Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Tập Đoàn Địa Lan Cymbidium Khu Vực Miền Núi Đông Bắc Việt Nam

Họ Lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật lớn nhất, với khoảng 800 chi phân bố rộng khắp… 272 trang · Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam · 2023.

• Tác giả: Phạm Phương Thu
• Người hướng dẫn: Ngô Xuân Bình
• Trường học: Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Di Truyền Và Chọn Giống Cây Trồng
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Tập Đoàn Địa Lan (Cymbidium) Khu Vực Miền Núi Đông Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của luận án
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.5. Những đóng góp mới của luận án
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
• 2.1. Giới thiệu chung về hoa lan
• 2.2. Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm
• 2.2.1. Phân loại
• 2.2.2. Phân bố
• 2.3. Nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam
• 2.4. Giá trị, thực trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen lan kiếm
• 2.5. Tình hình nghiên cứu chi lan kiếm trên thế giới và Việt Nam
• 2.6. Nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.7. Nghiên cứu nhân giống và lai tạo chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.8. Các kết luận qua phân tích tổng quan
• 3. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái
• 3.3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử
• 3.3.3. Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm
• 3.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro
• 3.3.5. Phần mềm xử lý số liệu
• 3.3.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái
• 4.2. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử
• 4.3. Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.4. Kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.5. Kết quả nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.6. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng để nhận dạng các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.7. So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử
• 4.8. Đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có
• 4.9. Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro
• 4.10. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense)
• 4.11. Kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii)
• 4.12. Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc
• 4.13. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam
• 4.14. Khảo sát và xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• Danh mục các công trình khoa học công bố liên quan đến luận án tiến sĩ
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Địa Lan Cymbidium

Họ Lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật lớn nhất, với khoảng 800 chi phân bố rộng khắp trên thế giới. Chi Địa lan Cymbidium, với những loài hoa lớn, đẹp và bền, là một phần quan trọng của họ này. Chi này phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á. Theo các số liệu đã công bố, chi lan kiếm trên thế giới hiện nay có khoảng 120 loài trong đó châu Á có 52 loài, tại Việt Nam có 24 loài. Nghiên cứu mới nhất về lan kiếm cho biết, các loài trong chi lan kiếm có bộ NST 2n = 2x = 40. Tuy nhiên, sự khai thác quá mức và phá rừng đang đe dọa sự tồn tại của nhiều loài lan kiếm, đặc biệt là ở Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu và bảo tồn đa dạng di truyền của chi lan này là vô cùng cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền địa lan Cymbidium ở khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam, nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Chi Địa Lan Cymbidium

Chi Địa lan Cymbidium thuộc họ Lan (Orchidaceae), bộ măng tây (Asparagales). Các loài trong chi này có đặc điểm chung là hoa lớn, đẹp, và thường sống phụ sinh trên cây hoặc trên các hốc đá. Tại Việt Nam, chi lan kiếm có 24 loài. Theo nghiên cứu của giáo sư Trần Duy Quý, trong 24 loài lan kiếm tại Việt Nam, có 13 loài bám trên cây, 5 loài mọc trên đất hoặc bám trên đá, 5 loài bám trên cây hoặc hoặc bám trên đá, có 1 loài không có lá chỉ sống trong mùn nhờ một hệ thống rễ rất phát triển. Chi Địa lan Cymbidium có giá trị kinh tế và thẩm mỹ cao, được ưa chuộng trong trang trí và làm cảnh.

1.2. Phân Bố Địa Lan Cymbidium Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, chi Địa lan Cymbidium phân bố chủ yếu ở khu vực miền núi phía Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Các kết quả điều tra cho thấy có 6 vùng phân bố lan kiếm chính bao gồm: (1) phía Tây Bắc Bộ, (2) phía Đông Bắc Bộ và trung tâm Bắc Bộ, (3) Bắc Trung Bộ, (4) khu vực Trung Bộ, (5) Tây Nguyên, (6) Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Trong 6 vùng trên, chi lan kiếm được phân bố chủ yếu ở... Điều này cho thấy sự đa dạng về môi trường sống và điều kiện khí hậu đã tạo nên sự phong phú về loài và biến dị di truyền của chi lan này.

II. Thách Thức Bảo Tồn Nguồn Gen Địa Lan Cymbidium Quý Hiếm

Mặc dù Việt Nam có nguồn tài nguyên Địa lan Cymbidium phong phú, nhưng đang đối mặt với nhiều thách thức lớn. Sự khai thác quá mức, nạn phá rừng và biến đổi khí hậu đang đe dọa nghiêm trọng đến sự tồn tại của nhiều loài lan quý hiếm. Các nghiên cứu về lan kiếm ở Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào một số loài nhập nội hoặc có giá trị kinh tế cao. Việc nghiên cứu một cách hệ thống về đặc điểm hình thái và đa dạng di truyền của chi lan kiếm còn chưa được quan tâm đúng mức. Vấn đề lai tạo để tạo ra giống hoa lan kiếm mới mang bản quyền Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ. Do đó, cần có những giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gen Địa lan Cymbidium quý giá này.

2.1. Nguy Cơ Mất Nguồn Gen Địa Lan Cymbidium

Sự khai thác ồ ạt và thiếu kiểm soát đã dẫn đến tình trạng suy giảm nghiêm trọng số lượng cá thể của nhiều loài Địa lan Cymbidium trong tự nhiên. Nạn phá rừng làm mất môi trường sống tự nhiên của lan, khiến chúng khó có thể tái sinh và phát triển. Biến đổi khí hậu cũng gây ra những tác động tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của lan, làm tăng nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài. Cần có những biện pháp khẩn cấp để ngăn chặn tình trạng này.

2.2. Thiếu Hụt Nghiên Cứu Về Đa Dạng Di Truyền Địa Lan

Các nghiên cứu về đa dạng di truyền của chi lan kiếm ở Việt Nam còn rất hạn chế. Hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào một số loài có giá trị kinh tế cao, bỏ qua nhiều loài lan quý hiếm khác. Việc thiếu thông tin về đặc điểm di truyền của các loài lan này gây khó khăn cho công tác bảo tồn và phát triển. Cần có những nghiên cứu chuyên sâu hơn để đánh giá đầy đủ đa dạng di truyền của chi lan kiếm ở Việt Nam.

III. Phương Pháp Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Địa Lan Cymbidium

Để đánh giá đa dạng di truyền của Địa lan Cymbidium, cần sử dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm đánh giá hình thái và phân tích phân tử. Đánh giá hình thái dựa trên các đặc điểm quan sát được của cây, như hình dạng lá, màu sắc hoa, kích thước cây. Phân tích phân tử sử dụng các chỉ thị DNA để xác định sự khác biệt về cấu trúc di truyền giữa các cá thể. Kết hợp cả hai phương pháp này sẽ cho phép đánh giá một cách toàn diện và chính xác đa dạng di truyền của Địa lan Cymbidium.

3.1. Đánh Giá Đa Dạng Hình Thái Địa Lan Cymbidium

Đánh giá hình thái là phương pháp truyền thống để xác định sự khác biệt giữa các loài và các giống lan. Các đặc điểm hình thái được sử dụng bao gồm hình dạng lá, kích thước và màu sắc hoa, cấu trúc thân và rễ. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, nhưng có thể bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường. Bảng đánh giá một số đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho lan kiếm của UPOV được sử dụng để mã hoá theo ma trận các tính trạng hình thái của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm.

3.2. Phân Tích Phân Tử Đa Dạng Di Truyền Địa Lan

Phân tích phân tử sử dụng các chỉ thị DNA để xác định sự khác biệt về cấu trúc di truyền giữa các cá thể. Các chỉ thị DNA phổ biến được sử dụng bao gồm SSR (Simple Sequence Repeats), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) và trình tự gen. Phương pháp này cho phép đánh giá đa dạng di truyền một cách chính xác và khách quan, không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường. Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu và kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu được sử dụng để nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Di Truyền Trong Bảo Tồn Địa Lan Cymbidium

Nghiên cứu đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công tác bảo tồn Địa lan Cymbidium. Thông tin về cấu trúc di truyền của các loài lan giúp xác định các quần thể có giá trị bảo tồn cao, lựa chọn các cá thể để nhân giống và tái trồng, và xây dựng các chương trình bảo tồn hiệu quả. Ngoài ra, nghiên cứu di truyền cũng giúp xác định các loài lan có nguy cơ tuyệt chủng cao, từ đó có những biện pháp bảo vệ kịp thời.

4.1. Xác Định Quần Thể Địa Lan Cymbidium Cần Ưu Tiên Bảo Tồn

Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp xác định các quần thể lan có đa dạng di truyền cao, có khả năng thích ứng tốt với biến đổi môi trường. Các quần thể này cần được ưu tiên bảo tồn để duy trì nguồn gen quý giá của chi lan kiếm. So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có.

4.2. Nhân Giống Và Tái Trồng Địa Lan Cymbidium Quý Hiếm

Nghiên cứu di truyền giúp lựa chọn các cá thể lan có đặc điểm tốt để nhân giống và tái trồng. Việc nhân giống có thể được thực hiện bằng phương pháp truyền thống hoặc bằng phương pháp nuôi cấy mô. Tái trồng lan vào môi trường tự nhiên giúp phục hồi các quần thể lan bị suy giảm và tăng cường đa dạng sinh học.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Địa Lan Cymbidium

Nghiên cứu nhân giống in vitro một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense) và kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii) cho thấy tiềm năng lớn trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm. Phương pháp này cho phép nhân nhanh số lượng lớn cây giống từ một mẫu ban đầu, giúp giảm áp lực khai thác từ tự nhiên.

5.1. Nhân Giống In Vitro Lan Kiếm Bạch Ngọc Đuôi Công

Hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công nảy mầm và phát triển tốt trên môi trường MS. Ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) và ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) được nghiên cứu chi tiết. Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) và ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần) cũng được đánh giá.

5.2. Nhân Giống In Vitro Địa Lan Bạch Ngọc

Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần) và ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần) được nghiên cứu. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng tạo cây con lan kiếm Bạch ngọc từ rễ trong điều kiện in vitro ( sau 8 tuần) cũng được đánh giá.

VI. Lai Tạo Và Chọn Tạo Giống Địa Lan Cymbidium Mới

Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam được đánh giá. Khảo sát và xác định xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống và nâng cao hiệu quả.

6.1. Tạo Quần Thể Lai F1 Địa Lan Cymbidium

Một số đặc điểm hình thái hoa, lá của các mẫu giống dùng làm bố, mẹ tạo quần thể lai F1 được ghi nhận. Tỷ lệ đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm vùng núi Đông Bắc được xác định. Một số hình ảnh kết quả lai tạo nguồn gen lan kiếm vùng núi Đông Bắc Việt Nam (sau 8 tháng thụ phấn) được ghi lại.

6.2. Xác Định Marker Nhận Dạng Con Lai Sớm

Một số hình ảnh từ khi lai tạo trên cây mẹ ♀ DL19 đến khi thu nhận quả của cặp lai ♀ DL19 (Kiếm lô hội) x ♂ DL21 (Kiếm vàng) và một số hình ảnh từ khi lai tạo trên cây mẹ ♀ DL17 đến khi thu nhận quả lai của cặp lai ♀ DL17 (Mạc xuân) x ♂ DL21 (Kiếm lô hội) được ghi lại. Kết quả khảo sát đa hình bố mẹ của cặp lai giữa ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) với chỉ thị phân tử SSR, kết quả khảo sát đa hình bố mẹ của cặp lai giữa ♀ DL19 (Kiếm lô hội) x ♂ DL15 (Kiếm vàng) với chỉ thị phân tử SSR và kết quả khảo sát đa hình bố mẹ của cặp lai giữa ♀ DL17 (Mạc xuân) x ♂ DL21 (Kiếm lô hội) với chỉ thị phân tử SSR được phân tích. Kết quả điện di sản phẩm PCR các cá thể con lai của cặp lai giữa ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) với chỉ thị CS8, kết quả điện di sản phẩm PCR các cá thể con lai của cặp lai giữa ♀ DL19 (Kiếm lô hội) x ♂ DL21 (Kiếm vàng) với chỉ thị CS7 và kết quả điện di sản phẩm PCR các cá thể con lai của cặp lai giữa ♀ DL17 (Mạc xuân) x ♂ DL21 (Kiếm lô hội) với chỉ thị CS11 được sử dụng để xác định marker nhận dạng con lai sớm.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình "Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Phạm Phương Thu dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Ngô Xuân Bình và TS. Trần Ngọc Hùng, tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS), chuyên ngành Di truyền và chọn giống cây trồng (mã số: 9620111), bảo vệ năm 2023.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Họ lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật có hoa lớn nhất trên thế giới với khoảng 800 chi. Trong đó, chi lan kiếm (Cymbidium) phân bố rộng rãi tại Đông Nam Á với khoảng 120 loài trên thế giới, 52 loài ở châu Á và 24 loài đã được ghi nhận tại Việt Nam. Vùng núi Đông Bắc Việt Nam có điều kiện địa hình và khí hậu cận nhiệt đới ẩm thích hợp cho nhiều loài lan kiếm sinh trưởng, chiếm hơn 50% tổng số loài lan kiếm tự nhiên của cả nước. Tuy nhiên, hoạt động khai thác quá mức và nạn phá rừng đã làm suy giảm nghiêm trọng các quần thể lan kiếm bản địa, đẩy nhiều loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng.

Trước khi luận án được thực hiện, các nghiên cứu về lan kiếm ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào việc khảo sát sơ bộ hình thái hoặc nhân giống một số giống ngoại nhập và các loài có giá trị thương mại đơn lẻ. Thiếu vắng các nghiên cứu có hệ thống kết hợp giữa đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử nhằm đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen bản địa. Đồng thời, công tác lai tạo nhằm tạo ra các giống lan kiếm mới mang bản quyền Việt Nam từ nguồn vật liệu di truyền địa phương chưa được đầu tư nghiên cứu bài bản.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai nhóm mục tiêu cụ thể:

1. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền ở cấp độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử nhằm xác định mối quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam, phục vụ trực tiếp cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống.
2. Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho 02 loài lan kiếm quý và tiến hành lai tạo, đánh giá khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai, xác định chỉ thị phân tử nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm (Cymbidium spp.) thu thập từ các tỉnh thuộc khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam.
• Phạm vi không gian: 11 tỉnh miền núi phía Bắc gồm Bắc Giang, Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Giang, Lào Cai, Phú Thọ, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Yên Bái.
• Phạm vi thời gian: Toàn bộ các nội dung thực nghiệm, phân tích trong phòng thí nghiệm và khảo nghiệm thực tế được triển khai trong thời gian 5 năm (hoàn thành và bảo vệ năm 2023).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trong và ngoài nước

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu chính về chi lan kiếm:

1. Phân loại học và điều tra nguồn gen:

   • Tại Việt Nam: Nghiên cứu của Trần Duy Quý (2009) đã ghi nhận 24 loài lan kiếm, mô tả tập tính sống (13 loài biểu sinh bám cây, 5 loài địa sinh hoặc thạch sinh bám đá, 5 loài vừa bám cây vừa bám đá, 1 loài hoại sinh không lá sống trong mùn). Trần Hợp (2007) ghi nhận 13/24 loài phân bố tại vùng Đông Bắc: Kiếm lô hội (C. aloifolium), Kiếm Thanh ngọc (C. ensifolium), Kiếm Trần mộng xuân (C. lowianum), Kiếm Bạch ngọc (C. eburneum), Kiếm Bạch ngọc Xuân (C. longifolium), Kiếm Hồng Hoàng (C. iridioides), Kiếm rủ (C. atropurpureum), Kiếm thu (C. tracyanum), Kiếm lục (C. hookerianum), Hồng lan (C. sanderae), Kiếm gấm (C. floribundum), Kiếm Lá giáo (C. lancifolium), và Kiếm mỡ gà lá dài (C. elegans).

2. Đánh giá đa dạng di truyền:

   • Trên thế giới: Choi và cộng sự (2006) sử dụng RAPD phân tích 21 loài lan kiếm châu Á; Sharma và cộng sự (2012) giải trình tự vùng ITS2 trên 10 loài lan kiếm Đông Bắc Ấn Độ; Zhang và cộng sự sử dụng vùng nhân nrITS và 7 gen lục lạp (rbcL, matK, trnS, trnG, trnL, psbA, atpI) trên 70 loài; Lee và cộng sự (2020) dùng 13 locus SSR phân tích 1566 mẫu C. goeringii; Du và cộng sự (2021) giải mã bộ gen lục lạp C. dayanum (155.408 bp); Ling và cộng sự giải mã hệ gen lục lạp C. mastersii.
   • Tại Việt Nam: Trần Duy Dương (2006) phân nhóm 17 mẫu giống lan kiếm theo hình thái; Khuất Hữu Trung (2007) sử dụng 12 mồi RAPD chia 17 mẫu giống thành 5 nhóm; Phạm Thị Hồng Hạnh (2017) dùng 25 chỉ thị SSR phân tích đa dạng di truyền 31 dòng Cymbidium sinense.

3. Nghiên cứu vi nhân giống và lai tạo giống:

   • Quốc tế: Lewis Knudson (1922, 1946) phát triển môi trường Knudson B, C gieo hạt không cộng sinh; Morel (1964) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo dòng sạch virus; Meera và cộng sự (2007) nhân giống C. devonianum; Malabadi và cộng sự (2008) ứng dụng 24-epibrassinolide trên C. bicolor; Pant và cộng sự (2012) vi nhân giống C. iridioides; Mohanty và cộng sự (2012) nhân giống C. mastersii; Park và cộng sự (2018) tái sinh C. goeringii từ rễ.
   • Tại Việt Nam: Dương Tấn Nhựt (2004, 2007) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhân nhanh PLB và sản xuất hạt nhân tạo; Trần Thị Ngọc Lan và cộng sự (2013, 2017) khảo sát hạt nhân tạo và mô sẹo phát sinh phôi Cymbidium hybrid FX750; Hoàng Thị Nga (2008) nhân giống C. iridioides.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết

Mặc dù vùng Đông Bắc có nguồn gen phong phú, chưa có công trình nào đánh giá toàn diện đa dạng di truyền tập đoàn lan kiếm bản địa tại đây bằng sự kết hợp giữa chỉ thị hình thái DUS và chỉ thị phân tử (giải trình tự vùng gen lục lạp rbcL). Bên cạnh đó, việc hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính từ rễ đối với loài Cymbidium mastersii, gieo hạt in vitro loài Cymbidium wenshanense, cùng kỹ thuật sử dụng chỉ thị SSR để xác thực con lai F1 ở giai đoạn vườn ươm sớm chưa từng được thực hiện đồng bộ trên nguồn gen Đông Bắc.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đa dạng di truyền thực vật: Dựa trên các biến dị di truyền ở mức độ kiểu hình (tính trạng hình thái thân, lá, hoa theo tiêu chuẩn UPOV) và cấp độ phân tử DNA.
• Tiêu chuẩn DUS cho lan kiếm: Hướng dẫn khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định (Distinctness, Uniformity, Stability) của UPOV đối với chi Cymbidium.
• Mã vạch DNA và gen lục lạp: Sử dụng vùng gen rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit) thuộc hệ gen lục lạp (cpDNA) để đánh giá mối quan hệ phát sinh chủng loại.
• Vi nhân giống (In vitro tissue culture): Dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật, sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA, IAA) và cytokinin (BA, Kinetin, TDZ) kết hợp chất nền hữu cơ, sucrose và than hoạt tính.
• Di truyền học chọn giống: Khảo sát tính tương hợp sinh sản qua tỷ lệ đậu quả của các tổ hợp lai nhân tạo và ứng dụng chỉ thị vi vệ tinh (SSR - Simple Sequence Repeats) có tính đồng trội để kiểm tra con lai F1.

Phương pháp nghiên cứu cụ thể

Phương pháp	Nội dung kỹ thuật	Dụng cụ / Hóa chất / Phần mềm
Đánh giá hình thái	Khảo sát các chỉ tiêu thân, củ giả, dạng phiến lá, màu sắc và cấu trúc hoa theo tiêu chuẩn DUS của UPOV; mã hóa ma trận nhị phân.	Thước đo, bảng so màu chuẩn; phần mềm NTSYS-pc.
Sinh học phân tử	- Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB. - Khuếch đại PCR vùng gen lục lạp bằng cặp mồi rbcL-F / rbcL-R. - Điện di trên gel agarose, tinh sạch sản phẩm PCR. - Giải trình tự DNA tự động bằng hệ thống ABI. - Phân tích SSR xác định tính đa hình con lai với các cặp mồi vi vệ tinh (CS7, CS8, CS11).	Cặp mồi rbcL-F/R; máy PCR, máy giải trình tự Applied Biosystems (ABI); hệ thống điện di; phần mềm MEGA, BLAST (NCBI).
Nhân giống in vitro	- Khử trùng hạt và rễ mẫu khởi đầu. - Thử nghiệm môi trường cơ bản (MS, 1/2 MS, KC, VW). - Khảo sát nồng độ Cytokinin (BA, Kinetin, TDZ), Auxin (NAA, IBA, IAA), Sucrose và than hoạt tính (THT).	Tủ cấy vô trùng, môi trường MS, agar, đường sucrose, chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
Lai tạo và đánh giá F1	Thụ phấn nhân tạo giữa các dòng tuyển chọn; theo dõi tỷ lệ đậu quả sau 8 tháng; gieo ươm hạt lai; phân tích SSR cây lai.	Kẹp thụ phấn, túi bao hoa cách ly; máy PCR phân tích marker SSR.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu trình bày bối cảnh chung về giá trị kinh tế, thẩm mỹ và dược liệu của chi lan kiếm; tính cấp thiết của việc bảo tồn nguồn gen bản địa tại 11 tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam; xác định rõ mục tiêu, ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu và các điểm mới của đề tài.

Chương I. Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài

Chương này tổng thuật toàn diện các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam:

• Đặc điểm thực vật học, hệ thống phân loại, phân bố sinh thái của chi lan kiếm (bộ NST $2n = 2x = 40$).
• Nguồn gen 13 loài lan kiếm đặc trưng tại khu vực Đông Bắc theo mô tả của Trần Hợp.
• Đánh giá giá trị kinh tế (chiếm 10% giao dịch hoa tươi quốc tế, nhập khẩu hoa lan Việt Nam gấp 3 lần xuất khẩu), giá trị dược liệu của các loài C. aloifolium, C. ensifolium, C. elegans, C. iridioides.
• Tổng hợp các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền: hình thái, isozyme, RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR và giải trình tự gen mã vạch lục lạp (rbcL, matK, ITS).
• Lịch sử phát triển kỹ thuật nhân giống in vitro và thành tựu lai tạo giống Cymbidium thương mại thế giới.

Chương II. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc (ký hiệu từ DL01 đến DL24), các cặp mồi PCR (rbcL-F, rbcL-R, các mồi SSR), quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB, các bước giải trình tự ABI, quy phạm khảo nghiệm DUS, quy trình bố trí thí nghiệm nhân giống in vitro và lai hữu tính.

Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

1. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái

Dựa trên ma trận các tính trạng hình thái DUS của UPOV (kích thước bản lá, chiều dài lá, cấu trúc củ giả, số lượng hoa/ngồng, màu sắc cánh đài, cánh tràng và cánh môi), tập đoàn 24 mẫu giống được phân tích thành các nhóm di truyền rõ rệt, phản ánh sự biến dị phong phú của lan kiếm khu vực Đông Bắc.

2. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử (vùng gen rbcL)

• Khuếch đại PCR và giải trình tự: Cặp mồi rbcL-F/rbcL-R khuếch đại thành công một đoạn băng DNA đơn đặc hiệu ở kích thước khoảng 600–700 bp trên cả 24 mẫu giống.
• Thành phần nucleotide và hệ số tương đồng: Trình tự vùng gen rbcL của 24 mẫu giống được so sánh với các trình tự chuẩn trên NCBI bằng công cụ BLAST và phần mềm MEGA. Xác định các vị trí đột biến điểm, chuyển vị trí nucleotide đặc trưng giữa các loài.
• So sánh phân nhóm hình thái và phân tử: Luận án chỉ ra sự tương đồng cao giữa cây phân loại phân tử và phân loại hình thái, đồng thời làm rõ vị trí phân loại của một số mẫu giống đồng hình hoặc khó phân biệt ở giai đoạn sinh dưỡng.

Chỉ tiêu nghiên cứu	Kết quả chính từ phân tích vùng gen rbcL
Kích thước đoạn khuếch đại	Đồng nhất ở mức ~600–700 bp trên 24 mẫu giống
Độ tương đồng nucleotide	Dao động cao giữa các loài khác nhau, hỗ trợ phân tách các nhóm loài rõ ràng
Ứng dụng mã vạch phân tử	Thiết lập bộ dữ liệu trình tự chuẩn đối chiếu với ngân hàng gen quốc tế NCBI

3. Nghiên cứu nhân giống in vitro

• Lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense):
  • Môi trường thích hợp nhất cho hạt nảy mầm tạo protocorm: môi trường MS cơ bản.
  • Nhân nhanh chồi: Bổ sung cytokinin (BA cho hiệu quả tái sinh chồi cao sau 8 tuần), nồng độ sucrose tối ưu giúp chồi sinh trưởng khỏe mạnh.
  • Tái sinh rễ: Auxin NAA kết hợp than hoạt tính (THT) kích thích hình thành bộ rễ hoàn chỉnh, rễ mập, nhiều lông hút sau 8 tuần nuôi cấy.
• Lan kiếm Bạch ngọc (Cymbidium mastersii):
  • Tái sinh và nhân nhanh rễ in vitro: Môi trường MS bổ sung NAA kết hợp than hoạt tính sau 10 tuần.
  • Tái sinh chồi trực tiếp từ rễ: Sử dụng cytokinin (BA đơn lẻ hoặc kết hợp NAA) và điều chỉnh hàm lượng sucrose thích hợp sau 8 tuần nuôi cấy, tạo cây con hoàn chỉnh có khả năng xuất vườn.

4. Nghiên cứu lai tạo và nhận diện con lai F1

• Khả năng đậu quả của các tổ hợp lai: Đã thực hiện thụ phấn nhân tạo thành công giữa các cặp bố mẹ tuyển chọn có đặc điểm hoa và lá nổi bật:
  • Cặp 1: $\female$ DL19 (Kiếm lô hội) $\times$ $\male$ DL21 (Kiếm vàng).
  • Cặp 2: $\female$ DL17 (Mạc xuân) $\times$ $\male$ DL21 (Kiếm lô hội).
  • Cặp 3: $\female$ DL21 (Kiếm vàng) $\times$ $\male$ DL15 (Kiếm trắng).
• Sau 8 tháng thụ phấn, các quả lai phát triển bình thường, cho hạt lai có sức sống.
• Xác định marker nhận dạng con lai F1 bằng chỉ thị SSR:
  • Khảo sát các locus SSR đa hình giữa cây bố và cây mẹ.
  • Sử dụng mồi CS8 để nhận dạng con lai của cặp $\female$ DL21 $\times$ $\male$ DL15.
  • Sử dụng mồi CS7 để nhận diện con lai của cặp $\female$ DL19 $\times$ $\male$ DL21.
  • Sử dụng mồi CS11 để nhận dạng con lai của cặp $\female$ DL17 $\times$ $\male$ DL21.
  • Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các cá thể F1 mang đầy đủ các alen đặc trưng của cả cây bố và cây mẹ, xác nhận chính xác các cây lai thực sự ở giai đoạn cây mầm sớm.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Công trình đã đánh giá toàn diện đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại miền núi Đông Bắc Việt Nam bằng việc kết hợp đồng thời chỉ thị hình thái DUS và chỉ thị phân tử vùng gen lục lạp rbcL.
2. Cung cấp bộ dữ liệu trình tự nucleotide vùng gen rbcL của các mẫu giống lan kiếm Đông Bắc, xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng phục vụ công tác giám định, phân loại học và truy nguyên nguồn gốc nguồn gen.
3. Chứng minh khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ cơ quan rễ trong điều kiện in vitro ở loài lan kiếm Bạch ngọc (Cymbidium mastersii), bổ sung dẫn liệu khoa học mới cho sinh lý học nuôi cấy mô chi Cymbidium.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro hiệu quả cho 02 loài lan kiếm quý gồm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense) từ hạt và Bạch ngọc (Cymbidium mastersii) từ rễ, phục vụ công tác bảo tồn ex situ và cung ứng cây giống.
2. Thực hiện thành công các tổ hợp lai nhân tạo giữa các nguồn gen bản địa ưu tú, tạo lập quần thể cây lai F1 làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống hoa lan mới.
3. Xác định được 3 marker phân tử SSR chuyên biệt (CS7, CS8, CS11) giúp sàng lọc và khẳng định con lai F1 ngay ở giai đoạn cây con trong bình nuôi cấy, rút ngắn chu kỳ chọn giống.

Kiến nghị và đề xuất giải pháp

• Tiếp tục theo dõi, đánh giá sự sinh trưởng, phát triển và đặc tính nở hoa của quần thể con lai F1 ngoài vườn ươm khi đạt độ thành thục sinh sản.
• Mở rộng phạm vi ứng dụng các chỉ thị SSR và mã vạch DNA cho các loài lan kiếm khác tại các vùng sinh thái Nam Trung Bộ và Tây Nguyên.
• Ứng dụng quy trình nhân giống in vitro từ rễ và hạt vào các cơ sở sản xuất giống lâm nghiệp và nông nghiệp công nghệ cao để phục hồi quần thể tự nhiên.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Luận án mới chỉ tập trung trên tập đoàn 24 mẫu giống đại diện cho khu vực miền núi Đông Bắc; phân tích mã vạch phân tử giới hạn ở vùng gen lục lạp rbcL; quần thể con lai F1 mới dừng lại ở bước kiểm tra tính lai giai đoạn cây con in vitro và vườn ươm, chưa có số liệu nở hoa đầy đủ do chu kỳ sinh trưởng của lan kiếm kéo dài nhiều năm.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Khảo sát thêm các vùng gen nhân (ITS) và các vùng gen lục lạp khác (matK, trnL-F) để xây dựng cây phát sinh chủng loại chi tiết hơn.
  • Nuôi dưỡng và đánh giá kiểu hình hoa, độ bền hoa và tính chống chịu của các dòng lai F1 khi trưởng thành nhằm tuyển chọn giống thương mại mang bản quyền Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Luận án là tài liệu tham khảo trong chuyên ngành Di truyền và chọn giống cây trồng, Công nghệ sinh học thực vật và Lâm nghiệp; đặc biệt là phương pháp luận kết hợp chỉ thị hình thái DUS và chỉ thị phân tử trong đánh giá nguồn gen.
• Đối với các nhà chọn giống thực vật: Cung cấp thông tin thực nghiệm về tính tương hợp sinh sản giữa các loài lan kiếm, quy trình lai hữu tính và kỹ thuật ứng dụng mồi SSR (CS7, CS8, CS11) để phát hiện cây lai F1 sớm.
• Đối với các nhà quản lý và cơ sở bảo tồn đa dạng sinh học: Cung cấp dẫn liệu thực tế về thành phần loài lan kiếm vùng Đông Bắc, hỗ trợ xây dựng chiến lược bảo tồn in situ và ex situ cho các loài nguy cấp như Bạch ngọc, Bạch ngọc đuôi công, Kiếm lô hội.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tập đoàn mẫu giống lan kiếm trong luận án được thu thập từ những địa bàn nào?
Tập đoàn gồm 24 mẫu giống (ký hiệu DL01 đến DL24) được thu thập tại 11 tỉnh thuộc khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam, bao gồm: Bắc Giang, Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Giang, Lào Cai, Phú Thọ, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Yên Bái.

2. Luận án đã sử dụng chỉ thị phân tử nào để đánh giá đa dạng di truyền và định danh loài?
Luận án sử dụng kỹ thuật giải trình tự vùng gen lục lạp rbcL thông qua cặp mồi rbcL-F/rbcL-R, sau đó đối chiếu trình tự nucleotide với ngân hàng dữ liệu gen NCBI bằng công cụ BLAST và phân tích cây phát sinh bằng phần mềm MEGA.

3. Hai loài lan kiếm nào được hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro trong luận án và từ nguồn mẫu khởi đầu nào?
Hai loài được nghiên cứu vi nhân giống là:

• Lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense): sử dụng mẫu khởi đầu là hạt nảy mầm tạo protocorm trên môi trường MS.
• Lan kiếm Bạch ngọc (Cymbidium mastersii): sử dụng mẫu khởi đầu là rễ in vitro, tái sinh chồi trực tiếp từ mô rễ trên môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cytokinin và auxin.

4. Những cặp mồi SSR nào được xác định để nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm cho các tổ hợp lai?
Luận án đã xác định được 3 chỉ thị phân tử SSR gồm:

• Chỉ thị CS8 dùng để nhận dạng con lai F1 của cặp lai $\female$ DL21 (Kiếm vàng) $\times$ $\male$ DL15 (Kiếm trắng).
• Chỉ thị CS7 dùng để nhận dạng con lai F1 của cặp lai $\female$ DL19 (Kiếm lô hội) $\times$ $\male$ DL21 (Kiếm vàng).
• Chỉ thị CS11 dùng để nhận dạng con lai F1 của cặp lai $\female$ DL17 (Mạc xuân) $\times$ $\male$ DL21 (Kiếm lô hội).

---

Kết luận

Luận án của tiến sĩ Phạm Phương Thu đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu về đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam thông qua sự kết hợp giữa chỉ thị hình thái DUS và chỉ thị phân tử rbcL. Công trình đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro đối với 02 nguồn gen quý (Cymbidium wenshanense từ hạt và Cymbidium mastersii từ rễ), đồng thời thực hiện thành công các tổ hợp lai nhân tạo và xác định các marker SSR (CS7, CS8, CS11) nhận diện chính xác con lai F1 ở giai đoạn sớm. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ hiệu quả cho chiến lược bảo tồn và công tác chọn tạo giống lan kiếm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI. Giới thiệu chung về hoa lan.

Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm. Nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam. Giá trị, thực trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen lan kiếm. Tình hình nghiên cứu chi lan kiếm trên thế giới và Việt Nam.

Nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu nhân giống và lai tạo chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam. Các kết luận qua phân tích tổng quan .37 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái.

Kỹ thuật sinh học phân tử. Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm. Phương pháp nhân giống in vitro. Phần mềm xử lý số liệu.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu.57 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử.

Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng để nhận dạng các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu.

So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử. Đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có. Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense).

Kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii). Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam. Khảo sát và xác định xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR .130 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .136 Danh mục các công trình khoa học công bố liên quan đến luận án tiến sĩ .138 Tài liệu tham khảo .154 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải A Adenine ABI Applied Biosystems Incorporated Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài AFLP đoạn nhân bản) atpβ gene ATP synthase beta - subunit gene BA Benzyladenine Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm sắp gióng BLAST cột từng phần cơ bản) Bp Base pairs (Cặp bazơ) C Cytosine cpDNA Chloroplast DNA (DNA lục lạp); CT Công thức CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm) CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) Cym Cymbidium D Dendrobium Đ/c Đối chứng DL Địa lan DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic) DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide G Guanin vii GA3 Gibberellin (Hormone sinh trưởng thực vật) IAA Indole - 3 - acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) IBA Indole - 3 - butyric acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đoạn lặp trình tự đơn) ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Ln Likelihood LSD Least Significant Difference Test matK Maturase K (Gen maturase K Molecular Evolution Genetics Analysis (Phân tích di truyền tiến MEGA hóa phân tử) ML Maximum Likelihood mtDNA Mitochondrial DNA National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông NCBI tin Công nghệ sinh học Quốc gia) ndhF NADH dehydrogenase subunit F nDNA Nuclear DNA ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction ( Phản ứng chuỗi Polymerase) PIC Polymorphism Information Content ( Hệ số Thông tin đa hình) PLBs Protocorm like Bodies QTLs Quantitative trait locus Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu RAPD nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase RCB Randomized Completely Block (Khối Ngẫu nhiên đủ) rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều dài viii của các đoạn DNA) RNA Ribonucleic acid RNAse Ribonuclease SCARs Sequence - Characterized Amplified Region Sect Section SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) T Thymine Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA THT Than hoạt tính Tm Melting Temperature UV Ultraviolet V Voltex α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ΣDNA DNA tổng số ix DANH MỤC BẢNG TT Nội dung bảng Trang 2.

Các mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu. Các cặp mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR. Bảng đánh giá một số đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho lan kiếm của UPOV. Bảng mã hoá theo ma trận các tính trạng hình thái của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm.

Tỉ lệ phần trăm thành phần nucleotide của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu và các mẫu tham chiếu. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm với các mẫu tham chiếu. Một số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu và mẫu tham chiếu.

So sánh phân nhóm dựa vào hình thái và chỉ thị phân tử của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. So sánh ảnh hưởng của bốn môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công. So sánh ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần).

Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của 3 loại auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ của cây l an kiếm Bạch ngọc. Ảnh hưởng của NAA kết hợp THT đến khả năng nhân nhanh rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 10 tuần).

Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng tạo cây con lan kiếm Bạch ngọc từ rễ trong điều kiện in vitro ( sau 8 tuần). Một số đặc điểm hình thái hoa, lá của các mẫu giống dùng làm bố, mẹ tạo quần thể lai F1.

Tỷ lệ đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm vùng núi Đông Bắc .125 xi DANH MỤC HÌNH TT Nội dung hình Trang 3. Mặt hoa 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại vùng núi Đông Bắc. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 24 mẫu giống lan kiếm dựa trên chỉ thị hình thái. Kết quả PCR 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu với cặp mồi rbcL - F/rbcL - R; M: Marker 100bp ladder.

Sơ đồ hình cây của 24 mẫu giống lan kiếm và các mẫu giống tham chiếu. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 1 đến nucleotide số 70. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 210 đến nucleotide số 280. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 280 đến nucleotide số 350.

Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 350 đến nucleotide số 420. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 420 đến nucleotide số 490. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 490 đến nucleotide số 560. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 560 đến nucleotide số 620.

Hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công nảy mầm và phát triển trên môi trường MS. Ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần).

Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần). Một số hình ảnh kết quả lai tạo nguồn gen lan kiếm vùng núi Đông Bắc Việt Nam (sau 8 tháng thụ phấn) .