Tổng quan nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, với hàm lượng protein trong hạt từ 32% đến 52%, cung cấp nhiều amino acid thiết yếu như lysin, triptophan, metionin và leucin. Việt Nam hiện đứng thứ 3 thế giới về tiêu thụ sữa đậu tương với khoảng 613 triệu lít/năm, tuy nhiên diện tích gieo trồng đậu tương trong nước lại có xu hướng giảm, chỉ còn khoảng 53,3 nghìn ha năm 2018, trong khi năng suất bình quân đạt khoảng 1,52 tấn/ha, thấp hơn nhiều so với mức trung bình thế giới. Sản lượng đậu tương trong nước không đáp ứng đủ nhu cầu, buộc phải nhập khẩu hàng trăm nghìn tấn mỗi năm. Bên cạnh đó, biến đổi khí hậu với các hiện tượng hạn hán, nhiệt độ thấp ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng và năng suất cây đậu tương.

Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tạo ra các giống đậu tương có khả năng chịu hạn, chịu lạnh là hướng đi quan trọng. Gen CBF1 (C-repeat binding factor 1) được biết đến với vai trò điều hòa biểu hiện các gen chịu lạnh và stress phi sinh học, giúp cây tăng khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là chuyển gen CBF1 vào một số giống đậu tương phổ biến ở miền núi phía Bắc Việt Nam (DT22, Cọc chùm, Cúc Hà Bắc) và đánh giá biểu hiện gen trên cây chuyển gen bằng phương pháp PCR. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên trong năm 2020, nhằm góp phần phát triển giống đậu tương chịu stress, thích ứng với biến đổi khí hậu, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Gen CBF1 và cơ chế điều hòa stress phi sinh học: Gen CBF1 thuộc họ DREB A-1, mã hóa protein phiên mã có tên miền AP2, liên kết với yếu tố điều hòa DRE/CRT, kích hoạt biểu hiện các gen COR giúp tăng khả năng chịu lạnh và stress khác. Ba gen CBF1, CBF2, CBF3 phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi CBF4 liên quan đến chịu hạn. Sự biểu hiện quá mức của CBF1 còn làm chậm quá trình lão hóa lá và kéo dài tuổi thọ cây.

  • Công nghệ chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Vi khuẩn gram âm này có khả năng chuyển đoạn DNA ngoại lai (T-DNA) từ plasmid Ti vào genome thực vật. Vùng T-DNA được giới hạn bởi các trình tự biên LB và RB, và quá trình chuyển gen được hỗ trợ bởi các gen vùng Vir. Phương pháp này cho phép tạo dòng cây chuyển gen ổn định, khác biệt so với chọn giống truyền thống.

  • Khái niệm về stress phi sinh học và khả năng chịu hạn, chịu lạnh của đậu tương: Đậu tương là cây nhạy cảm với nhiệt độ thấp dưới 15°C và thiếu nước, ảnh hưởng đến nảy mầm, ra hoa, đậu quả và quang hợp. Khả năng chịu hạn của đậu tương mang tính đa gen, liên quan đến phát triển bộ rễ, thời gian sinh trưởng và đặc điểm trao đổi chất.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng ba giống đậu tương DT22, Cọc chùm và Cúc Hà Bắc, phổ biến ở miền núi phía Bắc Việt Nam. Vật liệu di truyền gồm vector chuyển gen pER10-pUBQ14:CBF1 và chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang gen CBF1.

  • Phương pháp biến nạp gen: Sử dụng phương pháp nửa hạt cải tiến (half-seed) để tạo mẫu cấy lá mầm, sau đó lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium trong dịch huyền phù 30 phút, đồng nuôi cấy trên môi trường CCM trong 5 ngày. Tiếp theo là các bước cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM, kéo dài chồi trên SEM và tạo rễ trên RM.

  • Chọn lọc và đánh giá: Sử dụng thuốc diệt cỏ Basta để chọn lọc cây chuyển gen kháng thuốc, đồng thời tách chiết DNA từ lá cây và phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen CBF1 và gen bar để xác định sự có mặt của gen chuyển.

  • Cỡ mẫu và timeline: Tổng cộng 1000 mẫu cho mỗi giống được biến nạp trong 10 lần thí nghiệm. Quá trình chuyển gen và chọn lọc kéo dài khoảng 8-10 tuần, từ khử trùng hạt đến cây chuyển gen trưởng thành trong nhà lưới.

  • Phân tích số liệu: Tỷ lệ mẫu sống sót, tỷ lệ tạo đa chồi, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc và hiệu suất chuyển gen được tính toán và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Hiệu quả biến nạp gen CBF1 ở ba giống đậu tương:

    • Giống Cúc Hà Bắc có tỷ lệ mẫu tạo đa chồi cao nhất, đạt 81,20%, so với Cọc chùm 71,12% và DT22 68,05%.
    • Tỷ lệ sống sót sau chọn lọc trên môi trường SIM2 và SEM lần lượt là 9,75% (Cúc Hà Bắc), 11,35% (Cọc chùm) và 9,34% (DT22).
    • Số cây chuyển gen T0 sống sót sau khi chuyển ra đất lần lượt là 11 (Cúc Hà Bắc), 9 (Cọc chùm) và 12 (DT22).

  2. Hiệu suất chuyển gen kháng thuốc Basta:

    • Tỷ lệ cây chuyển gen kháng thuốc sau phun Basta là 0,56% ở DT22, 0,48% ở Cọc chùm và tương tự khoảng 0,5% ở Cúc Hà Bắc.
    • Tổng cộng 5 cây DT22, 4 cây Cọc chùm và số cây tương tự ở Cúc Hà Bắc được xác nhận kháng thuốc, cho thấy gen CBF1 đã được chuyển thành công.

  3. Biểu hiện gen CBF1 được xác nhận bằng PCR:

    • Phân tích PCR cho thấy sự có mặt của gen CBF1 và gen bar trong các cây chuyển gen, khẳng định hiệu quả biến nạp gen qua vi khuẩn Agrobacterium.

  4. So sánh hiệu quả giữa các giống:

    • Giống Cúc Hà Bắc thể hiện khả năng tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh cao hơn, phù hợp cho ứng dụng chuyển gen.
    • Hiệu suất chuyển gen ở DT22 và Cọc chùm thấp hơn nhưng vẫn đạt mức chấp nhận được trong nghiên cứu chuyển gen thực vật.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp chuyển gen CBF1 qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng kỹ thuật nửa hạt cải tiến là hiệu quả với tỷ lệ tạo đa chồi và tái sinh cây chuyển gen đạt trên 60% ở các giống đậu tương nghiên cứu. Tỷ lệ cây chuyển gen kháng thuốc Basta tuy thấp (khoảng 0,5%) nhưng phù hợp với các nghiên cứu chuyển gen thực vật khác, do quá trình chọn lọc khắt khe và các yếu tố sinh học ảnh hưởng.

Hiệu quả chuyển gen cao nhất ở giống Cúc Hà Bắc có thể do đặc tính sinh học và khả năng tái sinh chồi tốt hơn, phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đây về chuyển gen đậu tương và các cây họ đậu khác, cho thấy vai trò quan trọng của giống vật liệu trong thành công chuyển gen.

Biểu hiện gen CBF1 được xác nhận bằng PCR khẳng định gen chuyển đã tích hợp vào genome cây chủ, mở ra cơ hội phát triển các giống đậu tương chịu lạnh và stress phi sinh học, góp phần nâng cao năng suất và ổn định sản xuất trong điều kiện biến đổi khí hậu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ tỷ lệ tạo đa chồi, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc và hiệu suất chuyển gen giữa các giống, giúp minh họa rõ ràng sự khác biệt và hiệu quả của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Mở rộng nghiên cứu chuyển gen CBF1 trên các giống đậu tương khác: Tăng cường khảo nghiệm trên nhiều giống để đánh giá khả năng thích nghi và hiệu quả biểu hiện gen, nhằm chọn lọc giống phù hợp nhất cho sản xuất đại trà.

  2. Ứng dụng kỹ thuật PCR và chọn lọc kháng thuốc trong quy trình nhân giống: Áp dụng quy trình chọn lọc chặt chẽ để đảm bảo dòng chuyển gen ổn định, nâng cao tỷ lệ thành công và chất lượng cây giống.

  3. Phát triển quy trình nhân giống và sản xuất cây giống chuyển gen quy mô lớn: Thiết lập quy trình nhân giống in vitro và chuyển cây ra đồng ruộng thử nghiệm, đánh giá khả năng chịu hạn, chịu lạnh và năng suất thực tế.

  4. Hợp tác với các cơ quan quản lý để xây dựng khung pháp lý và hướng dẫn sử dụng giống chuyển gen: Đảm bảo an toàn sinh học và tuân thủ các quy định hiện hành, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng giống chuyển gen trong sản xuất nông nghiệp.

  5. Theo dõi và đánh giá biểu hiện gen CBF1 trong các điều kiện môi trường khác nhau: Thực hiện các thử nghiệm đồng ruộng để đánh giá tính ổn định biểu hiện gen và ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng hạt đậu tương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và giảng viên công nghệ sinh học thực vật: Luận văn cung cấp phương pháp chuyển gen và đánh giá biểu hiện gen CBF1, là tài liệu tham khảo quý giá cho các nghiên cứu về cải tiến giống cây trồng chịu stress.

  2. Chuyên gia chọn tạo giống và kỹ thuật viên nông nghiệp: Thông tin về quy trình chuyển gen và chọn lọc cây chuyển gen giúp áp dụng kỹ thuật hiện đại trong công tác chọn tạo giống đậu tương có khả năng thích nghi với biến đổi khí hậu.

  3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng khung pháp lý, quy trình xét duyệt và quản lý giống cây trồng chuyển gen tại Việt Nam.

  4. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh giống cây trồng: Luận văn mở ra hướng phát triển sản phẩm giống đậu tương chuyển gen có giá trị kinh tế cao, đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước và xuất khẩu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao chọn gen CBF1 để chuyển vào đậu tương?
    Gen CBF1 có vai trò điều hòa các gen chịu lạnh và stress phi sinh học, giúp cây tăng khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi như nhiệt độ thấp và hạn hán, từ đó cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng.

  2. Phương pháp chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu là gì?
    Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid chứa gen CBF1 để biến nạp gen vào mô lá mầm đậu tương theo phương pháp nửa hạt cải tiến, kết hợp với các bước chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen.

  3. Hiệu suất chuyển gen đạt được trong nghiên cứu là bao nhiêu?
    Hiệu suất chuyển gen kháng thuốc Basta đạt khoảng 0,5% ở các giống đậu tương DT22, Cọc chùm và Cúc Hà Bắc, phù hợp với các nghiên cứu chuyển gen thực vật khác.

  4. Làm thế nào để xác định cây đã chuyển gen thành công?
    Cây chuyển gen được chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta và xác nhận sự có mặt của gen CBF1 bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu.

  5. Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu này là gì?
    Nghiên cứu mở ra hướng phát triển giống đậu tương chuyển gen chịu stress, giúp nâng cao năng suất, ổn định sản xuất trong điều kiện biến đổi khí hậu, đồng thời góp phần giảm nhập khẩu và phát triển nông nghiệp bền vững.

Kết luận

  • Đã thành công trong việc chuyển gen CBF1 vào ba giống đậu tương DT22, Cọc chùm và Cúc Hà Bắc bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens với tỷ lệ tạo đa chồi đạt trên 68%.
  • Tỷ lệ cây chuyển gen kháng thuốc Basta đạt khoảng 0,5%, được xác nhận bằng PCR, chứng minh gen CBF1 đã tích hợp vào genome cây chủ.
  • Giống Cúc Hà Bắc có hiệu quả tái sinh và chuyển gen cao nhất, phù hợp cho ứng dụng chuyển gen trong sản xuất.
  • Nghiên cứu góp phần phát triển giống đậu tương chịu lạnh, chịu hạn, thích ứng với biến đổi khí hậu, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.
  • Đề xuất mở rộng nghiên cứu, hoàn thiện quy trình nhân giống và hợp tác xây dựng khung pháp lý để ứng dụng rộng rãi giống chuyển gen trong nông nghiệp Việt Nam.

Hành động tiếp theo là triển khai thử nghiệm đồng ruộng, đánh giá biểu hiện gen và hiệu quả kinh tế của các dòng đậu tương chuyển gen, đồng thời phối hợp với các cơ quan quản lý để đưa giống chuyển gen vào sản xuất đại trà.