Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu chuyển gen virus H5N1 vào đậu tương sản xuất vaccine thực vật

Nghiên cứu chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương để sản xuất vaccine thực vật là một hướng đi đầy hứa hẹn trong… 142 trang · Đại học Thái Nguyên · 2014.

• Tác giả: Nguyễn Thu Hiền
• Người hướng dẫn: GS.TS Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chuyển Gen Virus H5N1 Vào Cây Đậu Tương Để Sản Xuất Vaccine Thực Vật
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 0.2. Nội dung nghiên cứu
• 0.3. Những đóng góp mới của luận án
• 0.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1
• 1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1
• 1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1
• 1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
• 1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1
• 1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT
• 1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương
• 1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu tương
• 1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu thực vật
• 2.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen
• 2.3.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in vitro
• 2.3.3. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
• 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1
• 3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA
• 3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1
• 3.2. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN A.TUMEFACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
• 3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương ĐT1 và DT84
• 3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn
• 3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương
• 3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
• 3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0
• 3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1
• KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
• CÁC CÔNG BỐ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chuyển Gen Virus H5N1 Vào Đậu Tương

Nghiên cứu chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương để sản xuất vaccine thực vật là một hướng đi đầy hứa hẹn trong việc phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm. Bệnh cúm gia cầm, đặc biệt là chủng virus H5N1, gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế và sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Các biện pháp phòng chống dịch hiện tại còn nhiều hạn chế, do đó việc phát triển các loại vaccine mới, hiệu quả và dễ tiếp cận là vô cùng cần thiết. Vaccine thực vật nổi lên như một giải pháp tiềm năng, với ưu điểm về chi phí, khả năng sản xuất quy mô lớn, và tính an toàn. Đề tài nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra cây đậu tương biến đổi gen, có khả năng biểu hiện các kháng nguyên H5N1 và sản xuất vaccine trong hạt. Thành công của nghiên cứu này sẽ góp phần quan trọng vào việc phát triển một loại vaccine ăn được, dễ dàng sử dụng và phân phối, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. "Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực ph m chính cho vật nuôi và con người."

1.1. Tại Sao Nghiên Cứu Vaccine Thực Vật Từ Đậu Tương Lại Quan Trọng

Nghiên cứu vaccine thực vật từ đậu tương có ý nghĩa quan trọng vì nhiều lý do. Thứ nhất, đậu tương là một loại cây trồng phổ biến, dễ trồng và có năng suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất vaccine trên quy mô lớn. Thứ hai, vaccine thực vật có chi phí sản xuất thấp hơn so với các loại vaccine truyền thống, giúp giảm gánh nặng chi phí cho hệ thống y tế. Thứ ba, vaccine ăn được từ đậu tương có thể được sử dụng trực tiếp, không cần đến các phương pháp tiêm chủng phức tạp, đặc biệt phù hợp với các vùng sâu vùng xa, nơi điều kiện y tế còn hạn chế. Cuối cùng, việc chuyển gen thành công vào cây đậu tương mở ra cơ hội cho việc phát triển các loại vaccine chống lại các bệnh khác, không chỉ cúm gia cầm.

1.2. Tổng Quan Về Virus H5N1 và Nhu Cầu Vaccine Hiệu Quả

Virus H5N1 là một chủng virus cúm A nguy hiểm, có khả năng gây bệnh và tử vong cao ở cả gia cầm và người. Dịch cúm gia cầm H5N1 đã gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Các loại vaccine hiện tại có nhiều hạn chế về hiệu quả, tính an toàn, và khả năng đáp ứng với các biến chủng mới của virus. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các loại vaccine mới, có khả năng phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả bệnh cúm gia cầm, là một nhu cầu cấp thiết. Vaccine thực vật, với khả năng tạo ra các kháng nguyên đặc hiệu cho virus H5N1 trong cây đậu tương, là một hướng đi đầy tiềm năng để giải quyết vấn đề này.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất Vaccine H5N1 Từ Đậu Tương Biến Đổi Gen

Việc sản xuất vaccine H5N1 từ cây đậu tương biến đổi gen đối mặt với nhiều thách thức. Thứ nhất, cần phải đảm bảo rằng gen mã hóa protein H5N1 được biểu hiện một cách hiệu quả trong cây đậu tương, tạo ra đủ lượng kháng nguyên để kích thích phản ứng miễn dịch. Thứ hai, cần phải kiểm soát được vị trí và thời điểm biểu hiện gen, để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vaccine. Thứ ba, cần phải tối ưu hóa quy trình chuyển gen và chọn lọc cây đậu tương biến đổi gen để đảm bảo tính ổn định và di truyền của gen mong muốn. Cuối cùng, cần phải tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vaccine thực vật trên động vật và người. "Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi."

2.1. Vấn Đề Về Hiệu Quả Biểu Hiện Gen và Độ Ổn Định Của Gen Chuyển

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương là đảm bảo hiệu quả biểu hiện gen. Gen được chuyển cần phải được tích hợp vào hệ gen của cây đậu tương một cách ổn định và được biểu hiện ở mức độ đủ cao để tạo ra đủ lượng kháng nguyên H5N1 cần thiết. Các yếu tố như vị trí tích hợp gen, cấu trúc của gen, và các yếu tố biểu hiện gen của cây đậu tương đều có thể ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện gen. Ngoài ra, độ ổn định của gen được chuyển qua các thế hệ cây đậu tương cũng là một vấn đề cần được quan tâm để đảm bảo tính bền vững của quy trình sản xuất vaccine.

2.2. Đảm Bảo An Toàn và Tính Miễn Dịch Của Vaccine Thực Vật H5N1

Tính an toàn và hiệu quả miễn dịch là hai yếu tố quan trọng nhất trong việc phát triển bất kỳ loại vaccine nào. Đối với vaccine thực vật H5N1, cần phải đảm bảo rằng kháng nguyên H5N1 được tạo ra trong cây đậu tương không gây ra bất kỳ tác dụng phụ nào cho người sử dụng. Đồng thời, vaccine cần phải có khả năng kích thích hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống lại virus H5N1, giúp bảo vệ cơ thể khỏi bệnh cúm gia cầm. Các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng cần được tiến hành để đánh giá kỹ lưỡng tính an toàn và hiệu quả miễn dịch của vaccine thực vật.

III. Phương Pháp Chuyển Gen HA1 Virus H5N1 Vào Cây Đậu Tương Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đầu tiên, đoạn gen HA1 được thiết kế tối ưu cho biểu hiện gen ở thực vật, sau đó được đưa vào vector chuyển gen. Vector này chứa gen HA1 và các gen chọn lọc, như gen kháng kháng sinh. A. tumefaciens mang vector này được sử dụng để lây nhiễm vào mô cây đậu tương trong điều kiện in vitro. Các mô biến đổi gen được chọn lọc bằng kháng sinh và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Các cây chuyển gen được phân tích bằng PCR và Western blot để xác định sự có mặt và biểu hiện protein HA1. "Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển."

3.1. Thiết Kế Vector Chuyển Gen Chứa Đoạn Gen HA1 Tối Ưu

Việc thiết kế vector chuyển gen là một bước quan trọng trong quá trình chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương. Vector cần phải có khả năng mang đoạn gen HA1, các yếu tố điều hòa biểu hiện gen, và gen chọn lọc (ví dụ: gen kháng kháng sinh). Đoạn gen HA1 cần được tối ưu hóa mã hóa cho biểu hiện protein hiệu quả trong tế bào thực vật. Các yếu tố điều hòa biểu hiện gen cần được lựa chọn để đảm bảo gen HA1 được biểu hiện ở mức độ đủ cao và ở đúng vị trí (ví dụ: trong hạt đậu tương). Gen chọn lọc được sử dụng để giúp chọn lọc các tế bào thực vật đã được biến đổi gen thành công.

3.2. Quy Trình Lây Nhiễm Agrobacterium và Tái Sinh Cây Đậu Tương Chuyển Gen

Sau khi vector chuyển gen được tạo ra, nó được đưa vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Vi khuẩn này có khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật. A. tumefaciens mang vector chuyển gen được sử dụng để lây nhiễm vào mô cây đậu tương (ví dụ: lá mầm) trong điều kiện in vitro. Sau khi lây nhiễm, các mô cây đậu tương được nuôi cấy trên môi trường có chứa kháng sinh để chọn lọc các tế bào đã được biến đổi gen thành công. Các tế bào biến đổi gen được tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua quá trình nuôi cấy mô.

IV. Kết Quả Biểu Hiện Protein HA1 Virus H5N1 ở Hạt Đậu Tương Chuyển Gen

Kết quả nghiên cứu cho thấy protein HA1 của virus H5N1 đã được biểu hiện thành công trong hạt của cây đậu tương chuyển gen. Các phân tích PCR và Western blot xác nhận sự có mặt của gen HA1 và protein HA1 trong các dòng đậu tương chuyển gen. Mức độ biểu hiện protein HA1 khác nhau giữa các dòng, cho thấy ảnh hưởng của vị trí gen tích hợp và các yếu tố biểu hiện gen nội sinh của cây đậu tương. Kết quả này mở ra triển vọng cho việc sản xuất vaccine chống lại virus H5N1 từ đậu tương biến đổi gen. "Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11."

4.1. Xác Nhận Sự Biểu Hiện Gen HA1 Bằng Kỹ Thuật PCR và Western Blot

Để xác nhận sự biểu hiện gen HA1 trong cây đậu tương chuyển gen, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hai kỹ thuật chính: PCR và Western blot. PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) được sử dụng để phát hiện sự có mặt của đoạn gen HA1 trong hệ gen của cây đậu tương. Western blot được sử dụng để phát hiện sự có mặt của protein HA1 trong mô đậu tương. Kết quả của cả hai kỹ thuật này đều cho thấy sự có mặt của gen HA1 và protein HA1 trong các dòng đậu tương chuyển gen, chứng minh rằng gen HA1 đã được biểu hiện thành công.

4.2. Mức Độ Biểu Hiện Protein HA1 và Các Yếu Tố Ảnh Hưởng

Mức độ biểu hiện protein HA1 trong cây đậu tương chuyển gen có thể khác nhau giữa các dòng khác nhau. Điều này có thể do nhiều yếu tố, bao gồm vị trí mà gen HA1 được tích hợp vào hệ gen của cây đậu tương, các yếu tố biểu hiện gen nội sinh của cây đậu tương, và điều kiện môi trường. Việc tối ưu hóa các yếu tố này có thể giúp tăng cường mức độ biểu hiện protein HA1, từ đó tăng hiệu quả của vaccine thực vật.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Tiềm Năng Phát Triển Vaccine Ăn Được H5N1

Nghiên cứu này mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn và tiềm năng phát triển trong lĩnh vực vaccine thực vật. Đậu tương chuyển gen có thể được sử dụng để sản xuất vaccine chống lại virus H5N1, cung cấp một giải pháp hiệu quả và kinh tế để phòng ngừa bệnh cúm gia cầm. Vaccine ăn được từ đậu tương có thể được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành các sản ph m thực ph m, giúp đơn giản hóa quá trình tiêm chủng và tăng cường khả năng tiếp cận vaccine ở các vùng sâu vùng xa. Ngoài ra, công nghệ chuyển gen này có thể được áp dụng để phát triển các loại vaccine chống lại các bệnh khác, không chỉ cúm gia cầm. "Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt đậu tương ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine ăn được ở thực vật."

5.1. Thử Nghiệm Khả Năng Miễn Dịch Của Vaccine Đậu Tương Chuyển Gen

Bước tiếp theo sau khi biểu hiện protein HA1 thành công là tiến hành thử nghiệm khả năng miễn dịch của vaccine đậu tương chuyển gen trên động vật (ví dụ: gà). Các thử nghiệm này sẽ đánh giá khả năng của vaccine trong việc kích thích hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống lại virus H5N1, và bảo vệ cơ thể khỏi bệnh cúm gia cầm. Kết quả của các thử nghiệm này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về hiệu quả của vaccine và giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất vaccine.

5.2. Triển Vọng Sản Xuất Vaccine Ăn Được Quy Mô Lớn và Tiết Kiệm

Một trong những ưu điểm lớn nhất của vaccine thực vật là khả năng sản xuất quy mô lớn và tiết kiệm. Cây đậu tương là một loại cây trồng phổ biến, dễ trồng và có năng suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất vaccine trên quy mô lớn. Chi phí sản xuất vaccine từ đậu tương thấp hơn so với các loại vaccine truyền thống, giúp giảm gánh nặng chi phí cho hệ thống y tế. Vaccine ăn được từ đậu tương có thể được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành các sản ph m thực ph m, giúp đơn giản hóa quá trình tiêm chủng và tăng cường khả năng tiếp cận vaccine ở các vùng sâu vùng xa.

VI. Kết Luận Nghiên Cứu Mở Ra Hướng Đi Mới Cho Vaccine H5N1

Nghiên cứu chuyển gen virus H5N1 vào cây đậu tương để sản xuất vaccine thực vật đã đạt được những kết quả quan trọng, mở ra một hướng đi mới trong việc phòng chống bệnh cúm gia cầm. Việc biểu hiện protein HA1 thành công trong hạt đậu tương chuyển gen chứng minh tính khả thi của phương pháp này. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa biểu hiện gen, đánh giá khả năng miễn dịch của vaccine, và phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn. Thành công của nghiên cứu này sẽ góp phần quan trọng vào việc phát triển một loại vaccine hiệu quả, kinh tế và dễ tiếp cận để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. "Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật."

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Nghiên Cứu Quan Trọng Đạt Được

Nghiên cứu đã thành công trong việc: (1) Thiết kế và xây dựng vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 của virus H5N1. (2) Chuyển gen HA1 vào cây đậu tương và tái sinh các cây chuyển gen. (3) Xác nhận sự biểu hiện protein HA1 trong hạt của cây đậu tương chuyển gen bằng kỹ thuật PCR và Western blot. (4) Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng cây đậu tương như một nền tảng để sản xuất vaccine H5N1.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: (1) Tối ưu hóa biểu hiện gen HA1 để tăng mức độ sản xuất protein. (2) Đánh giá khả năng miễn dịch của vaccine đậu tương chuyển gen trên động vật. (3) Phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn và thử nghiệm tính an toàn của vaccine trên người. (4) Áp dụng công nghệ chuyển gen này để phát triển các loại vaccine chống lại các bệnh khác. Tiềm năng ứng dụng của nghiên cứu này là rất lớn, có thể góp phần quan trọng vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu thiệt hại do bệnh cúm gia cầm gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 gây ra là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm ở gia cầm, có khả năng lây truyền sang người với tỷ lệ tử vong lên tới 59,65% theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Tại Việt Nam, các đợt dịch cúm A/H5N1 bùng phát đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và đe dọa sức khỏe cộng đồng. Do hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi và nguồn tàng trữ virus trong tự nhiên (chim di cư, thủy cầm) rất khó kiểm soát, việc sử dụng vaccine là biện pháp chủ động và thiết yếu nhất để ngăn chặn dịch bệnh.

Tuy nhiên, các loại vaccine truyền thống vô hoạt và vaccine tái tổ hợp sản xuất trên trứng phôi hoặc nuôi cấy tế bào có những hạn chế nhất định như giá thành cao, quy trình bảo quản nghiêm ngặt (cần dây chuyền lạnh) và nguy cơ an toàn sinh học. Hướng nghiên cứu sản xuất vaccine ăn được từ thực vật (plant edible vaccine) mở ra giải pháp thay thế với các ưu điểm: protein kháng nguyên được tích lũy trong các bộ phận ăn được của cây (lá, củ, hạt); được thành tế bào thực vật bao bọc giúp bảo vệ kháng nguyên không bị phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa; kích thích đồng thời hệ miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào; dễ dàng nhân rộng quy mô bằng cách mở rộng diện tích canh tác; an toàn và có chi phí sản xuất thấp. Đậu tương (Glycine max) là cây trồng có hàm lượng protein hạt cao và giá trị kinh tế lớn tại Việt Nam, là đối tượng thích hợp cho việc biểu hiện và tích lũy protein tái tổ hợp phục vụ mục đích y - dược học.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

1. Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1.
2. Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Hemagglutinin (HA) và tiểu phần HA1 của chủng virus cúm A/H5N1 (chủng phân lập A/Ck/Vietnam/HG4/2005); hai giống đậu tương thuần nông nghiệp của Việt Nam gồm ĐT1 và DT84; cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) làm sinh vật mô hình kiểm chứng; các chủng vi khuẩn Escherichia coli và Agrobacterium tumefaciens (chủng CV58).
• Phạm vi không gian: Các thí nghiệm sinh học phân tử, nuôi cấy mô và chuyển gen được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp (Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên).
• Phạm vi thời gian và thế hệ di truyền: Luận án thực hiện nghiên cứu, theo dõi và đánh giá sự tích hợp và biểu hiện của gen chuyển qua các thế hệ cây đậu tương T0, T1 và theo dõi ở thế hệ T2 (bảo vệ năm 2014).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến dịch tễ học, sinh học phân tử virus cúm A/H5N1, các công nghệ sản xuất vaccine và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật:

Về virus cúm A/H5N1 và kháng nguyên bề mặt: Hệ gen của virus cúm A gồm 8 phân đoạn RNA sợi đơn âm, mã hóa cho các protein chức năng và cấu trúc (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2). Kháng nguyên Hemagglutinin (HA) là một glycoprotein bề mặt dạng trimer, gồm hai chuỗi polypeptide HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. HA1 chứa vị trí liên kết với thụ thể acid sialic (Gal α-2,3 sialic acid) trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của vật chủ, đóng vai trò quyết định trong việc nhận biết tế bào đích và kích thích sinh kháng thể trung hòa virus.

Về công nghệ vaccine cúm và vaccine thực vật: Tác giả điểm lại các dạng vaccine vô hoạt truyền thống (đồng chủng, dị chủng) và các chủng virus vaccine chuẩn do WHO khuyến cáo như NIBRG-14 (tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược từ chủng PR8/34 và A/Vietnam/1194/2004). Đối với lĩnh vực vaccine thực vật, Curtiss và Cardineau (1990) là những người đầu tiên tạo cây thuốc lá chuyển gen sản xuất vaccine kháng Streptococcus mutans; Yusibov và cộng sự (2002) biểu hiện thành công kháng nguyên virus dại (chuỗi peptide G và N) trên rau chân vịt (spinach). Nhiều nghiên cứu quốc tế đã thử nghiệm biểu hiện kháng nguyên virus viêm gan B trong chuối, kháng nguyên SARS-CoV trên nhiều loài cây, và vaccine chống dị ứng phấn hoa từ lúa gạo.

Về kỹ thuật chuyển gen ở cây đậu tương: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens lây nhiễm vào vùng nách lá mầm (cotyledonary node) bị tổn thương của hạt chín được đánh giá là hiệu quả, khắc phục được nhược điểm tạo thể khảm của phương pháp bắn gen (Hinchee và cs., 1988). Các nghiên cứu của Zeng và cs., Olhoft và cs., Paz và cs. đã chứng minh việc bổ sung các hợp chất chống oxy hóa và chất khử (L-cysteine, dithiothreitol - DTT) cùng chất cảm ứng acetosyringone (AS) vào môi trường đồng nuôi cấy làm tăng đáng kể tần số biến nạp vào mô phân sinh nách lá mầm đậu tương.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định và giải quyết: Mặc dù kỹ thuật chuyển gen ở đậu tương đã có những bước tiến, việc nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H5N1 định hướng biểu hiện đặc hiệu trong hạt đậu tương tại Việt Nam chưa được thực hiện hoàn chỉnh. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống này bằng cách: thiết kế cấu trúc mang đoạn gen HA1 tối ưu hóa mã bộ ba cho thực vật, đặt dưới sự điều hòa của promoter đặc hiệu hạt phaseolin (pPhaso) kết hợp chuỗi tín hiệu và neo SLHEP, hoàn thiện quy trình tái sinh và chuyển gen cho giống đậu tương Việt Nam (ĐT1), tạo ra dòng cây chuyển gen biểu hiện thành công protein kháng nguyên HA1 trong hạt.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và công nghệ: Luận án dựa trên lý thuyết công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen gián tiếp vào thực vật nhờ plasmid Ti của Agrobacterium tumefaciens, và nguyên lý biểu hiện protein tái tổ hợp đặc hiệu mô bằng promoter chuyên biệt của hạt thực vật. Hệ thống Gateway cloning được ứng dụng để chuyển cấu trúc gen từ vector vào (entry vector) sang vector đích (destination vector).

Phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử và thiết kế vector:

• Tối ưu hóa mã bộ ba (codon optimization) cho đoạn gen HA và HA1 từ chủng cúm A/Ck/Vietnam/HG4/2005 nhằm tăng cường hiệu quả dịch mã trong tế bào thực vật (tạo gen HAop và HA1).
• Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu có gắn vị trí cắt của enzyme giới hạn: cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA và XhoI-HA1/HindIII-HA1.
• Kỹ thuật PCR nhân bản đoạn gen mục tiêu; cắt bằng enzyme giới hạn XhoI và HindIII; phản ứng nối ligation vào vector trung gian p201-SLHEP (chứa chuỗi dẫn truyền tín hiệu và peptide neo).
• Sử dụng phản ứng tái tổ hợp Gateway LR Clonase để chuyển cấu trúc sang vector đích pPhaso-dest, tạo vector biểu hiện pPhaso-SLEHP-HA và pPhaso-SLEHP-HA1 mang promoter phaseolin biểu hiện đặc hiệu trong hạt và gen chỉ thị kháng kanamycin (nptII).
• Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả nạp E. coli DH5α và A. tumefaciens CV58 bằng phương pháp xung điện hoặc sốc nhiệt.

Phương pháp nuôi cấy mô và chuyển gen in vitro:

• Khử trùng hạt đậu tương bằng khí clo (hỗn hợp NaClO và HCl) với các mốc thời gian khác nhau.
• Nuôi cấy hạt trên môi trường nảy mầm (GM). Tách cụm mô phân sinh nách lá mầm hạt sau nảy mầm, gây tổn thương cơ học bằng mũi dao vi phẫu.
• Lây nhiễm với dịch vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen có bổ sung acetosyringone (AS) 100-200 µM; đồng nuôi cấy trên môi trường CCM.
• Tái sinh cụm đa chồi trên môi trường SIM bổ sung 6-benzylaminopurine (BAP).
• Kéo dài chồi trên môi trường SEM bổ sung gibberellic acid (GA3) và indole-3-acetic acid (IAA).
• Kích thích ra rễ trên môi trường RM bổ sung indole-3-butyric acid (IBA).
• Chọn lọc chồi và cây chuyển gen bằng kháng sinh Kanamycin (nồng độ 50 - 100 mg/l) hoặc đối chứng với chất chọn lọc diệt cỏ.

Phương pháp phân tích cây chuyển gen:

• Nhuộm mô histochemical bằng dung dịch X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide) để đánh giá hoạt tính của enzyme β-Glucuronidase từ gen chỉ thị gus.
• Tách chiết DNA tổng số từ lá cây đậu tương các thế hệ T0, T1, T2 bằng phương pháp CTAB.
• Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt và di truyền của gen chuyển HA1 và gen nptII.
• Tách chiết protein tổng số từ hạt đậu tương chuyển gen thế hệ T1, phân tích định tính sự biểu hiện của protein kháng nguyên HA1 bằng kỹ thuật lai Western blot với kháng thể đặc hiệu.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật chi tiết ba mảng nội dung: (1) Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1, dịch tễ học, cơ chế xâm nhiễm qua thụ thể bề mặt và cấu trúc phân tử của 8 phân đoạn gen virus; cấu trúc và vai trò sinh học của hai kháng nguyên bề mặt HA và NA; (2) Các thế hệ vaccine phòng chống cúm A/H5N1, cơ chế miễn dịch niêm mạc và các thành tựu nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật trên thế giới; (3) Kỹ thuật chuyển gen ở cây đậu tương, so sánh phương pháp bắn gen và phương pháp sử dụng A. tumefaciens, cơ chế chuyển T-DNA của plasmid Ti, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả lây nhiễm mô nách lá mầm tổn thương và các nghiên cứu nâng cao chất lượng protein, acid amin trong hạt đậu tương.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực vật (hạt giống đậu tương ĐT1 và DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp), các chủng vi sinh vật (E. coli, A. tumefaciens CV58), các loại vector (p201-SLHEP, pPhaso-dest). Trình bày đầy đủ thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR, phản ứng cắt enzyme giới hạn, phản ứng Gateway LR, công thức các loại môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn (LB, YEP) và môi trường nuôi cấy mô thực vật (MS cơ bản, GM, SIM, SEM, RM). Quy trình chi tiết từ khâu tạo mô sẹo/tái sinh đa chồi, biến nạp vi khuẩn, nuôi cấy chọn lọc trên Kanamycin đến các kỹ thuật phân tích phân tử (nhuộm X-gluc, PCR, Western blot).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Nội dung kết quả được trình bày qua ba nhóm vấn đề thực nghiệm chính:

1. Thiết kế và kiểm tra các vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1

• Tác giả đã tối ưu hóa mã bộ ba của toàn bộ gen HA (chiều dài 1704 bp) và đoạn gen HA1 (chiều dài 1032 bp) có nguồn gốc từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 theo hệ thống mã tối ưu của thực vật.
• Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự nhận biết của enzyme XhoI và HindIII để nhân bản đoạn gen HAop và HA1.
• Ghép nối thành công đoạn gen vào vector p201-SLHEP mang chuỗi dẫn tín hiệu SLEHP, sau đó chuyển vị bằng phản ứng LR vào vector đích pPhaso-dest. Kết quả tạo được hai cấu trúc biểu hiện hoàn chỉnh: pPhaso-SLEHP-HA và pPhaso-SLEHP-HA1 dưới sự kiểm soát của promoter phaseolin đặc hiệu cho hạt và terminator kết thúc phiên mã.
• Biến nạp các vector tái tổ hợp vào chủng A. tumefaciens CV58; kiểm tra bằng PCR và enzyme cắt giới hạn khẳng định vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp chính xác.
• Biến nạp thử nghiệm trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) để kiểm chứng khả năng tích hợp và hoạt động của cấu trúc chuyển gen trước khi thực hiện trên đậu tương.

2. Hoàn thiện quy trình tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tương ĐT1 và DT84

• Khử trùng hạt: Xử lý hạt giống bằng khí clo trong thời gian từ 12 đến 16 giờ cho tỷ lệ nảy mầm sạch bệnh đạt cao nhất mà không làm suy giảm sức sống của phôi.
• Tái sinh đa chồi: Mô nách lá mầm được nuôi cấy trên môi trường SIM chứa BAP ở các nồng độ khác nhau. BAP ở nồng độ thích hợp kích thích hình thành cụm đa chồi với số lượng 4 - 6 chồi/cụm.
• Kéo dài chồi và tạo rễ: Môi trường SEM bổ sung phối hợp GA3 và IAA giúp chồi vươn dài đồng đều; chồi sau khi kéo dài đạt kích thước 2 - 3 cm được chuyển sang môi trường RM bổ sung IBA để tạo rễ hoàn chỉnh.
• Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus: Lây nhiễm A. tumefaciens mang gen gus vào nách lá mầm tổn thương của hai giống ĐT1 và DT84. Nhuộm mô với X-gluc cho thấy màu xanh đặc trưng ở mô phân sinh chồi và hạt chuyển gen.

Bảng tổng hợp hiệu suất chuyển gen gus và khả năng tái sinh ở hai giống đậu tương:

Chỉ tiêu theo dõi	Giống đậu tương ĐT1	Giống đậu tương DT84
Tỷ lệ mẫu nách lá mầm tạo cụm đa chồi (%)	85,3 - 92,1	78,6 - 84,5
Số chồi trung bình / mẫu nách lá mầm (chồi)	4,8 ± 0,3	3,9 ± 0,2
Tỷ lệ tạo rễ trên môi trường RM (%)	88,5	81,2
Tỷ lệ chồi sống sót trên môi trường Kanamycin (%)	14,2	11,5
Hiệu suất chuyển gen gus kiểm tra ở giai đoạn hạt (%)	6,8	4,6

Kết quả so sánh cho thấy giống đậu tương ĐT1 có khả năng tái sinh cụm chồi và hiệu suất tiếp nhận gen chuyển cao hơn giống DT84, do đó ĐT1 được lựa chọn làm vật liệu chính cho các thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen kháng nguyên HA1.

3. Chuyển cấu trúc gen HA1 vào giống đậu tương ĐT1 và phân tích các thế hệ chuyển gen

• Biến nạp cấu trúc pPhaso-SLEHP-HA1 vào mô phân sinh nách lá mầm giống ĐT1 thông qua A. tumefaciens CV58 với sự hỗ trợ của acetosyringone và gây tổn thương cơ học.
• Chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh Kanamycin thu được các cụm chồi kháng; kích thích kéo dài chồi, tạo rễ và đưa cây ra thích nghi trong nhà lưới.
• Thu được 8 dòng cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 sinh trưởng bình thường và tạo hạt.
• Phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu XhoI-HA1/HindIII-HA1 trên DNA tổng số tách từ lá của 8 dòng T0 cho thấy xuất hiện băng DNA đặc hiệu kích thước xấp xỉ 1032 bp tương ứng với kích thước của đoạn gen HA1.
• Thu hoạch hạt T0, gieo trồng để tạo thế hệ T1 và theo dõi thế hệ T2. Kết quả phân tích PCR ở thế hệ T1 và T2 xác nhận gen chuyển HA1 di truyền ổn định qua các thế hệ.
• Tách chiết protein tổng số từ hạt của các dòng đậu tương T1. Kết quả phân tích lai Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu đã phát hiện thấy băng tín hiệu protein tái tổ hợp HA1 ở dòng đậu tương H11, chứng minh đoạn gen HA1 được dịch mã và biểu hiện thành công trong hạt đậu tương.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học

1. Thiết kế thành công hai cấu trúc vector chuyển gen pPhaso-SLEHP-HA và pPhaso-SLEHP-HA1 mang gen mã hóa protein kháng nguyên bề mặt HA và tiểu phần HA1 của virus cúm A/H5N1 (chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005), mang promoter đặc hiệu hạt phaseolin và chuỗi tín hiệu SLHEP.
2. Xây dựng và hoàn thiện hệ thống chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens lây nhiễm vào nách lá mầm tổn thương cho giống đậu tương thuần ĐT1 của Việt Nam.
3. Xác định được sự tích hợp, di truyền ổn định của đoạn gen HA1 qua các thế hệ T0, T1, T2 và chứng minh sự biểu hiện của protein tái tổ hợp HA1 trong hạt đậu tương thế hệ T1 (dòng H11).

Đóng góp về mặt thực tiễn

1. Tạo được 8 dòng cây đậu tương T0 mang đoạn gen HA1 và dòng đậu tương chuyển gen H11 ở thế hệ T1 có khả năng tích lũy protein kháng nguyên HA1 trong hạt.
2. Cung cấp quy trình tái sinh và biến nạp gen hiệu quả cho giống đậu tương ĐT1, có thể ứng dụng để chuyển các gen chức năng khác nhằm cải thiện tính trạng nông sinh học hoặc sử dụng hạt đậu tương làm nhà máy sinh học sản xuất protein tái tổ hợp.
3. Kết quả biểu hiện protein HA1 trong hạt đậu tương là tiền đề thực tiễn quan trọng phục vụ các nghiên cứu tiếp theo về đánh giá đáp ứng miễn dịch của gia cầm đối với vaccine thực vật ăn được phòng chống cúm A/H5N1.

Kiến nghị của luận án

• Tiếp tục theo dõi tính ổn định di truyền của gen chuyển và mức độ tích lũy protein HA1 ở các thế hệ đậu tương tiếp theo (T2, T3).
• Tiến hành thử nghiệm cho gia cầm (gà, vịt) ăn hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 để đánh giá khả năng sinh kháng thể đặc hiệu và hiệu quả bảo hộ miễn dịch chống lại virus cúm A/H5N1.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Luận án mới tập trung nghiên cứu trên hai giống đậu tương (ĐT1 và DT84), trong đó quy trình chuyển cấu trúc mang gen kháng nguyên mới được hoàn thiện chi tiết trên giống ĐT1.
• Mức độ biểu hiện protein HA1 mới được phân tích định tính qua Western blot trên dòng H11 ở thế hệ T1, chưa có số liệu định lượng chi tiết (như phương pháp ELISA) về hàm lượng protein HA1 chiếm tỷ lệ bao nhiêu phần trăm trong tổng protein hạt.
• Nghiên cứu dừng lại ở phạm vi phòng thí nghiệm và nhà lưới; chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên động vật sống để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Đánh giá sự phân ly tính trạng và độ ổn định biểu hiện của gen chuyển HA1 ở các thế hệ T3, T4 trên quần thể lớn.
• Định lượng nồng độ protein tái tổ hợp HA1 tích lũy trong hạt đậu tương bằng kỹ thuật ELISA.
• Phối hợp với các đơn vị nghiên cứu thú y để tiến hành thử nghiệm miễn dịch đường tiêu hóa (cho ăn hạt đậu tương nghiền) trên gà thực nghiệm, xác định mức độ bảo hộ khi công thử thách với virus cúm A/H5N1 cường độc.

Giá trị tham khảo

Nghiên cứu của luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học, Nông nghiệp, Sinh học thực nghiệm và Thú y: Tham khảo quy trình thiết kế vector Gateway biểu hiện đặc hiệu hạt, phương pháp tối ưu hóa mã bộ ba cho thực vật, và kỹ thuật nuôi cấy mô tái sinh cây họ Đậu.
• Giảng viên và các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ tế bào và chuyển gen thực vật: Chương 2 và Chương 3 cung cấp quy trình chi tiết về khử trùng hạt, công thức môi trường dinh dưỡng (nồng độ BAP, GA3, IAA, IBA) và kỹ thuật gây tổn thương nách lá mầm để biến nạp A. tumefaciens.
• Các nhà nghiên cứu dược - sinh học và sản xuất vaccine thế hệ mới: Cung cấp tài liệu tham khảo về mô hình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp trong hạt thực vật (molecular farming) nhằm phát triển vaccine ăn được giá thành thấp cho ngành chăn nuôi.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lại chọn đoạn gen HA1 thay vì toàn bộ gen HA để biến nạp vào cây đậu tương tạo dòng cây biểu hiện ở thế hệ T1? Gen HA hoàn chỉnh mã hóa cho tiền chất protein gồm hai tiểu phần HA1 và HA2, trong đó vùng nối giữa HA1 và HA2 chứa các amino acid kiềm quyết định độc tính của virus cúm. Tiểu phần HA1 chứa toàn bộ các epitope kháng nguyên quan trọng nhất và vị trí gắn với thụ thể bề mặt tế bào vật chủ, có khả năng kích thích đáp ứng sinh kháng thể trung hòa mạnh mẽ. Việc sử dụng riêng đoạn gen HA1 (1032 bp) giúp giảm kích thước đoạn chèn, tăng hiệu quả biểu hiện và đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối khi sản xuất vaccine thực vật.

2. Promoter nào được sử dụng để điều khiển sự biểu hiện của gen HA1 trong vector pPhaso-SLEHP-HA1? Tác giả sử dụng promoter phaseolin (pPhaso) có nguồn gốc từ gen mã hóa protein dự trữ hạt đậu cô ve (Phaseolus vulgaris). Đây là promoter đặc hiệu mô hạt, chỉ hoạt động mạnh trong giai đoạn hạt phát triển và tích lũy chất dinh dưỡng, giúp protein kháng nguyên HA1 tập trung chủ yếu trong hạt đậu tương mà không làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng sinh dưỡng của thân, lá, rễ.

3. Hiệu suất chuyển gen gus ở hai giống đậu tương ĐT1 và DT84 khác nhau như thế nào? Kết quả kiểm tra ở giai đoạn hạt cho thấy giống ĐT1 đạt hiệu suất chuyển gen gus là 6,8%, trong khi giống DT84 đạt 4,6%. Khả năng tạo cụm đa chồi và tái sinh cây của giống ĐT1 (85,3 - 92,1%) cũng cao hơn so với DT84 (78,6 - 84,5%), cho thấy hiệu quả chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens phụ thuộc chặt chẽ vào kiểu gen của giống đậu tương.

4. Bằng chứng nào khẳng định gen HA1 đã tích hợp vào hệ gen đậu tương và biểu hiện protein ở thế hệ T1? Sự tích hợp và di truyền của gen được chứng minh bằng phản ứng PCR trên DNA tổng số của lá cây thế hệ T0 và T1 với cặp mồi đặc hiệu XhoI-HA1/HindIII-HA1, cho sản phẩm khuếch đại kích thước 1032 bp. Sự biểu hiện của protein được khẳng định qua kỹ thuật lai Western blot từ protein tổng số chiết xuất từ hạt đậu tương dòng H11 (thế hệ T1), cho thấy băng tín hiệu đặc hiệu tương ứng với kích thước phân tử của protein tái tổ hợp HA1 khi phản ứng với kháng thể chuyên biệt.

5. Các chất điều hòa sinh trưởng nào được sử dụng trong quy trình tái sinh đa chồi từ nách lá mầm đậu tương ĐT1? Quy trình nuôi cấy mô của luận án sử dụng: 6-benzylaminopurine (BAP) trong môi trường SIM để cảm ứng tạo cụm đa chồi từ mô nách lá mầm; phối hợp Gibberellic acid (GA3) và Indole-3-acetic acid (IAA) trong môi trường SEM để kích thích kéo dài chồi; và Indole-3-butyric acid (IBA) trong môi trường RM để kích thích tạo rễ hoàn chỉnh.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thu Hiền đã thiết kế thành công các vector biểu hiện mang gen HA và đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1 được tối ưu hóa cho thực vật dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu hạt phaseolin. Tác giả đã hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tái sinh đa chồi và chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens vào vùng nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương ĐT1. Nghiên cứu đã thu được 8 dòng đậu tương T0 mang đoạn gen chuyển, chứng minh sự di truyền ổn định qua các thế hệ T1, T2 và ghi nhận sự biểu hiện thành công của protein kháng nguyên HA1 trong hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11. Công trình cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn quan trọng cho việc ứng dụng cây đậu tương làm hệ thống sinh học sản xuất vaccine ăn được phòng chống dịch cúm A/H5N1.