NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC TRẮNG CỦA CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) ĐƢỢC CHUYỂN GEN chi42

• Tác giả: Phùng Thị Bích Hỏa
• Người hướng dẫn: Nguyễn Hoàng Lộc
• Trường học: Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
• Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Bệnh Héo Rũ Gốc Mốc Trắng Của Cây Lạc (Arachis Hypogaea L.) Được Chuyển Gen chi42
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Huế

• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra và biện pháp phòng trừ
• 1.1.1. Cây lạc
• 1.1.2. Các bệnh do nấm gây ra ở cây lạc
• 1.1.3. Cơ chế kháng nấm bệnh của cây lạc
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh do S. rolfsii gây ra ở cây lạc trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Sự phân bố chitinase trong tự nhiên
• 1.2.1. Phân loại chitinase
• 1.2.2. Cơ chế phản ứng của chitinase
• 1.2.3. Tình hình nghiên cứu chitinase từ Trichoderma
• 1.3. Nâng cao khả năng kháng nấm của cây lạc bằng kỹ thuật chuyển gen
• 1.3.1. Hệ thống vector biến nạp gen thông qua A.
• 1.3.2. Promoter sử dụng trong chuyển gen thực vật
• 1.3.2.1. Tình hình nghiên cứu về promoter đặc hiệu rễ
• 1.3.3. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện
• 1.4. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả năng kháng nấm ở cây lạc
• 1.4.1. Hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen ở cây lạc
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu chuyển gen chitinase vào cây lạc nhằm nâng cao khả năng kháng nấm
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Nguyên liệu thực vật
• 2.1.2. Các vector, chủng vi khuẩn và vi nấm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro giống lạc L14
• 2.2.2. Tối ưu hóa trình tự gen chi42
• 2.2.3. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa
• 2.2.4. Xác định hoạt tính và đặc điểm của Ta-CHI42
• 2.2.5. Tạo dòng gen chitinase và promoter Asy trong vector biểu hiện thực vật
• 2.2.6. Chuyển gen chitinase bằng kỹ thuật thấm nhập
• 2.2.7. Biến nạp gen chitinase thông qua Agrobacterium
• 2.2.8. Nhận dạng và phân tích biểu hiện của gen chuyển
• 2.2.9. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật
• 2.2.10. Đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây lạc chuyển gen in vivo
• 2.2.11. Xử lý thống kê
• 2.2.12. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây lạc
• 3.1.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng đến khả năng nảy mầm in vitro của hạt lạc
• 3.1.2. Ảnh hưởng của phương thức nảy mầm
• 3.1.3. Khả năng tái sinh chồi từ các bộ phận khác nhau của cây lạc in vitro
• 3.1.4. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi in vitro từ trụ trên lá mầm
• 3.1.5. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi in vitro từ lá mầm
• 3.1.6. Ảnh hưởng của NAA và IBA lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro
• 3.2. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase ở chuột
• 3.2.1. Tổng hợp các gen chitinase
• 3.2.2. Tạo dòng các gen chitinase trong vector biểu hiện E. coli pQE30
• 3.2.3. Biểu hiện các gen chitinase trong E. coli
• 3.2.4. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng Ta-CHI42
• 3.2.5. Hoạt tính thủy phân chitin của Ta-CHI42
• 3.2.6. Đặc điểm của Ta-CHI42
• 3.2.7. Hoạt tính kháng nấm in vitro của Ta-CHI42
• 3.3. Thiết kế các cấu trúc biểu hiện chitinase ở thực vật
• 3.3.1. Tạo dòng gen chitinase vào vector pMYV719
• 3.3.2. Tạo dòng promoter pAsy trong vector pMYV719
• 3.3.3. Tạo dòng gen chitinase và promoter Asy vào vector pMYV719
• 3.3.4. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang gen chitinase
• 3.3.5. Biểu hiện tạm thời gen chitinase trong cây N. benthamiana
• 3.3.6. Hoạt tính thủy phân chitin của Ta-CHI42
• 3.3.7. Hoạt tính kháng nấm của enzyme Ta-CHI42 trong điều kiện in vitro
• 3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hiệu quả chuyển gen chitinase vào cây lạc qua trung gian A. tumefaciens

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Kháng Bệnh Lạc Chuyển Gen chi42

Nghiên cứu về khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng ở cây lạc (Arachis hypogaea L.) chuyển gen chi42 là một bước tiến quan trọng trong việc bảo vệ mùa màng. Lạc là cây trồng quan trọng, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, nhưng thường xuyên bị tấn công bởi các loại nấm bệnh, gây thiệt hại lớn về năng suất. Trong đó, bệnh thối rễ và thân do Sclerotium rolfsii gây ra là một trong những mối đe dọa lớn nhất. Các biện pháp phòng trừ hiện nay còn nhiều hạn chế. Việc tạo ra giống lạc có khả năng kháng bệnh là một giải pháp hiệu quả và bền vững. Nghiên cứu này tập trung vào việc chuyển gen chi42, một gen chitinase có hoạt tính mạnh, từ Trichoderma asperellum vào cây lạc, với mục tiêu tạo ra dòng lạc kháng bệnh cao.

1.1. Giới thiệu về cây lạc và tầm quan trọng kinh tế

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) có giá trị kinh tế cao, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và công nghiệp dầu. Ở Việt Nam, lạc là cây lấy dầu quan trọng, góp phần vào an ninh lương thực và thu nhập của người nông dân. Theo tài liệu, tại Thừa Thiên Huế, lạc là cây trồng quan trọng sau lúa, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với một số cây trồng khác.

1.2. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng và tác hại đến cây lạc

Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với cây lạc. Bệnh có phạm vi ký chủ rộng, lây lan nhanh và gây thiệt hại lớn đến năng suất. Nấm tấn công phần gốc và thân cây, làm cây bị héo rũ và chết. Theo nghiên cứu, năng suất lạc có thể giảm từ 10-80% do bệnh này.

II. Thách Thức Phòng Trừ Bệnh Hại Lạc và Giải Pháp Chuyển Gen

Việc phòng trừ bệnh hại lạc, đặc biệt là bệnh héo rũ gốc mốc trắng, gặp nhiều khó khăn do nấm Sclerotium rolfsii có phạm vi ký chủ rộng và khả năng tồn tại dai dẳng trong đất. Các biện pháp hóa học, sinh học hiện tại chưa mang lại hiệu quả cao và có thể gây ảnh hưởng đến môi trường. Giải pháp chuyển gen được xem là một hướng đi tiềm năng, tạo ra giống lạc có khả năng kháng bệnh một cách tự nhiên. Nghiên cứu này tập trung vào việc chuyển gen chi42, một gen chitinase, vào cây lạc để tăng cường khả năng kháng nấm, đồng thời giảm thiểu việc sử dụng các biện pháp phòng trừ hóa học.

2.1. Các biện pháp phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng hiện tại

Các biện pháp phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng hiện nay bao gồm sử dụng thuốc hóa học, vi sinh vật đối kháng và luân canh cây trồng. Tuy nhiên, các biện pháp này có nhiều hạn chế về hiệu quả, chi phí và tác động đến môi trường. Đặc biệt, nấm Sclerotium rolfsii có khả năng tạo ra hạch nấm, giúp chúng tồn tại lâu dài trong đất và gây khó khăn cho việc phòng trừ.

2.2. Ưu điểm của phương pháp tạo giống lạc kháng bệnh bằng công nghệ chuyển gen

Tạo giống lạc kháng bệnh bằng công nghệ chuyển gen mang lại nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. Giống lạc chuyển gen có khả năng kháng bệnh một cách tự nhiên, giảm thiểu sự phụ thuộc vào các biện pháp hóa học. Đồng thời, công nghệ chuyển gen cho phép tạo ra giống lạc có năng suất cao, chất lượng tốt và thân thiện với môi trường.

2.3. Giới thiệu về gen chi42 và vai trò trong kháng bệnh ở cây trồng

Gen chi42 là một gen chitinase có hoạt tính mạnh, được tìm thấy trong nhiều loài vi sinh vật, đặc biệt là các loài Trichoderma. Chitinase là enzyme có khả năng phân hủy chitin, một thành phần chính trong thành tế bào của nấm. Khi cây trồng được chuyển gen chitinase, chúng có khả năng kháng nấm cao hơn do enzyme này có thể tấn công và phá hủy tế bào nấm.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Chuyển Gen chi42 vào Cây Lạc L14

Nghiên cứu tập trung vào việc chuyển gen chi42 từ Trichoderma asperellum SH16 vào giống lạc L14, một giống lạc phổ biến ở Việt Nam. Quá trình chuyển gen được thực hiện thông qua trung gian Agrobacterium tumefaciens. Các thí nghiệm được tiến hành để tối ưu hóa quy trình tái sinh in vitro, thiết kế vector biểu hiện, biến nạp gen vào cây lạc và đánh giá khả năng kháng nấm của các dòng lạc chuyển gen. Các phương pháp sinh học phân tử, hóa sinh và sinh lý được sử dụng để xác định sự biểu hiện của gen chi42 và đánh giá hiệu quả kháng bệnh.

3.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro cho giống lạc L14

Việc hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro là bước quan trọng để chuyển gen vào cây lạc. Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy, bao gồm khử trùng hạt, phương pháp nảy mầm và môi trường tái sinh chồi từ các bộ phận khác nhau của cây lạc. Môi trường MS bổ sung BAP 4 mg/L và NAA 0,1 mg/L được xác định là thích hợp nhất để tái sinh chồi.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện và tối ưu hóa gen chi42

Vector biểu hiện chứa gen chi42 được thiết kế để đảm bảo gen có thể biểu hiện hiệu quả trong cây lạc. Quá trình tối ưu hóa gen chi42 được thực hiện để tăng cường khả năng biểu hiện của gen trong tế bào thực vật. Các promoter đặc hiệu rễ và promoter thường trực được sử dụng để điều khiển sự biểu hiện của gen.

3.3. Quy trình biến nạp gen chi42 vào cây lạc thông qua Agrobacterium tumefaciens

Việc biến nạp gen chi42 vào cây lạc được thực hiện thông qua Agrobacterium tumefaciens. Quy trình bao gồm tiền nuôi cấy mẫu, lây nhiễm vi khuẩn, đồng nuôi cấy và khử khuẩn. Các điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển gen đã được xác định để đảm bảo hiệu quả cao nhất.

IV. Kết Quả Dòng Lạc Chuyển Gen Kháng Bệnh Héo Rũ Gốc

Nghiên cứu đã tạo ra 16 dòng lạc L14 mang các gen Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2 có mức độ biểu hiện chitinase cao. Sự hiện diện của các gen chitinase đã làm tăng hoạt tính kháng nấm S. rolfsii của các dòng lạc chuyển gen trong cả điều kiện in vitro và in vivo. Các dòng lạc chuyển gen cho thấy khả năng kháng bệnh héo rũ gốc tốt hơn so với giống lạc đối chứng. Kết quả này chứng minh tiềm năng của việc sử dụng công nghệ chuyển gen để cải thiện khả năng kháng bệnh của cây lạc.

4.1. Đánh giá mức độ biểu hiện gen chitinase ở các dòng lạc chuyển gen

Mức độ biểu hiện gen chitinase ở các dòng lạc chuyển gen được đánh giá bằng các phương pháp sinh học phân tử, như Western blot. Kết quả cho thấy các dòng lạc chuyển gen có mức độ biểu hiện chitinase khác nhau, tùy thuộc vào loại gen chitinase được sử dụng và vị trí chuyển gen.

4.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của các dòng lạc chuyển gen in vitro

Hoạt tính kháng nấm của các dòng lạc chuyển gen được thử nghiệm in vitro bằng cách đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của nấm S. rolfsii. Kết quả cho thấy các dòng lạc chuyển gen có khả năng ức chế sự phát triển của nấm tốt hơn so với giống lạc đối chứng.

4.3. Đánh giá khả năng kháng bệnh héo rũ gốc của các dòng lạc chuyển gen in vivo

Khả năng kháng bệnh héo rũ gốc của các dòng lạc chuyển gen được đánh giá in vivo bằng cách trồng cây trong điều kiện nhiễm bệnh. Kết quả cho thấy các dòng lạc chuyển gen có khả năng sống sót và phát triển tốt hơn so với giống lạc đối chứng, cho thấy khả năng kháng bệnh cao.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Của Lạc Chuyển Gen trong Sản Xuất Bền Vững

Kết quả nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi của giống lạc chuyển gen chi42 trong sản xuất lạc bền vững. Việc sử dụng giống lạc kháng bệnh có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, bảo vệ môi trường và nâng cao năng suất, chất lượng lạc. Nghiên cứu này là cơ sở để tiếp tục phát triển và ứng dụng các giống lạc chuyển gen trong thực tiễn sản xuất nông nghiệp, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành trồng lạc.

5.1. Giảm thiểu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và bảo vệ môi trường

Việc sử dụng giống lạc kháng bệnh giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe của người nông dân và người tiêu dùng. Sản xuất lạc bền vững là mục tiêu quan trọng trong bối cảnh biến đổi khí hậu và yêu cầu ngày càng cao về an toàn thực phẩm.

5.2. Nâng cao năng suất và chất lượng lạc

Giống lạc kháng bệnh có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt hơn trong điều kiện nhiễm bệnh, từ đó giúp nâng cao năng suất và chất lượng lạc. Điều này góp phần tăng thu nhập cho người nông dân và đảm bảo nguồn cung lạc ổn định cho thị trường.

5.3. Triển vọng phát triển và ứng dụng các giống lạc chuyển gen trong tương lai

Nghiên cứu này là bước khởi đầu cho việc phát triển và ứng dụng các giống lạc chuyển gen trong tương lai. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá tính ổn định của gen, khả năng thích ứng của giống lạc chuyển gen với các điều kiện môi trường khác nhau và đánh giá rủi ro tiềm ẩn đối với môi trường và sức khỏe con người.

VI. Kết Luận Lạc Chuyển Gen chi42 Giải Pháp Tiềm Năng

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của việc chuyển gen chi42 vào cây lạc để tạo ra giống kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng. Các dòng lạc chuyển gen cho thấy khả năng kháng nấm cao và tiềm năng ứng dụng trong sản xuất lạc bền vững. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá đầy đủ về tính ổn định, an toàn và hiệu quả kinh tế của giống lạc chuyển gen trước khi đưa vào sản xuất đại trà. Đây là một hướng đi đầy hứa hẹn để giải quyết vấn đề bệnh hại lạc và nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp.

6.1. Tóm tắt các kết quả chính của nghiên cứu

Nghiên cứu đã thành công trong việc chuyển gen chi42 vào cây lạc L14 và tạo ra các dòng lạc chuyển gen có khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng. Các dòng lạc chuyển gen cho thấy mức độ biểu hiện gen chitinase cao và hoạt tính kháng nấm tốt trong cả điều kiện in vitro và in vivo.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và khuyến nghị

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá tính ổn định của gen, khả năng thích ứng của giống lạc chuyển gen với các điều kiện môi trường khác nhau và đánh giá rủi ro tiềm ẩn đối với môi trường và sức khỏe con người. Đồng thời, cần có các nghiên cứu về hiệu quả kinh tế của việc sử dụng giống lạc chuyển gen trong sản xuất.