Nghiên Cứu Chuyển Gen Mã Hóa Protein Bề Mặt Của Virus H5N1 Vào Cây Đậu Tương

Chuyên khảo phân tích Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virut h5n1 vào cây đậu tương, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu

• Tác giả: Nguyễn Thu Hiền
• Người hướng dẫn: GS.TS Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chuyển Gen Virus H5N1 Vào Cây Đậu Tương Để Sản Xuất Vaccine Thực Vật
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 0.2. Nội dung nghiên cứu
• 0.3. Những đóng góp mới của luận án
• 0.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1
• 1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1
• 1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1
• 1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
• 1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
• 1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT
• 1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương
• 1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu tương
• 1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu thực vật
• 2.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen
• 2.3.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in vitro
• 2.3.3. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
• 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1
• 3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA
• 3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1
• 3.2. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN A.TUMEFACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
• 3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương ĐT1 và DT84
• 3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn
• 3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương
• 3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
• 3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0
• 3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1
• KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
• CÁC CÔNG BỐ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chuyển Gen Virus H5N1 Vào Đậu Tương

Nghiên cứu chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương để sản xuất vaccine thực vật là một hướng đi đầy hứa hẹn trong việc phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm. Bệnh cúm gia cầm, đặc biệt là chủng virus H5N1, gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế và sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Các biện pháp phòng chống dịch hiện tại còn nhiều hạn chế, do đó việc phát triển các loại vaccine mới, hiệu quả và dễ tiếp cận là vô cùng cần thiết. Vaccine thực vật nổi lên như một giải pháp tiềm năng, với ưu điểm về chi phí, khả năng sản xuất quy mô lớn, và tính an toàn. Đề tài nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra cây đậu tương biến đổi gen, có khả năng biểu hiện các kháng nguyên H5N1 và sản xuất vaccine trong hạt. Thành công của nghiên cứu này sẽ góp phần quan trọng vào việc phát triển một loại vaccine ăn được, dễ dàng sử dụng và phân phối, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. "Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực ph m chính cho vật nuôi và con người."

1.1. Tại Sao Nghiên Cứu Vaccine Thực Vật Từ Đậu Tương Lại Quan Trọng

Nghiên cứu vaccine thực vật từ đậu tương có ý nghĩa quan trọng vì nhiều lý do. Thứ nhất, đậu tương là một loại cây trồng phổ biến, dễ trồng và có năng suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất vaccine trên quy mô lớn. Thứ hai, vaccine thực vật có chi phí sản xuất thấp hơn so với các loại vaccine truyền thống, giúp giảm gánh nặng chi phí cho hệ thống y tế. Thứ ba, vaccine ăn được từ đậu tương có thể được sử dụng trực tiếp, không cần đến các phương pháp tiêm chủng phức tạp, đặc biệt phù hợp với các vùng sâu vùng xa, nơi điều kiện y tế còn hạn chế. Cuối cùng, việc chuyển gen thành công vào cây đậu tương mở ra cơ hội cho việc phát triển các loại vaccine chống lại các bệnh khác, không chỉ cúm gia cầm.

1.2. Tổng Quan Về Virus H5N1 và Nhu Cầu Vaccine Hiệu Quả

Virus H5N1 là một chủng virus cúm A nguy hiểm, có khả năng gây bệnh và tử vong cao ở cả gia cầm và người. Dịch cúm gia cầm H5N1 đã gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Các loại vaccine hiện tại có nhiều hạn chế về hiệu quả, tính an toàn, và khả năng đáp ứng với các biến chủng mới của virus. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các loại vaccine mới, có khả năng phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả bệnh cúm gia cầm, là một nhu cầu cấp thiết. Vaccine thực vật, với khả năng tạo ra các kháng nguyên đặc hiệu cho virus H5N1 trong cây đậu tương, là một hướng đi đầy tiềm năng để giải quyết vấn đề này.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất Vaccine H5N1 Từ Đậu Tương Biến Đổi Gen

Việc sản xuất vaccine H5N1 từ cây đậu tương biến đổi gen đối mặt với nhiều thách thức. Thứ nhất, cần phải đảm bảo rằng gen mã hóa protein H5N1 được biểu hiện một cách hiệu quả trong cây đậu tương, tạo ra đủ lượng kháng nguyên để kích thích phản ứng miễn dịch. Thứ hai, cần phải kiểm soát được vị trí và thời điểm biểu hiện gen, để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vaccine. Thứ ba, cần phải tối ưu hóa quy trình chuyển gen và chọn lọc cây đậu tương biến đổi gen để đảm bảo tính ổn định và di truyền của gen mong muốn. Cuối cùng, cần phải tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vaccine thực vật trên động vật và người. "Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi."

2.1. Vấn Đề Về Hiệu Quả Biểu Hiện Gen và Độ Ổn Định Của Gen Chuyển

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương là đảm bảo hiệu quả biểu hiện gen. Gen được chuyển cần phải được tích hợp vào hệ gen của cây đậu tương một cách ổn định và được biểu hiện ở mức độ đủ cao để tạo ra đủ lượng kháng nguyên H5N1 cần thiết. Các yếu tố như vị trí tích hợp gen, cấu trúc của gen, và các yếu tố biểu hiện gen của cây đậu tương đều có thể ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện gen. Ngoài ra, độ ổn định của gen được chuyển qua các thế hệ cây đậu tương cũng là một vấn đề cần được quan tâm để đảm bảo tính bền vững của quy trình sản xuất vaccine.

2.2. Đảm Bảo An Toàn và Tính Miễn Dịch Của Vaccine Thực Vật H5N1

Tính an toàn và hiệu quả miễn dịch là hai yếu tố quan trọng nhất trong việc phát triển bất kỳ loại vaccine nào. Đối với vaccine thực vật H5N1, cần phải đảm bảo rằng kháng nguyên H5N1 được tạo ra trong cây đậu tương không gây ra bất kỳ tác dụng phụ nào cho người sử dụng. Đồng thời, vaccine cần phải có khả năng kích thích hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống lại virus H5N1, giúp bảo vệ cơ thể khỏi bệnh cúm gia cầm. Các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng cần được tiến hành để đánh giá kỹ lưỡng tính an toàn và hiệu quả miễn dịch của vaccine thực vật.

III. Phương Pháp Chuyển Gen HA1 Virus H5N1 Vào Cây Đậu Tương Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đầu tiên, đoạn gen HA1 được thiết kế tối ưu cho biểu hiện gen ở thực vật, sau đó được đưa vào vector chuyển gen. Vector này chứa gen HA1 và các gen chọn lọc, như gen kháng kháng sinh. A. tumefaciens mang vector này được sử dụng để lây nhiễm vào mô cây đậu tương trong điều kiện in vitro. Các mô biến đổi gen được chọn lọc bằng kháng sinh và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Các cây chuyển gen được phân tích bằng PCR và Western blot để xác định sự có mặt và biểu hiện protein HA1. "Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển."

3.1. Thiết Kế Vector Chuyển Gen Chứa Đoạn Gen HA1 Tối Ưu

Việc thiết kế vector chuyển gen là một bước quan trọng trong quá trình chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương. Vector cần phải có khả năng mang đoạn gen HA1, các yếu tố điều hòa biểu hiện gen, và gen chọn lọc (ví dụ: gen kháng kháng sinh). Đoạn gen HA1 cần được tối ưu hóa mã hóa cho biểu hiện protein hiệu quả trong tế bào thực vật. Các yếu tố điều hòa biểu hiện gen cần được lựa chọn để đảm bảo gen HA1 được biểu hiện ở mức độ đủ cao và ở đúng vị trí (ví dụ: trong hạt đậu tương). Gen chọn lọc được sử dụng để giúp chọn lọc các tế bào thực vật đã được biến đổi gen thành công.

3.2. Quy Trình Lây Nhiễm Agrobacterium và Tái Sinh Cây Đậu Tương Chuyển Gen

Sau khi vector chuyển gen được tạo ra, nó được đưa vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Vi khuẩn này có khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật. A. tumefaciens mang vector chuyển gen được sử dụng để lây nhiễm vào mô cây đậu tương (ví dụ: lá mầm) trong điều kiện in vitro. Sau khi lây nhiễm, các mô cây đậu tương được nuôi cấy trên môi trường có chứa kháng sinh để chọn lọc các tế bào đã được biến đổi gen thành công. Các tế bào biến đổi gen được tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua quá trình nuôi cấy mô.

IV. Kết Quả Biểu Hiện Protein HA1 Virus H5N1 ở Hạt Đậu Tương Chuyển Gen

Kết quả nghiên cứu cho thấy protein HA1 của virus H5N1 đã được biểu hiện thành công trong hạt của cây đậu tương chuyển gen. Các phân tích PCR và Western blot xác nhận sự có mặt của gen HA1 và protein HA1 trong các dòng đậu tương chuyển gen. Mức độ biểu hiện protein HA1 khác nhau giữa các dòng, cho thấy ảnh hưởng của vị trí gen tích hợp và các yếu tố biểu hiện gen nội sinh của cây đậu tương. Kết quả này mở ra triển vọng cho việc sản xuất vaccine chống lại virus H5N1 từ đậu tương biến đổi gen. "Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11."

4.1. Xác Nhận Sự Biểu Hiện Gen HA1 Bằng Kỹ Thuật PCR và Western Blot

Để xác nhận sự biểu hiện gen HA1 trong cây đậu tương chuyển gen, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hai kỹ thuật chính: PCR và Western blot. PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) được sử dụng để phát hiện sự có mặt của đoạn gen HA1 trong hệ gen của cây đậu tương. Western blot được sử dụng để phát hiện sự có mặt của protein HA1 trong mô đậu tương. Kết quả của cả hai kỹ thuật này đều cho thấy sự có mặt của gen HA1 và protein HA1 trong các dòng đậu tương chuyển gen, chứng minh rằng gen HA1 đã được biểu hiện thành công.

4.2. Mức Độ Biểu Hiện Protein HA1 và Các Yếu Tố Ảnh Hưởng

Mức độ biểu hiện protein HA1 trong cây đậu tương chuyển gen có thể khác nhau giữa các dòng khác nhau. Điều này có thể do nhiều yếu tố, bao gồm vị trí mà gen HA1 được tích hợp vào hệ gen của cây đậu tương, các yếu tố biểu hiện gen nội sinh của cây đậu tương, và điều kiện môi trường. Việc tối ưu hóa các yếu tố này có thể giúp tăng cường mức độ biểu hiện protein HA1, từ đó tăng hiệu quả của vaccine thực vật.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Tiềm Năng Phát Triển Vaccine Ăn Được H5N1

Nghiên cứu này mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn và tiềm năng phát triển trong lĩnh vực vaccine thực vật. Đậu tương chuyển gen có thể được sử dụng để sản xuất vaccine chống lại virus H5N1, cung cấp một giải pháp hiệu quả và kinh tế để phòng ngừa bệnh cúm gia cầm. Vaccine ăn được từ đậu tương có thể được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành các sản ph m thực ph m, giúp đơn giản hóa quá trình tiêm chủng và tăng cường khả năng tiếp cận vaccine ở các vùng sâu vùng xa. Ngoài ra, công nghệ chuyển gen này có thể được áp dụng để phát triển các loại vaccine chống lại các bệnh khác, không chỉ cúm gia cầm. "Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt đậu tương ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine ăn được ở thực vật."

5.1. Thử Nghiệm Khả Năng Miễn Dịch Của Vaccine Đậu Tương Chuyển Gen

Bước tiếp theo sau khi biểu hiện protein HA1 thành công là tiến hành thử nghiệm khả năng miễn dịch của vaccine đậu tương chuyển gen trên động vật (ví dụ: gà). Các thử nghiệm này sẽ đánh giá khả năng của vaccine trong việc kích thích hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống lại virus H5N1, và bảo vệ cơ thể khỏi bệnh cúm gia cầm. Kết quả của các thử nghiệm này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về hiệu quả của vaccine và giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất vaccine.

5.2. Triển Vọng Sản Xuất Vaccine Ăn Được Quy Mô Lớn và Tiết Kiệm

Một trong những ưu điểm lớn nhất của vaccine thực vật là khả năng sản xuất quy mô lớn và tiết kiệm. Cây đậu tương là một loại cây trồng phổ biến, dễ trồng và có năng suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất vaccine trên quy mô lớn. Chi phí sản xuất vaccine từ đậu tương thấp hơn so với các loại vaccine truyền thống, giúp giảm gánh nặng chi phí cho hệ thống y tế. Vaccine ăn được từ đậu tương có thể được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành các sản ph m thực ph m, giúp đơn giản hóa quá trình tiêm chủng và tăng cường khả năng tiếp cận vaccine ở các vùng sâu vùng xa.

VI. Kết Luận Nghiên Cứu Mở Ra Hướng Đi Mới Cho Vaccine H5N1

Nghiên cứu chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương để sản xuất vaccine thực vật đã đạt được những kết quả quan trọng, mở ra một hướng đi mới trong việc phòng chống bệnh cúm gia cầm. Việc biểu hiện protein HA1 thành công trong hạt đậu tương chuyển gen chứng minh tính khả thi của phương pháp này. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa biểu hiện gen, đánh giá khả năng miễn dịch của vaccine, và phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn. Thành công của nghiên cứu này sẽ góp phần quan trọng vào việc phát triển một loại vaccine hiệu quả, kinh tế và dễ tiếp cận để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. "Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật."

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Nghiên Cứu Quan Trọng Đạt Được

Nghiên cứu đã thành công trong việc: (1) Thiết kế và xây dựng vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 của virus H5N1. (2) Chuyển gen HA1 vào cây đậu tương và tái sinh các cây chuyển gen. (3) Xác nhận sự biểu hiện protein HA1 trong hạt của cây đậu tương chuyển gen bằng kỹ thuật PCR và Western blot. (4) Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng cây đậu tương như một nền tảng để sản xuất vaccine H5N1.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: (1) Tối ưu hóa biểu hiện gen HA1 để tăng mức độ sản xuất protein. (2) Đánh giá khả năng miễn dịch của vaccine đậu tương chuyển gen trên động vật. (3) Phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn và thử nghiệm tính an toàn của vaccine trên người. (4) Áp dụng công nghệ chuyển gen này để phát triển các loại vaccine chống lại các bệnh khác. Tiềm năng ứng dụng của nghiên cứu này là rất lớn, có thể góp phần quan trọng vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu thiệt hại do bệnh cúm gia cầm gây ra.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38]. Đây là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus.

Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42]. Virus cúm A H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông 1996 và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên người và gây chết người bệnh [142].

Năm , virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên- miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 5, bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước 6 vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ ỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới WHO đến tháng 1 , đã có tới 6 trường hợp mắc cúm A H5N1, trong đó có 1 trường hợp đã tử vong, chiếm 59,65%.

Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong cao là các nước Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người đều có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực ph m chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mổ, vận chuyển, mua bán gia cầm. Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm A H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người. Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm , đã tái phát qua bốn đợt dịch.

Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tư gần đây nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm các loại, thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9]. Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao 59%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7]. Đặc tính của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các tia phóng xạ.

Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến ,9. Trong điều kiện quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng 7 thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100oC hoặc 30 phút ở 60oC, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và hàng năm ở -70 oC.

Trong phủ tạng gia cầm (40oC) tồn tại được 25- ngày, nhưng trong cơ thể người (37oC) chỉ sống được 7-8 ngày, còn ở nước 30oC tồn tại được 4 ngày [24] [26] [75]. Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 H16 , được tìm thấy năm 5 từ con mòng biển đầu đen. Trình tự H16 có độ tương đồng cao với H13 [25] [32].

Các phân type gây nhiễm cho hầu hết các loài sinh vật bao gồm loài người, các loài lông vũ gà, thủy cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải c u, cá voi. Chúng thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và người [140]. Do đặc tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lan truyền trong quần thể sinh vật, cúm A là nhóm virus nguy hiểm truyền bệnh từ động vật sang người .Virus A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất đối với các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua H9N2 trên lợn [77]. Về danh pháp, để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các chủng virus cúm sau khi phân lập phải được ký hiệu theo danh pháp quy định với trật tự như sau: tên serotype/loài bị nhiễm nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35][25].

Ví dụ: virus cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà chicken , nơi phân lập là Việt Nam, số 8 hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm 5, phân type là H5N1. Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: (1) loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc lực thấp LPAI - Low pathogenic avian influenza). Cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [30]. HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 1 số gia cầm bị nhiễm trong vòng 4 giờ sau nhiễm.

Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]. LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68] [155].

Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1 Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34]. Các phân đoạn 1, và là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase RNA transcriptase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể là: Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme P , là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus. P có khối lượng phân tử 87. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 6 ở protein P ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng với nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 4 oC, còn ở virus thích nghi trên người là Lys o - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng C) [7] [19] [63].

Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của P 1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis hiện tượng tế bào chết theo chương trình [38]. Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo thủ cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử là 96. PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [8]. Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein HA và NA bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, cụ thể như sau: Phân đoạn 4 gen HA có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A Gen HA mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2.

Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của protease và đây là vùng quyết định độc lực của virus [8]. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 6 .1 3 Da nếu không được glycosyl hóa) và 77.103 Da nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da và HA2 là 29. Phân đoạn 6 gen NA là một gen kháng nguyên của virus, có kích thước thay đổi theo từng chủng virus cúm A. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử là 5 - 60.

Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen hay phần tận cùng N của polypeptide NA có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau [ 10 93]. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 5 nucleotide, rồi sau đó là 6 nucleotide [42]. Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, cụ thể: Phân đoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein NP - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ.