháp xác định loài Chrysomelidae
• 2.4.2. Phương pháp xác định thức ăn của các loài Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa
• 2.4.3. Đánh giá độ giàu loài tiềm năng của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa
• 2.4.4. Nhóm các phương pháp xác định mối liên quan của Chrysomelidae với điều kiện môi trường
• 2.4.5. Phân tích biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian
• 2.4.6. Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA) để tìm ra nhân tố tác động tới mối liên hệ giữa Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng
• 2.4.7. Đánh giá đa dạng beta của mối tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng theo độ cao (sinh cảnh)
• 2.4.8. Phân tích mô hình của mạng lưới tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân định vùng chuyển tiếp sinh thái
• 3.2. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa
• 3.3. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên đặc điểm hình thái
• 3.4. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên dữ liệu ADN
• 3.5. Tiềm năng đa dạng loài Chrysomelidae đạt được ở VQG Núi Chúa
• 3.6. Đánh giá độ giàu loài của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa
• 3.7. Thực vật chủ của Chrysomelidae
• 3.8. Sự biến đổi của quần xã Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa
• 3.9. Cấu trúc của quần xã Chrysomelidae xuyên qua không gian và độ cao ở VQG Núi Chúa
• 3.10. Ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” (sự chiếm cứ giữa lãnh thổ) tới Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa
• 3.11. Sự biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian
• 3.12. Sự thay đổi của tương tác giữa Chrysomelidae và thực vật chủ theo sự thay đổi của độ cao
• 3.13. Sự sắp xếp phù hợp với quy chuẩn. Đa dạng beta của tương tác Galerucinae và thực vật chủ theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa
• 3.14. Hoạt động bảo tồn ở VQG Núi Chúa cần chú ý đến sự mất môi trường sống của quần xã Chrysomelidae
• DANH SÁCH TÀI LIỆU TRÍCH DẪN
• DANH SÁCH CÁC CÔNG BỐ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đa Dạng Họ Bọ Cánh Cứng Ăn Lá

Nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) tại Vườn Quốc Gia Núi Chúa, Ninh Thuận, mang lại cái nhìn sâu sắc về sự phong phú của hệ sinh thái nơi đây. Họ bọ cánh cứng này không chỉ là một phần quan trọng trong chuỗi thức ăn mà còn có vai trò trong việc duy trì sự cân bằng sinh thái. Việc nghiên cứu này giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa chúng và thực vật, từ đó có thể đưa ra các biện pháp bảo tồn hiệu quả.

1.1. Đặc Điểm Sinh Thái Của Vườn Quốc Gia Núi Chúa

Vườn Quốc Gia Núi Chúa có hệ sinh thái đa dạng với nhiều loại thực vật và động vật. Đặc điểm khí hậu và địa hình nơi đây tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loài bọ cánh cứng. Sự đa dạng sinh học ở đây không chỉ phong phú mà còn đặc sắc, với nhiều loài chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng.

1.2. Vai Trò Của Bọ Cánh Cứng Trong Hệ Sinh Thái

Bọ cánh cứng ăn lá đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của thực vật. Chúng không chỉ là thức ăn cho nhiều loài động vật khác mà còn giúp duy trì sự cân bằng sinh thái. Nghiên cứu về chúng giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ phức tạp trong hệ sinh thái.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Đa Dạng Họ Bọ Cánh Cứng

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu đa dạng họ bọ cánh cứng tại Vườn Quốc Gia Núi Chúa cũng gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như biến đổi khí hậu, sự xâm lấn của loài ngoại lai và sự thay đổi môi trường sống đang đe dọa đến sự tồn tại của nhiều loài bọ cánh cứng. Việc nhận diện và bảo tồn các loài này là rất cần thiết.

2.1. Biến Đổi Khí Hậu Và Ảnh Hưởng Đến Đa Dạng Sinh Học

Biến đổi khí hậu đang làm thay đổi môi trường sống của nhiều loài bọ cánh cứng. Nhiệt độ tăng cao và sự thay đổi lượng mưa có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của chúng. Điều này cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để đưa ra các biện pháp ứng phó.

2.2. Sự Xâm Lấn Của Loài Ngoại Lai

Sự xâm lấn của các loài ngoại lai có thể gây ra sự cạnh tranh gay gắt với các loài bản địa. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến sự đa dạng của họ bọ cánh cứng mà còn làm thay đổi cấu trúc của hệ sinh thái. Cần có các nghiên cứu để đánh giá tác động của vấn đề này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đa Dạng Họ Bọ Cánh Cứng

Nghiên cứu đa dạng họ bọ cánh cứng tại Vườn Quốc Gia Núi Chúa được thực hiện bằng nhiều phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các phương pháp này giúp xác định chính xác các loài và mối quan hệ của chúng với thực vật. Việc áp dụng công nghệ mới trong nghiên cứu sẽ mang lại kết quả chính xác hơn.

3.1. Sử Dụng Công Nghệ Sinh Học Phân Tử

Công nghệ sinh học phân tử cho phép xác định các loài bọ cánh cứng thông qua phân tích ADN. Phương pháp này giúp phát hiện các loài mới và đánh giá sự đa dạng sinh học một cách hiệu quả.

3.2. Phân Tích Mối Quan Hệ Giữa Bọ Cánh Cứng Và Thực Vật

Nghiên cứu mối quan hệ giữa bọ cánh cứng và thực vật chủ của chúng là rất quan trọng. Phân tích này giúp hiểu rõ hơn về cách thức tương tác giữa các loài trong hệ sinh thái và ảnh hưởng của chúng đến sự phát triển của thực vật.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đa Dạng Họ Bọ Cánh Cứng Tại VQG Núi Chúa

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của họ bọ cánh cứng tại Vườn Quốc Gia Núi Chúa rất phong phú. Nhiều loài mới đã được phát hiện và ghi nhận. Những phát hiện này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa trong việc bảo tồn đa dạng sinh học.

4.1. Đánh Giá Đa Dạng Loài Chrysomelidae

Kết quả cho thấy có nhiều loài Chrysomelidae mới được phát hiện tại VQG Núi Chúa. Điều này cho thấy sự phong phú của hệ sinh thái nơi đây và cần có các biện pháp bảo tồn phù hợp.

4.2. Mối Quan Hệ Giữa Chrysomelidae Và Thực Vật

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng mối quan hệ giữa Chrysomelidae và thực vật chủ rất chặt chẽ. Sự thay đổi trong thành phần thực vật có thể ảnh hưởng đến sự phân bố và đa dạng của các loài bọ cánh cứng.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Đa Dạng Họ Bọ Cánh Cứng

Nghiên cứu đa dạng họ bọ cánh cứng ăn lá tại Vườn Quốc Gia Núi Chúa đã cung cấp nhiều thông tin quý giá về sự phong phú của hệ sinh thái. Những kết quả này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn góp phần vào công tác bảo tồn đa dạng sinh học tại khu vực này.

5.1. Ý Nghĩa Của Nghiên Cứu Đối Với Bảo Tồn

Kết quả nghiên cứu giúp nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của việc bảo tồn đa dạng sinh học. Việc bảo tồn các loài bọ cánh cứng không chỉ bảo vệ hệ sinh thái mà còn bảo vệ các loài thực vật mà chúng phụ thuộc.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc đánh giá tác động của biến đổi khí hậu và sự xâm lấn của loài ngoại lai đến sự đa dạng của họ bọ cánh cứng. Các nghiên cứu này sẽ giúp đưa ra các biện pháp bảo tồn hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Nguyễn Thị Định, chuyên ngành Sinh thái học (mã số: 9 42 01 20), thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Jesús Gómez-Zurita và PGS. Nguyễn Văn Sinh, tập trung vào đề tài: "Nghiên cứu đa dạng của họ Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của Vườn quốc gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử".

Tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nguyên lý sinh thái học: các quần xã sinh vật không tồn tại độc lập mà là những mảnh ghép phụ thuộc lẫn nhau trong môi trường tự nhiên. Cấu trúc của quần xã thực vật biến đổi theo các nhân tố vật lý (nhiệt độ, độ ẩm, bức xạ mặt trời) dọc theo độ cao địa hình. Vì thực vật là nguồn thức ăn và nơi cư trú trực tiếp của côn trùng ăn lá, sự biến đổi của thảm thực vật sẽ chi phối sự đa dạng và phân bố của côn trùng. Trong bộ Cánh cứng (Coleoptera), họ Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) có số lượng loài lớn, gắn bó mật thiết với thực vật trong suốt vòng đời và dễ thu thập mẫu vật, là nhóm chỉ thị phù hợp để đánh giá sự phụ thuộc của quần xã sinh vật. Vườn Quốc gia (VQG) Núi Chúa sở hữu hệ sinh thái rừng bán khô hạn đặc thù với sự phân hóa thảm thực vật rõ rệt từ rừng khô đất thấp lên rừng ẩm núi cao, tạo điều kiện thuận lợi để kiểm tra các quy luật sinh thái này. Khoảng trống nghiên cứu được xác định là: tại Việt Nam, các công trình trước đây về Chrysomelidae chủ yếu dừng lại ở phân loại hình thái truyền thống và khảo sát sơ bộ thành phần loài, thiếu hụt các dữ liệu sinh thái học định lượng dọc theo gradient môi trường và chưa từng ứng dụng công cụ sinh học phân tử để phân định loài cũng như xác định thức ăn trong ruột của chúng.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm:

1. Đánh giá sự đa dạng loài và sự biến động theo không gian của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa.
2. Xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae và đánh giá sự thay đổi thức ăn của chúng theo không gian.

Nội dung nghiên cứu cụ thể:

1. Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để đánh giá sự đa dạng loài của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa.
2. Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa.
3. Xác định sự biến đổi thành phần của họ Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo không gian ở VQG Núi Chúa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các loài bọ cánh cứng thuộc họ Chrysomelidae (bộ Coleoptera) và thức ăn (thực vật chủ) trong ruột của chúng.
• Phạm vi không gian: Khu vực diện tích khoảng 10 km² thuộc VQG Núi Chúa, nằm trên địa bàn 2 huyện Ninh Hải và Thuận Bắc, tỉnh Ninh Thuận; trải dài từ rừng khô trên đất thấp sát mực nước biển lên đến rừng ẩm ở độ cao trên 300 m (điểm cao nhất trong khảo sát đạt 714 m).
• Phạm vi thời gian: Khảo sát sơ bộ thực hiện vào tháng 5/2012; các đợt thu mẫu định kỳ chính thức diễn ra trong các tháng 6, 7, 9/2012 và từ tháng 1 đến tháng 4/2013.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các cơ sở lý luận và thực tiễn từ các nghiên cứu trong nước và quốc tế theo bốn nhóm vấn đề chính:

Thứ nhất, về đánh giá đa dạng sinh học và ứng dụng công cụ sinh học phân tử, tác giả dựa trên khung khái niệm đa dạng alpha, beta, gamma của Whittaker (1972) và các ước tính đa dạng sinh học toàn cầu của Mora và cộng sự (2011), Chapman (2009), Magurran (2013). Trước thực trạng khủng hoảng đa dạng sinh học và "trở ngại phân loại" (taxonomic impediment) được New (1984) chỉ ra, phương pháp mã vạch ADN ty thể qua gen cytochrome c oxidase subunit I (COI/cox1) do Hebert và cộng sự (2003, 2004, 2010) đề xuất đã trở thành công cụ hỗ trợ phân loại học động vật. Bên cạnh đó, các mã vạch lục lạp ở thực vật như rbcLa, matK, trnH-psbA và vùng nhân nrITS (CBOL Plant Working Group 2009; Hollingsworth và cộng sự 2011; Li và cộng sự 2011) cho phép nhận dạng thực vật chính xác. Trong nghiên cứu sinh thái dinh dưỡng, phương pháp giải trình tự ADN thực vật trong ruột côn trùng (Jurado-Rivera và cộng sự 2009; Navarro và cộng sự 2010; García-Robledo và cộng sự 2013; Kishimoto-Yamada và cộng sự 2013) đã khắc phục các hạn chế của việc quan sát trực tiếp ngoài thực địa hay thử nghiệm cho ăn trong phòng thí nghiệm (Barone 1998; Otte và Joern 1976).

Thứ hai, về tác động của sự không đồng nhất môi trường dọc theo đai cao, các tác giả Haller và cộng sự (2013), Pausas và Austin (2001), Jill và cộng sự (2009), Yang và cộng sự (2015), Arnan và cộng sự (2006), Fahrig (2003) đã chỉ ra mối quan hệ giữa biến đổi khí hậu - sinh cảnh và sự thay đổi thành phần quần xã. Nhiều nghiên cứu về côn trùng theo độ cao tại Trung và Nam Mỹ (Brehm & Fiedler 2004; Novotny và cộng sự 2005; Escobar và cộng sự 2006; Sánchez-Reyes và cộng sự 2016; Bouzan và cộng sự 2015) ghi nhận sự thay đổi đa dạng loài theo gradient nhiệt ẩm.

Thứ ba, về nghiên cứu họ Chrysomelidae trên thế giới và tại Việt Nam: Trên thế giới, họ Chrysomelidae có hơn 37.000 loài đã được mô tả thuộc hơn 2.000 giống (Jolivet, Petitpierre và Hsiao 1988; Bouchard và cộng sự 2011; Jolivet và Hawkeswood 1995). Các nghiên cứu phân tử hiện đại đã giải quyết phát sinh loài và tương tác dinh dưỡng (Nadein 2015; Matsumura và cộng sự 2014; Montelongo và Gómez-Zurita 2014; Thormann và cộng sự 2016; Papadopoulou, Cardoso và Gómez-Zurita 2013; De la Cadena và cộng sự 2014). Tại Việt Nam, các công trình của Đặng Thị Đáp và Medvedev (1982, 1983, 1989), Trần Thiếu Dư và cộng sự (2005, 2006, 2007, 2008), Medvedev (1985–2015), Delobel và cộng sự (2011) đã ghi nhận khoảng 700 loài và ước tính có thể vượt 1.000 loài. Medvedev và Đặng Thị Đáp (1982, 1983) từng thống kê thực vật chủ của 212 loài dựa trên quan sát mắt thường. Tại VQG Núi Chúa, nghiên cứu côn trùng của Tạ Huy Thịnh và cộng sự (2005) mới chỉ thống kê sơ bộ một số họ côn trùng mà chưa khảo sát họ Chrysomelidae.

Khoảng trống luận án giải quyết: Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam kết hợp đồng thời phương pháp phân loại hình thái với kỹ thuật mã vạch ADN (gen cox1) và phân tích ADN thức ăn trong ống tiêu hóa (vùng psbA-trnH) để đánh giá cấu trúc quần xã bọ cánh cứng ăn lá, giải mã mạng lưới tương tác dinh dưỡng với thực vật chủ dọc theo dải biến đổi môi trường nhiệt - ẩm theo độ cao dưới 1.000 m tại một hệ sinh thái rừng khô hạn nhiệt đới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án vận dụng các lý thuyết sinh thái học quần xã và phát sinh loài phân tử:

• Khái niệm phân rã đa dạng beta: Đa dạng beta tổng ($\beta_{total}$) được tách thành thành phần thay thế loài ($\beta_{sim}$ hay $\beta_{repl}$) và thành phần làm giàu/nghèo loài hay lồng ghép/tạo ổ ($\beta_{sne}$ hay $\beta_{rich}$) theo khung phân tích của Baselga (2010), Carvalho (2012), Podani và Schmera (2011).
• Khung phân tích đa dạng beta của tương tác mạng lưới sinh thái theo Poisot và cộng sự (2012): Sự không giống nhau của các tương tác ($\beta_{WN}$) được phân rã thành sự khác biệt do tương tác giữa các loài chia sẻ ($\beta_{OS}$) và sự khác biệt do thành phần loài thay thế ($\beta_{ST}$).
• Khái niệm hiệu ứng giữa vùng phân bố (Mid-domain effect) của Colwell và Lees (2000) và phương pháp phân định vùng chuyển tiếp bằng kỹ thuật cửa sổ trượt (sliding window) của Barton và cộng sự (2013).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và phân tích dữ liệu:

• Thu thập mẫu vật: Sử dụng phương pháp đập (beating method) thảm cỏ, cây bụi và cành cây thấp đến độ cao tối đa 2,5 m trong thời lượng chuẩn hóa 10 phút tại mỗi điểm cố định. Mẫu bọ cánh cứng được bảo quản ngay trong cồn ethanol tuyệt đối 96% để phục vụ phân tích di truyền. Tổng cộng khảo sát 5 tuyến đường rừng cố định: Mái Nhà (15 điểm, 38–364 m), Đá Đỏ (11 điểm, 111–243 m), Ao Hồ (10 điểm, 50–265 m), Núi Ông (14 điểm, 122–486 m), Suối Trục (10 điểm, 101–405 m) và tuyến Đá Hang (5 điểm, 109–714 m). Các tuyến cố định được thu mẫu 10 lần qua 2 chu kỳ mùa (mùa khô và mùa mưa).
• Phân loại hình thái: Quan sát dưới kính lúp soi nổi, phân chia phân họ theo Paul (2009), định loại đến mức phân loại thấp nhất bằng khóa phân loại của Kimoto (1981, 1982, 1989, 2000). Giải phẫu cơ quan sinh dục đối với các dạng hình thái đa hình màu sắc.
• Kỹ thuật sinh học phân tử:
  • Tách chiết ADN: Toàn bộ phần mềm cơ thể được xử lý bằng bộ kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen Iberia). Bộ vỏ cứng còn lại được bảo quản khô làm tiêu bản đối chứng.
  • Phân tích gen cox1 ty thể: Khuếch đại đoạn gen dài 830 bp bằng cặp mồi TL-N-3014 (Simon và cộng sự 1994) và C1-J-2183 cải biên (Gómez-Zurita và cộng sự 2012). Chu trình nhiệt PCR: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 50°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 1 phút. Giải trình tự hai chiều bằng bộ kit BigDye Terminator v3.1 trên hệ thống máy đọc tự động ABI. Dữ liệu trình tự được lắp ráp, căn chỉnh trên Geneious Pro 5.6 và đăng ký trên cơ sở dữ liệu EMBL-EBI (mã số LT160095–LT160588).
  • Phân tích vùng psbA-trnH lục lạp: Khuếch đại thức ăn trong ruột bằng cặp mồi PsbA/TrnH và cặp mồi nội bộ PsbAinT2/TrnHinT1. Dữ liệu trình tự được đối soát phân loại thông qua công cụ BAGpipe (Papadopoulou và cộng sự 2015) kết nối dữ liệu GenBank để xác định họ thực vật chủ.
• Phương pháp phân định loài phân tử:
  • Lựa chọn mô hình tiến hóa tốt nhất qua jModelTest 2.5 (mô hình GTR + I + G).
  • Dựng cây Maximum Likelihood (ML) bằng RAxML 7.0.4 (100 cây ngẫu nhiên khởi đầu, 500 bản sao bootstrap); chuyển đổi thành cây ultrametric qua PATHd8 và r8s 1.71.
  • Suy luận Bayesian (BI) bằng BEAST 1.8.2 (4 chuỗi MCMC, 50 triệu thế hệ, lấy mẫu mỗi 5.000 thế hệ, burn-in 10% qua TreeAnnotator 1.8.2, kiểm tra hội tụ bằng Tracer v1.6).
  • Phân định ranh giới loài phân tử bằng mô hình GMYC (Generalized Mixed Yule-Coalescent, đơn và đa ngưỡng qua gói splits trong môi trường R 3.1.2) và mô hình bPTP (Poisson Tree Processes trên bPTP server).
• Phân tích thống kê sinh thái học:
  • Dự đoán độ giàu loài tiềm năng: Xây dựng đường cong tích lũy loài qua phần mềm EstimateS 9.1 (Colwell 2013).
  • So sánh thành phần quần xã: Tính chỉ số Jaccard, Sørensen và phân tích thành phần $\beta_{sim}$, $\beta_{sne}$ bằng gói betapart (Baselga và Orme 2012) và BAT 1.1 (Cardoso và cộng sự 2014) trong R.
  • Phân tích sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA - Canonical Correspondence Analysis): Thực hiện qua gói vegan 2.0-7 với ma trận tương tác thực vật chủ và 4 biến số giải thích (Sinh cảnh: <300 m và >300 m; Loài ADN; Tuyến thu mẫu; Thời gian thu mẫu).
  • Phân tích mạng lưới tương tác nhị phần (Bipartite network): Sử dụng gói Bipartite 2.05 (Dormann và cộng sự 2008) với các hàm visweb, plotweb, networklevel để đánh giá cấu trúc mô-đun và mức độ chuyên hóa tương tác dinh dưỡng.

Nguồn tư liệu và dữ liệu nghiên cứu: Tập hợp 520 mẫu vật bọ cánh cứng ăn lá thu thập thực địa tại 6 tuyến ở VQG Núi Chúa, bộ cơ sở dữ liệu trình tự nucleotide gen cox1 và vùng gen lục lạp psbA-trnH, kết hợp các nguồn dữ liệu đối sánh quốc tế từ GenBank và tài liệu khí tượng - sinh cảnh thảm thực vật VQG Núi Chúa của Phân Viện Điều Tra Quy Hoạch Rừng II và Đoàn Dương (2004).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp có hệ thống các cơ sở khoa học về việc sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nghiên cứu sinh thái học và đánh giá đa dạng sinh học. Tác giả phân tích rõ ba cấp độ đa dạng sinh học, vai trò của gen mã vạch chuẩn cox1 trong phân định loài động vật và các vùng gen lục lạp (rbcLa, matK, psbA-trnH) trong định danh thực vật. Chương này phân tích chi tiết cơ chế tác động của sự không đồng nhất môi trường theo không gian và độ cao đến sự phân bố của sinh vật; khẳng định họ Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) là nhóm sinh vật chỉ thị thích hợp nhờ sự đa dạng loài cao, tính chuyên hóa dinh dưỡng đa dạng và mối liên kết chặt chẽ với thảm thực vật. Tác giả cũng tổng thuật toàn diện lịch sử nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới và tại Việt Nam, nêu bật đóng góp phân loại của các tác giả Medvedev, Đặng Thị Đáp, Trần Thiếu Dư. Cuối chương là phần khái quát điều kiện tự nhiên, địa hình lòng chảo ven biển, đặc điểm khí hậu khô hạn đặc trưng (lượng mưa trung bình năm dưới 700 mm, có 9 tháng khô, 4 tháng hạn, 2 tháng kiệt, chỉ số khô hạn X = 9) và 6 kiểu thảm thực vật chính của VQG Núi Chúa.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, hệ thống hóa tọa độ địa lý của 55 điểm thu mẫu thuộc 6 tuyến điều tra tại VQG Núi Chúa:

Tuyến thu mẫu	Ký hiệu	Số điểm thu mẫu	Dải độ cao (m)	Số đợt thu mẫu
Đá Hang	DH	5	109 – 714	1 (tháng 5/2012)
Ao Hồ	AH	10	50 – 265	10
Đá Đỏ	DD	11	111 – 243	10
Mái Nhà	MN	15	38 – 364	10
Núi Ông	NO	14	122 – 486	10
Suối Trục	ST	10	101 – 405	10

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ quy trình tách chiết ADN, phản ứng PCR nhân bản gen cox1 và psbA-trnH, làm sạch sản phẩm PCR bằng ammonium acetate và isopropanol lạnh, điện di gel agarose 1,5%, giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3.1. Chương 2 thiết lập các thuật toán tin sinh học: phương pháp cửa sổ trượt phân định ranh giới sinh cảnh; mô hình tiến hóa GTR + I + G trong jModelTest 2.5; dựng cây phát sinh loài ML bằng RAxML 7.0.4; làm phẳng tỷ lệ bằng PATHd8 và r8s 1.71; phân tích Bayes bằng BEAST 1.8.2; phân định loài qua GMYC (gói splits) và bPTP server; xác định họ thực vật chủ qua BAGpipe; ước tính độ giàu loài bằng EstimateS 9.1; phân tích đa dạng beta bằng betapart và BAT 1.1; phân tích CCA bằng vegan 2.0-7; phân tích mạng lưới dinh dưỡng bằng betalink 2.0 và Bipartite 2.05 trên R 3.1.2.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ phát hiện thực nghiệm của luận án:

1. Phân định vùng chuyển tiếp sinh thái: Dựa trên mô hình nhiệt độ giảm theo độ cao và chỉ số tương đồng Sørensen-Dice qua phương pháp cửa sổ trượt (khoảng trượt 40 m), tác giả xác định đoạn độ cao từ 160 m đến 320 m là vùng chuyển tiếp sinh thái giữa rừng khô đất thấp và rừng ẩm trên núi cao, trong đó mốc 300 m là ranh giới phân định rõ rệt nhất giữa hai sinh cảnh.
2. Đa dạng phân loại hình thái và phân tử: Từ 520 cá thể thu thập được, phân loại hình thái sơ bộ ghi nhận 141 dạng loài hình thái thuộc nhiều phân họ (Alticinae, Bruchinae, Chlamisinae, Chrysomelinae, Clytrinae, Criocerinae, Cryptocephalinae, Eumolpinae, Galerucinae...). Luận án ghi nhận 13 loài mới cho khoa học (11 loài thuộc giống Monolepta và 2 loài thuộc giống Paleosepharia). Về mặt di truyền, phân tích trình tự gen cox1 bằng mô hình bPTP đạt sự tương thích cao nhất với dữ liệu hình thái, phân định được 155 loài bPTP từ 520 cá thể.
3. Thực vật chủ của phân họ Galerucinae: Phân tích vùng psbA-trnH qua BAGpipe đã xác định thành công phổ thực vật chủ ở cấp họ của các loài thuộc phân họ Galerucinae, chỉ ra tính chuyên hóa thức ăn và mối liên kết dinh dưỡng của từng loài bọ cánh cứng với các nhóm thực vật đặc trưng trong từng sinh cảnh.
4. Biến động quần xã và tương tác theo độ cao và sinh cảnh:
   • Đa dạng alpha thay đổi theo độ cao và tuyến thu mẫu.
   • Phân tích đa dạng beta cho thấy sự khác biệt thành phần loài giữa các tuyến và giữa 2 sinh cảnh khô (<300 m) và ẩm (>300 m) chủ yếu do quá trình thay thế loài ($\beta_{sim}$ / $\beta_{repl}$) chi phối, trong khi thành phần lồng ghép/tạo ổ ($\beta_{sne}$ / $\beta_{rich}$) chiếm tỷ lệ rất nhỏ.
   • Kết quả phân tích CCA khẳng định biến số sinh cảnh (<300 m và >300 m) và yếu tố loài ADN là các nhân tố có ý nghĩa thống kê chi phối mạnh mẽ cấu trúc tương tác giữa bọ cánh cứng và thực vật chủ.
   • Mạng lưới tương tác Galerucinae - thực vật chủ thể hiện sự tái cấu trúc rõ nét khi chuyển từ sinh cảnh khô lên sinh cảnh ẩm, với sự thay đổi của các chỉ số mô-đun và mức độ liên kết giữa các bậc dinh dưỡng.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn được luận án tổng hợp bao gồm:

Về mặt lý luận và khoa học:

• Là công trình đầu tiên nghiên cứu toàn diện và có hệ thống về quần xã bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) tại VQG Núi Chúa, kết hợp đồng bộ giữa phân loại hình thái và công cụ sinh học phân tử (mã vạch ADN gen cox1).
• Đã khám phá và định danh 13 loài mới cho khoa học thuộc hai giống Monolepta và Paleosepharia (phân họ Galerucinae).
• Ứng dụng thành công phương pháp phân tích ADN lục lạp (psbA-trnH) từ chất chứa trong ống tiêu hóa để xác định chính xác thực vật chủ của bọ cánh cứng ăn lá, khắc phục các sai số của phương pháp quan sát ngoài thực địa.
• Chứng minh bằng thực nghiệm rằng sự thay đổi thành phần quần xã Chrysomelidae dọc theo gradient độ cao tại VQG Núi Chúa bị chi phối chủ yếu bởi sự thay thế loài ($\beta_{repl}$) thay vì sự mất đi/tăng thêm loài ($\beta_{rich}$), đồng thời xác định ranh giới chuyển tiếp sinh thái nhiệt độ - sinh cảnh ở mốc độ cao 300 m (dải 160–320 m).

Về mặt thực tiễn và quản lý bảo tồn:

• Cung cấp dẫn liệu khoa học về cấu trúc đa dạng sinh học và các tương tác sinh thái trong hệ sinh thái rừng khô hạn nhiệt đới.
• Cảnh báo nguy cơ suy giảm đa dạng sinh học do mất môi trường sống. Kết quả chỉ ra rằng quần xã bọ cánh cứng ăn lá ở rừng khô đất thấp mang tính đặc thù cao và dễ bị tổn thương nếu sinh cảnh khô hạn bị tác động; do đó, hoạt động bảo tồn tại VQG Núi Chúa cần chú trọng bảo vệ toàn vẹn cả dải sinh cảnh từ rừng khô ven biển đất thấp lên đến rừng ẩm trên núi cao.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi không gian của luận án giới hạn trong diện tích khoảng 10 km² tại khu vực phía Nam của VQG Núi Chúa; độ cao thu mẫu định kỳ mới đạt mức 449 m (khảo sát sơ bộ đạt 714 m), chưa bao phủ toàn bộ đỉnh cao nhất của khối núi (đỉnh Núi Cô Tuy 1.040 m).
• Nhận dạng phân loại hình thái của một số nhóm mẫu vật mới dừng lại ở cấp giống hoặc phân họ do sự thiếu hụt mẫu chuẩn và tính phức tạp của phân loại học Chrysomelidae.
• Dữ liệu thực vật chủ qua vùng gen lục lạp psbA-trnH mới tập trung phân tích chuyên sâu cho phân họ Galerucinae và phần lớn định danh ở cấp họ thực vật do hạn chế về độ bao phủ của ngân hàng dữ liệu gen tham chiếu GenBank đối với hệ thực vật địa phương.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng phạm vi thu mẫu lên toàn bộ diện tích VQG Núi Chúa và các đai độ cao trên 500 m đến 1.040 m.
• Tiếp tục giải trình tự và phân tích thức ăn trong ruột cho các phân họ còn lại của Chrysomelidae (Eumolpinae, Alticinae, Cryptocephalinae...).
• Xây dựng thư viện mã vạch ADN hoàn chỉnh cho hệ thực vật VQG Núi Chúa nhằm nâng cao độ phân giải định danh thực vật chủ từ cấp họ xuống cấp chi và cấp loài.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và ứng dụng đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Sinh thái học, Côn trùng học, Sinh học tiến hóa và Đa dạng sinh học: Tham khảo khung phương pháp luận kết hợp mã vạch ADN với phân tích mạng lưới tương tác sinh thái, quy trình giải trình tự gen cox1 và psbA-trnH, cùng việc sử dụng các gói lệnh phân tích thống kê chuyên sâu trên ngôn ngữ R (splits, betapart, BAT, vegan, betalink, Bipartite).
• Các nhà phân loại học Côn trùng: Tham khảo danh mục 141 dạng loài hình thái, 155 loài phân tử bPTP và thông tin chẩn loại của 13 loài mới thuộc phân họ Galerucinae.
• Ban quản lý VQG Núi Chúa và các cơ quan quản lý bảo tồn thiên nhiên: Sử dụng dữ liệu phân vùng chuyển tiếp sinh thái (mốc 300 m) và danh mục bọ cánh cứng chỉ thị để xây dựng phương án quy hoạch bảo tồn đa dạng sinh học rừng khô hạn.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã xác định được bao nhiêu dạng loài hình thái và bao nhiêu loài phân tử bọ cánh cứng ăn lá tại VQG Núi Chúa?
Từ 520 cá thể bọ cánh cứng thu thập được, phân loại hình thái ghi nhận 141 dạng loài hình thái (trong đó có 13 loài mới cho khoa học gồm 11 loài giống Monolepta và 2 loài giống Paleosepharia). Phân tích trình tự ADN gen ty thể cox1 thông qua mô hình bPTP phân định được 155 loài phân tử.

2. Phương pháp nào được sử dụng để xác định thức ăn trong ruột của bọ cánh cứng và kết quả đạt được ở cấp độ phân loại nào?
Tác giả tách chiết ADN từ phần mềm cơ thể bọ cánh cứng, khuếch đại vùng gen lục lạp psbA-trnH bằng PCR (sử dụng cặp mồi dài PsbA/TrnH và cặp mồi ngắn PsbAinT2/TrnHinT1), giải trình tự chu kỳ và chạy chương trình BAGpipe để đối soát phân loại tự động với cơ sở dữ liệu GenBank. Kết quả xác định được thức ăn của phân họ Galerucinae ở cấp họ thực vật.

3. Ranh giới vùng chuyển tiếp sinh thái tại VQG Núi Chúa được xác định ở độ cao nào và bằng kỹ thuật gì?
Dựa trên phân tích phân bố nhiệt độ và chỉ số tương đồng loài Sørensen-Dice qua kỹ thuật cửa sổ trượt (sliding window) với các khoảng độ cao 40 m liền kề, tác giả xác định dải chuyển tiếp sinh thái nằm trong khoảng độ cao 160–320 m, trong đó mốc 300 m là ranh giới sinh thái phân định rõ rệt nhất giữa sinh cảnh khô đất thấp và sinh cảnh ẩm trên núi cao.

4. Yếu tố nào đóng vai trò chính tạo nên sự khác biệt đa dạng beta của quần xã Chrysomelidae giữa các sinh cảnh?
Phân tích đa dạng beta bằng gói betapart và BAT cho thấy sự không giống nhau trong thành phần loài giữa sinh cảnh khô và ẩm chủ yếu do thành phần các loài thay thế ($\beta_{sim}$ / $\beta_{repl}$) quyết định, trong khi thành phần các loài tạo ổ/lồng ghép ($\beta_{sne}$ / $\beta_{rich}$) đóng góp tỷ lệ rất nhỏ.

5. Kết quả phân tích sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA) chỉ ra những nhân tố nào tác động đến mối tương tác giữa bọ cánh cứng và thực vật chủ?
Phép phân tích CCA với ma trận tương tác và 4 biến số giải thích (Sinh cảnh, Loài ADN, Tuyến thu mẫu, Thời gian) đã chứng minh rằng biến số Sinh cảnh (<300 m và >300 m) và biến số Loài phân tử là hai nhân tố có ảnh hưởng quyết định và có ý nghĩa thống kê đến cấu trúc liên kết giữa bọ cánh cứng ăn lá và thực vật chủ.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Định đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu đánh giá đa dạng họ Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ dinh dưỡng của chúng với thực vật chủ tại VQG Núi Chúa. Bằng việc tích hợp thành công phương pháp phân loại hình thái truyền thống với công cụ mã vạch ADN ty thể (cox1) và lục lạp (psbA-trnH), công trình đã phân định được 141 dạng loài hình thái (trong đó phát hiện 13 loài mới cho khoa học), 155 loài phân tử và xác định phổ thực vật chủ của phân họ Galerucinae. Các phân tích sinh thái định lượng đã làm rõ ranh giới chuyển tiếp sinh thái ở mốc độ cao 300 m, chứng minh sự thay thế loài chi phối cấu trúc đa dạng beta theo đai cao và phân tích mạng lưới tương tác dinh dưỡng giữa hai sinh cảnh khô - ẩm. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy cho công tác nghiên cứu sinh thái học côn trùng và đề xuất các giải pháp bảo tồn đa dạng sinh học hệ sinh thái rừng khô hạn nhiệt đới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Các vấn đề liên quan đến luận án 1. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học 1. Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan Định nghĩa đa dạng sinh học: Theo Luật Đa dạng sinh học (2008) thì “Đa dạng sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong tự nhiên”.

Ba cấp độ này làm việc cùng nhau để tạo ra sự phức tạp của sự sống trên Trái đất [1]. Sự đa dạng di truyền ở cấp độ cơ bản nhất của nó được thể hiện bởi sự khác biệt trong trình tự của các nucleotide (adenine: A, cytosine: C, guanine: G, thymine: T…) hình thành nên ADN trong các tế bào của sinh vật. ADN được chứa trong các nhiễm sắc thể có mặt trong tế bào; một số nhiễm sắc thể được chứa trong các bào quan của tế bào (ví dụ, các nhiễm sắc thể của ty thể và lục lạp). Mỗi một gen là một đoạn của ADN nằm trên nhiễm sắc thể và quy định một đặc tính cụ thể của một sinh vật.

Whittaker (1972) đưa ra 3 khái niệm đa dạng trong sinh thái học: đa dạng alpha, đa dạng bê ta và đa dạng gamma. Đa dạng alpha đánh giá đa dạng cho tập hợp mẫu từ một quần xã nhất định. Đa dạng beta đánh giá sự thay thế loài hay sự thay đổi thành phần sinh vật khi chuyển từ quần xã này sang quần xã khác. Đa dạng gamma đánh giá sự phong phú loài của một loạt sinh cảnh (một cảnh quan, một khu vực địa lý hoặc một hòn đảo), nó là hệ quả của đa dạng alpha của các quần xã thành phần và của đa dạng beta giữa chúng [2].

Mora et al. (2011) dự đoán có khoảng 8,7 triệu (± 1,3 triệu) loài có nhân trên toàn cầu; trong đó có khoảng 2,2 triệu (± 0,18 triệu) là sống dưới biển. Họ cho rằng khoảng 86% các loài đang tồn tại trên trái đất và 91% các loài trong đại dương vẫn đang chờ đợi mô tả [3]. Đến nay, tổng số loài mô tả được chấp nhận trên thế giới được ước tính là gần 1.000 loài và có khoảng 18.000 loài mới được miêu tả mỗi năm (năm 2007) (Chapman 2009) [4].

Nhiều loài đã tuyệt chủng trong lịch sử địa chất của trái đất. Lý do chính cho những sự tuyệt chủng là sự thay đổi môi trường hoặc sự cạnh tranh sinh học. Tỷ lệ tuyệt chủng gây ra bởi con người lớn hơn tỷ lệ tuyệt chủng tự nhiên của chúng khoảng từ 1. Hiện nay, sự tác động của con người 4 gây ra sự tuyệt chủng của các loài sinh vật trên trái đất là một trong những vấn đề môi trường lớn nhất đối với nhân loại (Pidwirny, 2015) [5].

Đánh giá đa dạng sinh học: Trong ba cấp độ đa dạng sinh học, cấp độ đa dạng loài gần như được áp dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh thái và bảo tồn sinh học, mặc dù các mức độ đa dạng của bậc phân loại cao hơn (chi, họ, bộ) hoặc mô hình đa dạng tiến hóa đôi khi cũng được coi là đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu cổ sinh vật học (Foote 1997; Roy et al. 1996; Raup và Sepkoski 1984) [6, 7, 8]. Do đó, các nhà sinh vật học thường đánh giá đa dạng sinh học thông qua đánh giá độ giàu loài. Có hai phương pháp chính để đánh giá độ giàu loài: (1) phương pháp đánh giá mang tính định tính bao gồm đa dạng loài alpha là tổng số loài trong một quần xã có trong một hệ sinh thái cụ thể.

Tính đa dạng beta mô tả mức độ dao động thành phần loài khi các yếu tố môi trường thay đổi.