Luận văn thạc sĩ về đa dạng di truyền của loài Asarum splenders tại Việt Nam

• Tác giả: Lê Đình Kỳ
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Thị Thu Huệ
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Danh Và Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Của Loài Tế Tân Thanh Thành (Asarum Splenders) Thu Thập Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ CHI TẾ TÂN (ASARUM L.)
• 1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT CHẤT SINH HỌC TRONG CHI TẾ TÂN
• 1.3. CÔNG DỤNG THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI TẾ TÂN
• 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU CÁC LOÀI TẾ TÂN Ở VIỆT NAM
• 2. CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA BARCODING TRONG THỰC VẬT
• 2.1. KHÁI NIỆM VỀ DNA BARCODING
• 2.2. MỘT SỐ CHỈ THỊ DNA BARCODING THƯỜNG SỬ DỤNG TRONG PHÂN LOẠI
• 2.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU DNA BARCODING TRONG CHI TẾ TÂN NÓI CHUNG
• 3. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 3.1.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.2.1. MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
• 3.2.2. TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ LÁ
• 3.2.3. PCR KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỈ THỊ DNA BARCODING
• 3.2.4. TINH SẠCH CÁC ĐOẠN DNA
• 3.2.5. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CÁC CHỈ THỊ DNA
• 3.2.6. PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG CỦA MẪU NGHIÊN CỨU DỰA TRÊN CHỈ THỊ DNA BẰNG CÔNG CỤ TIN SINH
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÁC MẪU NGHIÊN CỨU
• 4.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ DNA BARCODING CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU
• 4.2.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ CÁC MẪU TẾ TÂN
• 4.2.2. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI CÁC ĐOẠN CHỈ THỊ DNA BẰNG PCR
• 4.2.3. KẾT QUẢ TINH SẠCH CÁC SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI CÁC ĐOẠN CHỈ THỊ DNA
• 4.2.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC ĐOẠN DNA BARCODING
• 4.2.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC MẪU NGHIÊN CỨU DỰA TRÊN DNA BARCODING
• 4.3. SO SÁNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ CÁC CHỈ THỊ DNA
• 4.4. XÂY DỰNG CÂY PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CÁC CHỈ THỊ DNA
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH TRÌNH TỰ THAM CHIẾU TỪ CƠ SỞ DỮ LIỆU GENBANK
• TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CÁC ĐOẠN CHỈ THỊ ĐÃ GIẢI MÃ
• HÌNH ẢNH KHẢO SÁT TẾ TÂN TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG

I. Tổng quan về chi Tế tân Asarum

Chi Tế tân (Asarum) thuộc họ Nam mộc hương (Aristolochiaceae) với khoảng 128 loài, phát triển chủ yếu ở các vùng ôn đới Bắc bán cầu. Tại Việt Nam, có 10 loài được ghi nhận, trong đó có nhiều loài quý hiếm như A. balansae và A. caudigerum. Các loài này thường mọc ở những khu vực ẩm ướt, có bóng râm và đất giàu mùn. Đặc điểm sinh thái của chi Tế tân cho thấy chúng ưa thích môi trường sống có độ cao từ 700 m trở lên so với mực nước biển. Việc khai thác quá mức để làm thuốc đã dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng của các loài này trong tự nhiên. Theo các nghiên cứu, ba loài trong chi Tế tân đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam, cho thấy sự cần thiết phải bảo tồn và nghiên cứu thêm về đa dạng di truyền của chúng.

1.1 Đặc điểm sinh thái và hình thái

Các loài Tế tân thường có thân cỏ, cao từ 10 cm đến 30 cm, mọc thành đám nhỏ ở những nơi đất mùn. Chúng phát triển tốt trong các khu rừng đặc dụng nhưng cũng bị đe dọa do khai thác quá mức. Đặc điểm hình thái của Tế tân bao gồm lá hình tim, cuống lá dài và thân rễ bò ngang. Loài Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens) có tốc độ phát triển chậm, mỗi năm chỉ ra một lá, và hoa xuất hiện vào mùa xuân. Việc nghiên cứu các đặc điểm này không chỉ giúp nhận diện loài mà còn hỗ trợ trong việc bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.

II. Nghiên cứu di truyền và ứng dụng

Nghiên cứu về đa dạng di truyền của Asarum splendens tại Việt Nam sử dụng các chỉ thị DNA barcoding như ITS1, ITS2, matK và rpoC. Phương pháp này cho phép xác định sự khác biệt di truyền giữa các mẫu cây, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc phân loại và bảo tồn. Việc sử dụng DNA barcoding giúp khắc phục những khó khăn trong việc nhận diện mẫu vật, đặc biệt là khi các đặc điểm hình thái không đủ rõ ràng. Nghiên cứu này không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn mà còn mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng các loài Tế tân trong y học cổ truyền.

2.1 Phân tích và đánh giá đa dạng di truyền

Phân tích đa dạng di truyền của Asarum splendens cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu thu thập từ các vùng khác nhau. Kết quả cho thấy rằng các mẫu từ Lai Châu và Vĩnh Phúc có sự khác biệt di truyền đáng kể, điều này có thể liên quan đến điều kiện môi trường sống và cách thức sinh trưởng của chúng. Việc đánh giá này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc điểm di truyền của loài mà còn cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về bảo tồn di truyền và ứng dụng trong y học.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về Asarum splendens không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật. Việc cung cấp dữ liệu DNA đặc trưng cho loài này sẽ hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong việc phân loại và nhận diện các loài Tế tân khác. Hơn nữa, nghiên cứu này có thể góp phần vào việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên, phục vụ cho y học cổ truyền và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm. Sự kết hợp giữa nghiên cứu di truyền và ứng dụng thực tiễn sẽ tạo ra những giá trị bền vững cho cộng đồng và môi trường.

3.1 Bảo tồn và phát triển bền vững

Việc bảo tồn Asarum splendens và các loài Tế tân khác là rất cần thiết trong bối cảnh hiện nay. Các biện pháp bảo tồn cần được thực hiện đồng bộ, bao gồm việc bảo vệ môi trường sống tự nhiên và phát triển các chương trình giáo dục cộng đồng về giá trị của các loài thực vật này. Nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao nhận thức về đa dạng di truyền mà còn khuyến khích việc sử dụng bền vững các nguồn tài nguyên thiên nhiên, từ đó góp phần vào sự phát triển bền vững của xã hội.

Tổng quan nghiên cứu

Chi Tế tân (Asarum L.) thuộc họ Nam mộc hương, gồm khoảng 128 loài phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu, trong đó Việt Nam ghi nhận 10 loài, tập trung ở các vùng núi phía Bắc như Lai Châu, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc. Loài Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens) là một trong những loài có giá trị dược liệu cao, được đồng bào dân tộc sử dụng làm thuốc chữa các bệnh viêm phế quản, hen suyễn, phong hàn. Tuy nhiên, các loài này đang bị đe dọa do khai thác quá mức và suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên.

Nghiên cứu nhằm định danh chính xác và đánh giá đa dạng di truyền của loài Tế tân Thanh Thành thu thập tại Việt Nam, sử dụng các chỉ thị DNA barcoding ITS1, ITS2, matK và rpoC. Mục tiêu cụ thể là thu thập mẫu tại các vùng núi Lai Châu, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự các đoạn gen, từ đó phân tích đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Thời gian nghiên cứu tập trung trong năm 2021, với các mẫu thu thập tại độ cao từ 800 đến 1200 m so với mực nước biển.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc bổ sung dữ liệu di truyền cho loài Tế tân Thanh Thành và các loài Tế tân khác tại Việt Nam, góp phần nâng cao độ chính xác trong phân loại, bảo tồn nguồn gen quý hiếm và ứng dụng trong y học cổ truyền.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết DNA barcoding, một phương pháp phân loại sinh học hiện đại sử dụng các đoạn DNA chuẩn có tính bảo thủ cao nhưng đủ biến đổi để phân biệt loài. Các chỉ thị DNA barcoding phổ biến trong thực vật gồm ITS1, ITS2 (vùng nội bộ trong gen nhân), matK và rpoC (vùng gen lục lạp).

• DNA barcoding: Phương pháp định danh loài dựa trên trình tự nucleotide của các đoạn DNA ngắn, giúp khắc phục hạn chế của phân loại hình thái truyền thống.
• ITS1 và ITS2: Vùng nội bộ trong gen ribosomal nhân, có tốc độ tiến hóa nhanh, đa dạng cao, phù hợp cho phân biệt loài trong chi Asarum.
• matK và rpoC: Các gen mã hóa enzyme trong hệ gen lục lạp, có tính bảo thủ cao, hỗ trợ xây dựng cây phát sinh chủng loại và đánh giá quan hệ phát sinh.
• Phân tích đa dạng di truyền: Sử dụng các công cụ tin sinh để so sánh trình tự, xác định đa hình nucleotide, xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Likelihood với bootstrap 1000.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu lá, thân của loài Tế tân Thanh Thành và các loài Tế tân khác được thu thập tại 4 địa điểm: Núi Tân Phong (Lai Châu), Bắc Phong Sinh (Quảng Ninh), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Yên Tử (Quảng Ninh) trong năm 2021. Tổng cộng 4 mẫu chính được nghiên cứu.
• Tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp CTAB cải tiến, kết hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol để loại bỏ tạp chất, thu DNA tổng số có độ tinh khiết cao (tỷ lệ A260/A280 từ 1,8 đến 2,0).
• Khuếch đại PCR: Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho ITS1, ITS2, matK và rpoC, tối ưu chu trình nhiệt với biến tính 95°C, gắn mồi 58°C, kéo dài 72°C, lặp lại 30 chu kỳ.
• Tinh sạch sản phẩm PCR: Áp dụng hai phương pháp tinh sạch trực tiếp bằng kit E.A®Cycle Pure Kit và tinh sạch qua gel agarose với GeneJET Gel Extraction Kit để loại bỏ sản phẩm không đặc hiệu.
• Giải trình tự DNA: Thực hiện trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer theo phương pháp Sanger, xử lý dữ liệu bằng phần mềm Chromas và BioEdit để hiệu chỉnh và loại bỏ nhiễu.
• Phân tích dữ liệu: So sánh trình tự với dữ liệu GenBank qua BLASTn, sắp xếp trình tự bằng MUSCLE, lựa chọn mô hình tiến hóa thích hợp bằng Jmodeltest, xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng MEGAX với phương pháp Maximum Likelihood và bootstrap 1000.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thu thập và đặc điểm hình thái: Mẫu Tế tân Thanh Thành (A. splendens) thu thập tại Lai Châu có đặc điểm lá hình tim, mặt trên lá xanh đậm ánh bạc, cuống lá tím, chiều cao cây 10-15 cm. Các mẫu Tế tân Yên Tử và Bắc Phong Sinh thuộc loài A. yentuense, Tam Đảo thuộc A. petelotii, đều phân bố ở độ cao 800-1200 m, khí hậu mát mẻ, độ ẩm cao.
2. Chất lượng DNA: DNA tổng số tách chiết từ 4 mẫu có chất lượng cao, tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0, phù hợp cho các bước PCR và giải trình tự.
3. Khuếch đại và tinh sạch DNA barcoding: Các đoạn ITS1 (~300 bp), ITS2 (~400 bp), matK (~800 bp), rpoC (~500 bp) được khuếch đại thành công với sản phẩm đặc hiệu sau tinh sạch.
4. Giải trình tự và đa dạng di truyền: Trình tự nucleotide của các chỉ thị có độ dài tương ứng 240 bp (ITS1), 339 bp (ITS2), 820 bp (matK), 474 bp (rpoC). Mẫu A. splendens Lai Châu có trình tự tương đồng cao với các trình tự tham chiếu trong GenBank (JF975949, JF975922). Mẫu Tế tân Tam Đảo có nhiều vị trí đa hình đặc trưng, khác biệt rõ rệt so với các mẫu còn lại. Hai mẫu Yên Tử và Bắc Phong Sinh có trình tự tương đồng cao với nhau, phản ánh sự gần gũi về mặt địa lý.
5. Cây phát sinh chủng loại: Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị DNA cho thấy sự phân nhóm rõ ràng giữa các loài, hỗ trợ phân loại chính xác và đánh giá đa dạng di truyền trong chi Asarum tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy DNA barcoding là công cụ hiệu quả để định danh và đánh giá đa dạng di truyền loài Tế tân Thanh Thành và các loài liên quan tại Việt Nam. Sự khác biệt trình tự ITS1 và ITS2 giữa các mẫu phản ánh mức độ đa dạng di truyền phù hợp với phân bố địa lý và đặc điểm sinh thái. Mẫu Tam Đảo có sự khác biệt lớn có thể do cách ly địa lý hoặc điều kiện môi trường đặc thù. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả tương đồng với các mẫu Asarum splendens từ Trung Quốc và Nhật Bản, đồng thời bổ sung dữ liệu mới cho các loài Tế tân tại Việt Nam. Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên nhiều chỉ thị DNA giúp tăng độ tin cậy trong phân loại và bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Các biểu đồ đa dạng nucleotide và bảng so sánh trình tự có thể minh họa rõ ràng sự khác biệt và tương đồng giữa các mẫu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường thu thập mẫu và mở rộng nghiên cứu đa dạng di truyền: Thực hiện thu thập thêm mẫu tại các vùng núi khác của Việt Nam trong vòng 2 năm tới nhằm đánh giá toàn diện đa dạng di truyền của chi Asarum, đặc biệt các loài quý hiếm. Chủ thể thực hiện: Viện Nghiên cứu Hệ gen, các trường đại học sinh học.
2. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA barcoding quốc gia cho các loài Tế tân: Thiết lập hệ thống lưu trữ và chia sẻ dữ liệu trình tự DNA để hỗ trợ công tác phân loại, giám định và bảo tồn. Thời gian thực hiện 1-2 năm, chủ thể: Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong bảo tồn và phát triển dược liệu: Sử dụng dữ liệu đa dạng di truyền để xây dựng kế hoạch bảo tồn tại chỗ và nhân giống các loài Tế tân có nguy cơ suy giảm, đồng thời phát triển nguồn nguyên liệu dược liệu bền vững. Chủ thể: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, các trung tâm bảo tồn thiên nhiên.
4. Nâng cao nhận thức cộng đồng và đào tạo chuyên môn: Tổ chức các khóa đào tạo về nhận dạng loài bằng DNA barcoding cho cán bộ nghiên cứu, quản lý rừng và cộng đồng dân tộc thiểu số nhằm giảm khai thác bừa bãi và bảo vệ nguồn gen quý. Thời gian 1 năm, chủ thể: Viện Nghiên cứu Hệ gen, các tổ chức phi chính phủ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và đa dạng sinh học: Sử dụng dữ liệu và phương pháp nghiên cứu để phát triển các đề tài liên quan đến phân loại, tiến hóa và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm.
2. Chuyên gia bảo tồn thiên nhiên và quản lý rừng: Áp dụng kết quả đánh giá đa dạng di truyền để xây dựng chiến lược bảo tồn hiệu quả, đặc biệt với các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
3. Ngành dược liệu và y học cổ truyền: Tham khảo thông tin về đặc điểm sinh học, đa dạng di truyền và tiềm năng dược liệu của loài Tế tân Thanh Thành để phát triển sản phẩm thuốc và nguyên liệu bền vững.
4. Cộng đồng dân tộc thiểu số và người làm nghề trồng trọt, thu hái dược liệu: Nâng cao hiểu biết về nhận dạng loài, bảo vệ nguồn gen và sử dụng hợp lý các loài Tế tân trong y học dân gian, tránh khai thác quá mức.

Câu hỏi thường gặp

1. DNA barcoding là gì và tại sao lại quan trọng trong nghiên cứu này?
   DNA barcoding là phương pháp sử dụng đoạn DNA chuẩn để định danh loài chính xác, giúp khắc phục hạn chế của phân loại hình thái truyền thống. Trong nghiên cứu này, nó giúp phân biệt các loài Tế tân có hình thái tương đồng và đánh giá đa dạng di truyền.

2. Các chỉ thị DNA ITS1, ITS2, matK và rpoC có vai trò gì?
   ITS1 và ITS2 là vùng gen nhân có tốc độ tiến hóa nhanh, phù hợp để phân biệt loài. matK và rpoC thuộc hệ gen lục lạp, có tính bảo thủ cao, hỗ trợ xây dựng cây phát sinh chủng loại và đánh giá quan hệ phát sinh giữa các loài.

3. Chất lượng DNA được đánh giá như thế nào?
   Chất lượng DNA được đánh giá qua tỷ lệ hấp thụ quang học A260/A280, giá trị từ 1,8 đến 2,0 cho thấy DNA tinh khiết, không bị nhiễm protein hay RNA, đảm bảo cho các bước PCR và giải trình tự.

4. Tại sao cần tinh sạch sản phẩm PCR?
   Tinh sạch loại bỏ các sản phẩm không đặc hiệu, mồi dư thừa và tạp chất, giúp tăng độ chính xác của kết quả giải trình tự DNA, tránh sai sót trong phân tích đa dạng di truyền.

5. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng thực tiễn như thế nào?
   Kết quả giúp định danh chính xác các loài Tế tân, hỗ trợ bảo tồn nguồn gen quý hiếm, phát triển dược liệu bền vững và nâng cao hiệu quả sử dụng trong y học cổ truyền, đồng thời cung cấp dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo.

Kết luận

• Đã thu thập và xác định thành công 4 mẫu Tế tân tại các vùng núi phía Bắc Việt Nam, trong đó có loài Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens).
• DNA tổng số được tách chiết với chất lượng cao, các đoạn DNA barcoding ITS1, ITS2, matK và rpoC được khuếch đại, tinh sạch và giải trình tự thành công.
• Phân tích trình tự cho thấy đa dạng di truyền rõ rệt giữa các mẫu, phản ánh sự khác biệt về mặt địa lý và sinh thái.
• Cây phát sinh chủng loại xây dựng từ các chỉ thị DNA hỗ trợ phân loại chính xác và đánh giá đa dạng di truyền trong chi Asarum tại Việt Nam.
• Nghiên cứu cung cấp dữ liệu quan trọng cho công tác bảo tồn, phát triển dược liệu và nghiên cứu khoa học tiếp theo về loài Tế tân.

Hành động tiếp theo: Mở rộng thu thập mẫu, xây dựng cơ sở dữ liệu DNA barcoding quốc gia và ứng dụng kết quả trong bảo tồn và phát triển dược liệu quý hiếm. Đề nghị các nhà nghiên cứu và quản lý liên quan phối hợp triển khai các giải pháp bảo vệ nguồn gen quý giá này.