Đặt vấn đề Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là một trong những cây hoa cắt cành phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây hoa huệ là loại cây trồng mang lại thu nhập cao hơn so với lúa hoặc các cây trồng khác. Vì vậy, cây hoa huệ đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và đƣợc xem là cây trồng xóa đói giảm nghèo ở các tỉnh nhƣ Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và An Giang. Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh đƣợc canh tác chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu bằng củ qua nhiều thế hệ dẫn đến giống bị thoái hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh tấn công và làm giảm năng suất đáng kể. Do đó, nhu cầu về giống mới để thay thế đang rất cần thiết. Mặt khác, việc lai tạo giống mới ở cây hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải một số hạn chế do tính bất tƣơng hợp cao vì hoa có nhụy và nhị chín không cùng lúc và hạt không tạo đƣợc trong điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al. Hơn nữa, chỉ có giống hoa đơn thì tạo đƣợc hạt nhƣng hạt khó nẩy mầm.
Có lẽ tạo đột biến là cách tốt nhất trong việc tạo giống hoa huệ mới. Trong các tác nhân đột biến vật lý, tia gamma đƣợc sử dụng rộng rãi và có hiệu quả nhất (Matsumara et al. Kỹ thuật này làm tăng biến dị di truyền ở một số loài hoa nhƣ sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trƣởng… của hoa (Xu et al. Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần đƣợc áp dụng để tăng số mẫu đƣợc chiếu xạ.
Sự nhân giống cây hoa huệ in vitro đã đƣợc nghiên cứu (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007; Hutchinson et al. Trong đó, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chiếu xạ là phƣơng pháp hiệu quả để làm cây sạch bệnh, nhân nhanh và có đƣợc biến dị. Sự kết hợp này đƣợc áp dụng thành công trên cọ, táo, khoai tây, khoai lang và khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) và hoàn toàn có thể áp dụng trong việc chọn tạo giống hoa huệ. Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng trong sự nở hoa, sự thụ phấn và giao phấn… Đối với cây hoa kiểng, số lƣợng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu hình hoa.
Khi xử lý tia gamma riêng lẻ và nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia gamma đã làm thay đổi số lƣợng cánh hoa hồng, sự gia tăng số lƣợng cánh hoa cúc (Usenbaevard and Imankulova, 1974; Kahrizi et al. Do đó, ở hoa huệ khả năng gây đột biến tạo nguồn biến dị mới về đặc điểm tăng số lƣợng cánh hoa rất cao khi nuôi cấy in vitro và xử lý tia gamma. Cho đến nay, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ ở Việt Nam, chƣa có giống hoa huệ mới với nhiều cánh hoa đƣợc tạo ra theo phƣơng pháp truyền thống cũng nhƣ các phƣơng pháp chọn giống bằng kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại khác. Nhƣ vậy, cần thiết phải thực hiện nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro”.1 Mục tiêu chính Chọn đƣợc giống hoa huệ có số lƣợng cánh hoa nhiều hơn giống làm vật liệu nghiên cứu, có kích thƣớc hoa to hơn và có hƣơng thơm.2 Mục tiêu cụ thể (1) Đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để tạo nguồn vật liệu mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co).
(2) Xác định liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy. (3) Xác định các dạng bất thƣờng về kiểu hình của cây giai đoạn thuần dƣỡng. (4) Chọn đƣợc một đến hai dòng hoa huệ tăng về số lƣợng cánh hoa (nhiều hơn 12 cánh), kích thƣớc hoa to hơn và có mùi thơm theo phƣơng pháp nhân giống truyền thống.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 1.1 Đối tƣợng nghiên cứu - Hai giống hoa huệ đang đƣợc canh tác ở tỉnh An Giang.2 Phạm vi nghiên cứu - Số giống nghiên cứu: giống hoa huệ đơn và kép. - Thời gian nghiên cứu: Tháng 10 năm 2013 đến tháng 8 năm 2017.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.1 Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu đã kết hợp kỹ thuật nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co).
Cụ thể, đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để tạo vật liệu khởi đầu cho quy trình chọn giống. Về mặt lý thuyết, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng tạo đƣợc nguồn mẫu sạch bệnh. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ - Cung cấp số liệu về đặc điểm sinh trƣởng; xác định đƣợc liều gây chết 50% của tia gamma (60Co) và các dạng bất thƣờng về hình thái của lá trên cụm mô sẹo (giống hoa huệ đơn) và cụm chồi (giống hoa huệ kép) giai đoạn in vitro. - Cung cấp số liệu nông học về đặc điểm sinh trƣởng, ra hoa, các dạng bất thƣờng về lá, thân, củ, hoa và mùi thơm của hoa giai đoạn thuần dƣỡng và ngoài đồng.
- Bên cạnh đó, nghiên cứu đã đánh giá sự đa dạng về mặt di truyền bằng một số kỹ thuật ADN nhƣ PCR-ISSR và giải trình tự đoạn gen vùng ITS1/4 của 2 dòng hoa huệ đột biến chọn đƣợc và 2 giống hoa huệ đối chứng. - Kết quả của Luận án là tài liệu khoa học để tham khảo cho công tác nghiên cứu và giảng dạy ở các Trƣờng đại học và Viện nghiên cứu.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng đã tạo ra một lƣợng lớn mẫu cấy sạch bệnh làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu. Phƣơng pháp này ít tốn kém hơn phƣơng pháp xử lý bằng củ. - Xác định liều gây chết 50% cũng nhƣ quy trình chọn tạo giống hoa huệ rất cần thiết cho các nghiên cứu sau này.
- Các kết quả của luận án góp phần cải tiến gen và đa dạng nguồn gen hoa huệ; đã tạo đƣợc nhiều dòng hoa huệ có đặc tính nổi trội, trong đó chọn đƣợc 2 dòng hoa huệ đột biến có các đặc tính hình thái khác biệt và có ƣu điểm hơn so với 2 giống ban đầu nhƣ hoa to, nhiều cánh (22 và 36 cánh) và có hƣơng thơm. Điểm mới của luận án - Luận án chọn cây hoa huệ là cây hoa có giá trị kinh tế cao nhƣng chƣa đƣợc nghiên cứu trong việc tạo giống mới ở Việt Nam. Luận án đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để làm vật liệu khởi đầu để xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co); xác định đƣợc liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co) trên mẫu mô sẹo giống hoa huệ đơn và cụm chồi giống hoa huệ kép trong điều kiện in vitro. - Ở hai giống/dòng hoa huệ, xác định các dạng bất thƣờng về hình thái lá và chồi sau 150 ngày nuôi cấy in vitro; xác định các dạng bất thƣờng về hình thái lá, thân và củ sau 60 ngày trồng ngoài đồng; xác định đặc điểm sinh trƣởng cũng nhƣ các dạng bất thƣờng về hình thái hoa và mùi thơm giai đoạn sau 180 ngày trồng ngoài đồng.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ - Chọn đƣợc 2 dòng hoa huệ đột biến có đặc tính khác so với giống ban đầu nhƣ tăng số cánh hoa lên 22 và 36 cánh, kích thƣớc hoa to và hoa có mùi thơm sau 2 thế hệ trồng ngoài đồng. - Đánh giá đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp PCR-ISSR để chứng minh sự khác biệt về gen giữa hai dòng hoa huệ đột biến so với hai giống hoa huệ đối chứng, cụ thể là có sự xuất hiện hoặc mất đi băng ADN; tiếp tục giải trình tự gen để so sánh trình tự ADN vùng ITS1/4 các dòng/giống hoa huệ này để thấy đƣợc các dạng đột biến nhƣ thay thế, mất hoặc thêm một/một đoạn nucleotide. - Luận án đã xây dựng đƣợc quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây hoa huệ 2.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật cây hoa huệ Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) có nguồn gốc từ Mexico, đƣợc trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thuộc lớp phụ Lilidae, bộ Liliales và họ Agavaceae với bộ nhiễm sắc thể 2n = 30.
Tổng cộng gồm 12 loài và có 9 loài với đặc điểm hoa màu trắng (Khandagale et al., 2014; Rodrigo et al., 2012; Mohammadi et al.2 Đặc điểm thực vật cây hoa huệ Cây hoa huệ là loài đơn tử diệp, thân thảo, rễ chùm, ƣa sáng, ƣa nhiệt và nở hoa quanh năm (Sangavai and Chellapandi, 2008; Ahmad et al. Loại hoa này còn đƣợc gọi là dạ lai hƣơng (thơm ban đêm) hoặc vũ lai hƣơng (thơm lúc mƣa) do đặc điểm hoa nở về đêm, có khả năng tỏa hƣơng về ban đêm với mùi hƣơng ngào ngạt. * Thân: Hoa huệ thuộc cây thân thảo sống nhiều năm. Thân hành hay còn gọi là thân giả đƣợc kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trƣớc phủ lên bẹ lá sau.
Thân thẳng không phân nhánh, gốc mọc lá thành chùm. Cây hoa huệ có thân thẳng đứng, tròn, màu xanh thẫm, yếu, không phân nhánh vƣơn lên thành một ngồng hoa (Đặng Phƣơng Trâm, 2005). * Củ và rễ: Cây hoa huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 1,0-15,0 cm. Có hai loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ con gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây, củ hình tròn dài giống cây tỏi.
Củ giữ chức năng dự trữ các chất dinh dƣỡng để nuôi cây (Trần Văn Mão, 2006). * Lá: Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gốc rộng và to thành hình để bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng. Lá dài, không có răng cƣa, mọc lệch. Chiều dài lá khoảng 20,0-30,0 cm, bề rộng của lá từ 0,5-1,0 cm (Sangavai and Chellapandi, 2008).
* Hoa: Cây hoa huệ ra hoa không chịu ảnh hƣởng bởi quang kỳ.