Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc và đánh giá khả năng sản xuất vaccine

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo chủng virus prrs porcine reproductive and respiratory syndrome nhược độc và đánh giá, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Nguyễn Thị Nga
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ sinh học
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.2. Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
• 1.3. Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS
• 1.5. Bệnh tích PRRS
• 1.6. Tác nhân gây bệnh và con đường truyền lây PRRS
• 1.7. Cơ chế bệnh sinh
• 1.8. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.9. Nguồn gốc, phân loại virus PRRS
• 1.10. Cấu trúc, chức năng hệ gen virus PRRS
• 1.11. Đa dạng di truyền hệ gen virus PRRS
• 1.12. Các protein kháng nguyên quan trọng của virus PRRS
• 1.13. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm
• 1.14. Sức đề kháng của virus PRRS
• 1.15. Đặc điểm nuôi cấy virus PRRS
• 1.16. Nghiên cứu tạo vaccine PRRS
• 1.17. Các loại vaccine được nghiên cứu phòng PRRS
• 1.18. Một số nghiên cứu về vaccine PRRS ở Việt Nam
• 1.19. Nghiên cứu tạo vaccine nhược độc phòng PRRS
• 1.20. Giống gốc trong sản xuất vaccine
• 1.21. Yêu cầu của giống gốc
• 1.22. Một số phương pháp bảo quản giống gốc virus PRRS
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp mổ khám. Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
• 2.4. Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
• 2.5. Xử lý bệnh phẩm
• 2.6. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
• 2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 2.8. Phương pháp nhân virus PRRS
• 2.9. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 2.10. Phương pháp cấy truyền virus PRRS
• 2.11. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus
• 2.12. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng)
• 2.13. Phương pháp Realtime RT-PCR
• 2.14. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.15. Phương pháp RT-PCR. Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen
• 2.16. Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ
• 2.17. Phương pháp điện di
• 2.18. Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể
• 2.19. Phương pháp đếm tế bào Marc 145
• 2.20. Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.2. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.3. Khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm
• 3.4. Kết quả kiểm tra bệnh tích ở lợn thí nghiệm
• 3.5. Kiểm tra virus huyết ở lợn thí nghiệm
• 3.6. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.7. Kiểm tra đặc tính nhân lên của virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145
• 3.8. Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc 145
• 3.9. Đánh giá đặc tính nhân lên của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền trên tế bào Marc 145
• 3.10. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền
• 3.11. Kiểm tra độc lực của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80
• 3.12. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng virus Hanvet1.vn nhược độc và chủng 02HY cường độc
• 3.13. Khuếch đại các đoạn gen thuộc hệ gen virus PRRS
• 3.14. Tách dòng các đoạn gen khuếch đại
• 3.15. Kết quả giải mã, phân tích hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc
• 3.16. Phân tích so sánh gen chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và thế giới
• 3.17. Đánh giá đặc tính giống gốc chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc
• 3.18. Kiểm tra thuần khiết
• 3.19. Kết quả kiểm tra tính an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn
• 3.20. Khả năng kích thích sinh kháng thể của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc
• 3.21. Đánh giá đặc tính ổn định của giống gốc virus PRRS Hanvet1
• 3.22. Nghiên cứu điều kiện bảo quản giống gốc (Master seed)
• 3.23. Đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch ở lợn sau khi tiêm vaccine nhược độc được chế tạo từ giống gốc Hanvet1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Về nghiên cứu đánh giá độc lực chủng virus PRRS 02HY cường độc Việt Nam chọn làm chủng ứng viên để tạo virus giống gốc PRRS nhược độc
• 4.2. Về nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp trên môi trường tế bào Marc 145
• 4.3. Về đánh giá giống gốc Hanvet1.vn nhược độc sử dụng cho chế tạo vaccine PRRS
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PRRS và tình hình nghiên cứu

Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là tác nhân gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Virus PRRS được phát hiện lần đầu vào năm 1987 và hiện đã trở thành dịch địa phương ở nhiều quốc gia. Tại Việt Nam, từ năm 2007, virus PRRS đã bùng phát thành dịch, gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng. Nghiên cứu virus PRRS tập trung vào việc phân loại, cấu trúc gen, và cơ chế gây bệnh. Virus PRRS gây bệnh thông qua việc tấn công hệ thống miễn dịch của lợn, dẫn đến các triệu chứng như sảy thai, viêm phổi và suy hô hấp. Công nghệ vaccine hiện nay chủ yếu dựa trên việc sử dụng chủng virus nhược độc để tạo miễn dịch. Tuy nhiên, sự khác biệt di truyền giữa các chủng virus PRRS ở các vùng địa lý khác nhau làm giảm hiệu quả của vaccine nhập khẩu. Do đó, việc phát triển vaccine từ chủng virus PRRS bản địa là cần thiết.

1.1. Lịch sử và phân loại virus PRRS

Virus PRRS thuộc họ Arteriviridae, được chia thành hai genotype chính: Bắc Mỹ và Châu Âu. Sự khác biệt di truyền giữa hai genotype này lên đến 40%, dẫn đến sự đa dạng trong virus gây bệnh PRRS. Tại Việt Nam, virus PRRS thuộc genotype Châu Á, có đặc điểm di truyền và khả năng gây bệnh riêng biệt. Nghiên cứu virus PRRS đã chỉ ra rằng, sự đa dạng di truyền này ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của vaccine PRRS. Do đó, việc phân loại và nghiên cứu sâu về chủng virus PRRS là bước quan trọng trong phát triển vaccine.

1.2. Tình hình dịch bệnh PRRS tại Việt Nam

Từ năm 2007, virus PRRS đã gây ra nhiều đợt dịch tại Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc. Virus PRRS gây bệnh với các triệu chứng như sảy thai, viêm phổi và tỷ lệ tử vong cao ở lợn con. Nghiên cứu virus PRRS tại Việt Nam đã chỉ ra rằng, sự lưu hành của chủng virus PRRS địa phương là nguyên nhân chính gây ra dịch bệnh. Việc thiếu vaccine PRRS hiệu quả và giá thành cao của vaccine nhập khẩu đã làm tăng nhu cầu sản xuất vaccine từ chủng virus nhược độc bản địa.

II. Phương pháp nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc

Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc được thực hiện thông qua quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS cường độc trên tế bào Marc 145. Chủng virus PRRS 02HY được chọn làm ứng viên để tạo chủng virus nhược độc do đặc tính gây bệnh mạnh và khả năng nhân lên ổn định trên tế bào. Quá trình cấy truyền liên tiếp 80 đời đã làm giảm độc lực của virus PRRS, tạo ra chủng virus nhược độc Hanvet1.vn. Công nghệ sản xuất vaccine dựa trên chủng virus nhược độc này đã được đánh giá về tính an toàn, hiệu quả và khả năng kích thích miễn dịch.

2.1. Quá trình cấy truyền và tạo chủng nhược độc

Quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145 đã làm giảm độc lực của virus. Sau 80 đời cấy truyền, chủng virus nhược độc Hanvet1.vn được tạo ra, có hiệu giá virus đạt 106,63 TCID50. Chủng virus nhược độc này đáp ứng các tiêu chuẩn về tính an toàn và khả năng kích thích miễn dịch, phù hợp cho sản xuất vaccine PRRS.

2.2. Đánh giá đặc tính sinh học và phân tử

Chủng virus nhược độc Hanvet1.vn được đánh giá về đặc tính sinh học và phân tử. Kết quả giải trình tự gen cho thấy, chủng virus nhược độc có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin so với chủng virus cường độc ban đầu. Tuy nhiên, gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 không thay đổi, đảm bảo tính kháng nguyên của vaccine PRRS. Công nghệ vaccine dựa trên chủng virus nhược độc này đã được chứng minh là hiệu quả và an toàn.

III. Ứng dụng chủng virus nhược độc trong sản xuất vaccine

Chủng virus nhược độc Hanvet1.vn đã được ứng dụng trong sản xuất vaccine PRRS. Vaccine PRRS được tạo ra từ chủng virus nhược độc này đã được đánh giá về tính an toàn, hiệu quả và khả năng kích thích miễn dịch. Kết quả cho thấy, vaccine PRRS có hiệu giá kháng thể cao, đạt 1/4.305,389, và độ dài miễn dịch kéo dài đến 6 tháng. Ứng dụng công nghệ vaccine này đã mở ra triển vọng lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam.

3.1. Đánh giá hiệu quả của vaccine PRRS

Vaccine PRRS được sản xuất từ chủng virus nhược độc Hanvet1.vn đã được đánh giá về hiệu quả bảo hộ. Kết quả cho thấy, vaccine PRRS có khả năng kích thích miễn dịch mạnh, với hiệu giá kháng thể đạt 1/4.305,389. Ứng dụng vaccine này đã giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở lợn, đặc biệt là trong các đợt dịch PRRS.

3.2. Triển vọng phát triển vaccine PRRS tại Việt Nam

Việc sản xuất vaccine PRRS từ chủng virus nhược độc bản địa đã mở ra triển vọng lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam. Công nghệ sản xuất vaccine này không chỉ giảm chi phí mà còn tăng hiệu quả bảo hộ, phù hợp với đặc điểm di truyền của virus PRRS lưu hành tại Việt Nam. Phát triển vaccine từ chủng virus nhược độc là bước tiến quan trọng trong việc chủ động phòng chống dịch bệnh PRRS.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), thường được gọi là bệnh Tai xanh, do virus thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh được xếp vào danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn toàn cầu cũng như tại Việt Nam qua các đợt bùng phát dịch từ năm 2007 đến 2010 và các ổ dịch rải rác những năm tiếp theo.

Tại Việt Nam, phần lớn nguồn vaccine phòng bệnh PRRS phải nhập khẩu với chi phí cao và thiếu tính chủ động. Do virus PRRS có tính đa dạng di truyền và biến đổi kháng nguyên phức tạp giữa các khu vực địa lý (sự khác biệt toàn bộ hệ gen giữa hai dòng Bắc Mỹ và Châu Âu lên tới 40%, trong khi các chủng cùng nhóm cũng có thể sai khác đến 20%), các loại vaccine nhập ngoại thường không đạt hiệu quả bảo hộ tối ưu đối với các chủng virus thực địa đang lưu hành trong nước. Bên cạnh đó, vaccine vô hoạt không kích thích được kháng thể trung hòa và không ngăn chặn được hiện tượng virus huyết, còn vaccine thế hệ mới chưa hoàn thiện về mặt bảo hộ thực địa. Do đó, việc nghiên cứu làm giảm độc lực (nhược độc hóa) chủng virus PRRS cường độc phân lập tại thực địa Việt Nam bằng phương pháp cấy truyền liên tiếp trên tế bào dòng Marc-145 nhằm tạo nguồn giống gốc sản xuất vaccine nhược độc có tính tương đồng kháng nguyên cao là yêu cầu cấp thiết.

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (mã số 9 42 01 16) của tác giả Nguyễn Thị Nga, thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn của PGS. Đinh Duy Kháng và PGS. Tô Long Thành, tập trung giải quyết bài toán trên.

Mục tiêu nghiên cứu: Tạo được chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp nhược độc từ chủng virus cường độc gây bệnh trên lợn tại Việt Nam đạt các tiêu chuẩn làm giống cho chế tạo vaccine phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.

Nội dung nghiên cứu cụ thể:

1. Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học của 2 chủng virus PRRS cường độc thực địa là 02HY (phân lập tại Hưng Yên) và 05TB (phân lập tại Thái Bình) trên lợn và trên tế bào dòng Marc-145 để lựa chọn chủng ứng viên.
2. Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng phương pháp cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc-145; đánh giá sự biến đổi độc lực, đặc tính nhân lên và khả năng sinh kháng thể qua các đời cấy truyền.
3. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng nhược độc tạo thành (ký hiệu Hanvet1.vn) so với chủng cường độc ban đầu (02HY); phân tích giải trình tự toàn bộ hệ gen, xác định các đột biến nucleotide và axit amin; so sánh mức độ tương đồng gen ORF5 và protein GP5 với các chủng virus PRRS lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới.
4. Đánh giá các tiêu chuẩn giống gốc (Master seed) của chủng Hanvet1.vn nhược độc: kiểm tra tính vô trùng, tính thuần khiết, tính an toàn trên lợn qua 5 đời tiếp truyền liên tiếp, tính ổn định qua 10 đời cấy truyền in vitro; xác định các thông số nuôi cấy tối ưu, điều kiện bảo quản giống gốc, khả năng sinh miễn dịch và độ dài miễn dịch bảo hộ của vaccine chế tạo từ giống gốc.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng virus PRRS cường độc phân lập tại ổ dịch Việt Nam (02HY, 05TB), chủng virus PRRS nhược độc Hanvet1.vn, tế bào dòng Marc-145 và lợn thí nghiệm sạch bệnh.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực hiện tại Phòng Vi sinh phân tử (Viện Công nghệ sinh học), Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (Cục Thú y) và Trung tâm Nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm dược thú y Hanvet; dữ liệu phân tích dịch tễ và mẫu thực địa giai đoạn 2007–2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về virus PRRS và công nghệ sản xuất vaccine theo các trục nội dung chính:

• Lịch sử, phân loại và dịch tễ học: Bệnh được phát hiện lần đầu tại Bắc Mỹ năm 1987 (Benfield và cộng sự, 1987), sau đó lan sang châu Âu (1990–1992) và được OIE định danh chính thức vào năm 1992. Virus PRRS thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales (Collins và cộng sự, 1991; Dea và cộng sự, 1992). Virus được chia thành hai kiểu gen chính: Type 1 (dòng Châu Âu, đại diện là Lelystad Virus - LV) và Type 2 (dòng Bắc Mỹ, đại diện là VR-2332) (Murtaugh và cộng sự, 1995). Tại Việt Nam, dịch xuất hiện từ năm 1997 qua nhập khẩu lợn giống và bùng phát thành đại dịch từ năm 2007 do các biến chủng cường độc thuộc dòng Bắc Mỹ có quan hệ di truyền gần với chủng Trung Quốc (Tô Long Thành và cộng sự, 2008; Feng và cộng sự, 2008).
• Cấu trúc hệ gen và đặc tính kháng nguyên: Hệ gen virus là chuỗi đơn dương RNA dài khoảng 15 kb chứa các khung đọc mở từ ORF1a, ORF1b đến ORF7 (Nielsen và cộng sự, 1999; Snijder và Meulenberg, 1998). ORF1a và ORF1b mã hóa cho 14 protein phi cấu trúc (NSPs), trong đó NSP9 là RNA polymerase phụ thuộc RNA và NSP10 là helicase. Các khung đọc ORF2 đến ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc: GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, M và N (Wissink và cộng sự, 2004). Trong đó, glycoprotein GP5 (mã hóa bởi ORF5) chứa epitope trung hòa chính (axit amin 36–52) nhưng cũng bị bao bọc bởi hiện tượng glycosyl hóa (rào chắn N-glycan) làm chậm đáp ứng miễn dịch (Ostrowski, 2002; Lopez và cộng sự, 2004). Protein N kích thích sinh kháng thể sớm nhưng không có tác dụng trung hòa, thậm chí gây ra hiện tượng tăng cường bệnh phụ thuộc kháng thể (ADE) (Yoon và cộng sự, 1995; Mateu và cộng sự, 2003).
• Thực trạng nghiên cứu và phát triển vaccine: Các nghiên cứu về vaccine vô hoạt (Bassaganya-Riera và cộng sự, 2004; Zuckermann và cộng sự, 2007; Scortti và cộng sự, 2006) cho thấy loại vaccine này có tính an toàn cao nhưng đáp ứng miễn dịch yếu, không bảo hộ được lợn khi công cường độc. Vaccine thế hệ mới như DNA, tiểu phần tái tổ hợp GP5 trên thực vật, vector adenovirus hay giả dại (Charerntantanakul, 2012; Nguyễn Thị Minh Hằng và cộng sự, 2011) chưa mang lại hiệu quả bảo hộ đồng bộ. Đối với vaccine nhược độc, các nhà khoa học quốc tế đã nhược độc hóa virus qua cấy truyền trên tế bào Marc-145 với số đời khác nhau: Boehringer-Ingelheim cấy truyền 37 đời (Allende và cộng sự, 2000), Hipra cấy truyền 20 đời (Burch và cộng sự, 1999), Han và cộng sự (2009) cấy truyền 80 đời, Tian và cộng sự (2007) cấy truyền 112 đời, Leng và cộng sự (2012) cấy truyền chủng TJ qua 92 đời.
• Nghiên cứu vaccine PRRS tại Việt Nam: Các khảo nghiệm của Nguyễn Văn Cảm và cộng sự (2001), Nguyễn Đức Hiền (2012), Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (2010), Trần Xuân Hạnh và cộng sự (2014) chỉ ra rằng các vaccine nhập khẩu (BSL-PS100, Ingelvac PRRS MLV, Amervac PRRS, JXA1-R) có mức độ bảo hộ không đồng đều do khác biệt kháng nguyên so với virus thực địa. Nguyễn Thị Lan và cộng sự (2014, 2017) đã bước đầu nghiên cứu phân lập và tạo vaccine nhược độc từ chủng thực địa.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn: Chưa có công trình trong nước nào giải mã hoàn chỉnh toàn bộ hệ gen để chứng minh cơ chế đột biến phân tử trong quá trình nhược độc hóa chủng virus PRRS cường độc thực địa Việt Nam, đồng thời thực hiện đầy đủ các bước đánh giá tiêu chuẩn giống gốc (Master seed) phục vụ sản xuất vaccine công nghiệp theo các quy chuẩn kiểm định thú y.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sự thích nghi và suy giảm độc lực có định hướng của virus khi cấy truyền liên tục qua nhiều thế hệ trên tế bào dị vật chủ in vitro (dòng tế bào Marc-145), kết hợp với các tiêu chuẩn kiểm định giống gốc virus vaccine (Master Seed Virus - MSV) theo hướng dẫn của OIE và Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 8400-21: 2014).

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật / Công cụ sử dụng	Mục đích / Chỉ tiêu đánh giá
Virus học & Động vật học	- Mổ khám đại thể, làm tiêu bản vi thể nhuộm HE - Nuôi cấy tế bào dòng Marc-145 trong môi trường DMEM + FBS - Phương pháp Reed-Muench xác định $TCID_{50}$ - Phản ứng trung hòa virus cố định - huyết thanh pha loãng	- Đánh giá bệnh tích phổi, hạch lympho, tỷ lệ nuôi sống và tăng trọng của lợn - Đo lường hiệu giá virus và xây dựng đường cong sinh trưởng - Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa
Sinh học phân tử	- Thiết kế 15 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 15 đoạn gen phủ toàn bộ hệ gen - RT-PCR và Realtime RT-PCR (rRT-PCR) - Điện di gel agarose, cắt plasmid bằng enzyme hạn chế EcoRI - Tách dòng và giải trình tự gen Sanger - Phân tích đa dạng di truyền, lập cây phả hệ (Phylogenetic tree)	- Phát hiện virus huyết trong huyết thanh lợn thí nghiệm - Giải mã toàn bộ hệ gen chủng 02HY và Hanvet1.vn - Xác định 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin - So sánh mức độ tương đồng gen ORF5 và protein GP5 với 29 chủng tham chiếu
Huyết thanh học & Tế bào học	- Kỹ thuật miễn dịch gắn peroxidase (IPMA) - Kỹ thuật ELISA thương mại - Phương pháp đếm tế bào Marc-145	- Định lượng hiệu giá kháng thể dịch thể đặc hiệu kháng virus PRRS - Theo dõi biến động đáp ứng kháng thể theo thời gian
Kiểm định tiêu chuẩn giống gốc	- Kiểm tra vô trùng và thuần khiết trên môi trường vi sinh và PCR/RT-PCR đa mồi - Gây nhiễm liều cao trên lợn thí nghiệm - Tiếp truyền liên tục qua 5 đời lợn in vivo - Thử nghiệm điều kiện đông khô và bảo quản ở -80°C	- Xác nhận không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm, Mycoplasma và các virus khác (PCV2, CSFV, PRV) - Đánh giá tính an toàn, không gây sốt, không biểu hiện bệnh - Chứng minh tính ổn định, không có hiện tượng hồi phục độc lực - Xác định độ ổn định hiệu giá qua 24 tháng

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện lịch sử xuất hiện, tình hình dịch tễ của PRRS trên thế giới và tại Việt Nam từ năm 1987 đến năm 2020. Tác giả phân tích chi tiết cơ chế bệnh sinh của virus: xâm nhập qua đường hô hấp hoặc sinh sản, đích tấn công chính là đại thực bào phế nang lợn (PAM) và thụ thể CD163/sialoadhesin, gây suy giảm miễn dịch nghiêm trọng và mở đường cho các bệnh kế phát.

Chương 1 đi sâu vào cấu trúc 9 khung đọc mở (ORF1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6, 7) cùng chức năng của các protein phi cấu trúc (NSP1–NSP12) và protein cấu trúc (GP2–GP5, M, N). Tác giả so sánh ưu nhược điểm của 3 nhóm vaccine (vô hoạt, thế hệ mới, nhược độc), phân tích các nghiên cứu vaccine trong nước và quốc tế, từ đó xác lập cơ sở khoa học cho việc chọn lựa phương pháp cấy truyền nhược độc hóa trên tế bào Marc-145 và các tiêu chí kỹ thuật cần đạt đối với giống gốc (Master seed) sản xuất vaccine.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết đối tượng nghiên cứu gồm 2 chủng virus PRRS cường độc thực địa 02HY và 05TB, chủng nhược độc Hanvet1.vn, dòng tế bào Marc-145 và lợn thí nghiệm (khỏe mạnh, âm tính với PRRS, PCV2, CSFV).

Quy trình thực nghiệm được trình bày chuẩn hóa:

• Quy trình nuôi cấy và duy trì tế bào Marc-145 trên môi trường DMEM bổ sung huyết thanh thai bò (FBS).
• Kỹ thuật xác định hiệu giá virus bằng phương pháp tính $TCID_{50}$ theo Reed-Muench.
• Quy trình cấy truyền liên tiếp 80 đời (P1 đến P80) trên tế bào Marc-145.
• Thiết kế 15 cặp mồi đặc hiệu để giải mã toàn bộ hệ gen virus.
• Phương pháp kiểm tra an toàn in vivo, tiếp truyền 5 đời trên lợn để kiểm tra hiện tượng hồi độc.
• Phương pháp kiểm tra tạp nhiễm vi sinh vật và các virus gây bệnh khác bằng kỹ thuật RT-PCR/PCR chuyên biệt.
• Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch bằng IPMA, phản ứng trung hòa và thử thách công cường độc.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được qua 4 nhóm nội dung:

1. Đánh giá độc lực chủng 02HY và 05TB: Chủng 02HY thể hiện độc lực cao điển hình: gây sốt cao liên tục (40,5–41,5°C), lợn bỏ ăn, khó thở, ho, da đỏ ửng; giảm tăng trọng rõ rệt; gây bệnh tích nhục hóa phổi nặng và sưng hạch lympho; virus huyết xuất hiện từ ngày thứ 3 và kéo dài; thích ứng tốt trên tế bào Marc-145 với hiệu giá đạt $10^{6,63} TCID_{50}/ml$. Do đó, chủng 02HY được chọn làm ứng viên để nhược độc hóa.
2. Quá trình tạo chủng nhược độc qua 80 đời cấy truyền: Độc lực của chủng 02HY giảm dần qua các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70 và P80. Đến đời P80 (ký hiệu chủng Hanvet1.vn), virus không còn gây sốt, không gây triệu chứng lâm sàng hay bệnh tích đại thể/vi thể trên lợn thí nghiệm, không phát hiện virus huyết nhưng vẫn kích thích sinh kháng thể đặc hiệu ở mức cao.
3. Đặc tính sinh học phân tử của chủng Hanvet1.vn nhược độc: Đã giải mã toàn bộ hệ gen của chủng Hanvet1.vn (GenBank: KU842720) và chủng đối chứng cường độc 02HY (GenBank Submission: 2490633). So sánh hệ gen phát hiện 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin phân bố rải rác trên 7 gen và 7 protein tương ứng. Đáng chú ý, gen ORF5 mã hóa protein kháng nguyên GP5 giữ được mức độ tương đồng cao (94%–99%) so với 29 chủng virus PRRS lưu hành tại hơn 20 tỉnh thành của Việt Nam.
4. Đánh giá tiêu chuẩn giống gốc Hanvet1.vn:
   • Vô trùng và thuần khiết: Âm tính với vi khuẩn, nấm mốc, Mycoplasma và các virus tạp nhiễm (PCV2, CSFV, PRV).
   • Tính an toàn: Tiêm liều cao $10^5 TCID_{50}$ trên lợn không gây phản ứng phụ; tiếp truyền liên tục qua 5 đời lợn in vivo không xảy ra hiện tượng hồi độc lực.
   • Tính ổn định: Hiệu giá virus ổn định qua 10 đời cấy truyền in vitro (P1–P10) đạt trung bình $10^{6,5} TCID_{50}/ml$.
   • Điều kiện nuôi cấy tối ưu: Môi trường duy trì pH 7,2–7,4, liều gây nhiễm 0,1 MOI, thời điểm thu hoạch virus đạt đỉnh cao ở 72–96 giờ sau gây nhiễm.
   • Bảo quản: Đông khô và bảo quản ở -80°C ổn định hiệu giá trong 24 tháng.
   • Thử nghiệm vaccine: Vaccine nhược độc chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn bảo hộ 100% lợn thí nghiệm khi công cường độc bằng chủng 02HY; hiệu giá kháng thể IPMA đạt đỉnh 1/4.305,389 và độ dài miễn dịch bảo hộ kéo dài 6 tháng.

Chương 4: Bàn luận kết quả

Tác giả phân tích cơ sở phân tử của sự suy giảm độc lực: 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin trên hệ gen chủng Hanvet1.vn chịu trách nhiệm làm mất tính sinh bệnh trên lợn nhưng không làm thay đổi các vùng epitope trung hòa chủ chốt của protein GP5. Tác giả so sánh kết quả cấy truyền 80 đời của luận án với các công trình quốc tế (chủng VR-2332 qua 37 đời, chủng CH-1a qua 112 đời, chủng TJ qua 92 đời), khẳng định số đời cấy truyền P80 là phù hợp để đảm bảo an toàn tuyệt đối mà không làm mất tính sinh miễn dịch.

Chương này cũng phân tích tính ưu việt của vaccine sản xuất từ chủng thực địa nội địa nhờ độ tương đồng kháng nguyên đạt tới 99% so với các chủng PRRS lưu hành, khắc phục nhược điểm bảo hộ kém của các dòng vaccine nhập ngoại.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về khoa học và lý luận

• Đã phân lập, đánh giá độc lực và nhược độc hóa thành công chủng virus PRRS cường độc thực địa Việt Nam (02HY) qua 80 đời cấy truyền liên tiếp trên môi trường tế bào dòng Marc-145, tạo ra chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc.
• Cung cấp dữ liệu hệ gen hoàn chỉnh của chủng virus PRRS cường độc 02HY (GenBank Submission: 2490633) và chủng nhược độc Hanvet1.vn (GenBank: KU842720).
• Xác định được 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin xuất hiện trong quá trình thích ứng và suy giảm độc lực trên tế bào Marc-145, chứng minh gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 vẫn giữ được tính ổn định và bảo tồn epitope trung hòa.
• Chứng minh mức độ tương đồng di truyền và kháng nguyên cao (94%–99%) giữa chủng Hanvet1.vn với 29 chủng virus PRRS thực địa phân lập tại hơn 20 tỉnh thành của Việt Nam.

Đóng góp mới về thực tiễn

• Thiết lập thành công giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế về giống sản xuất vaccine: thuần khiết, an toàn, ổn định di truyền, không hồi độc qua 5 đời truyền trên lợn, hiệu giá ổn định đạt $10^{6,5} TCID_{50}/ml$.
• Xác lập quy trình công nghệ nuôi cấy tối ưu (liều nhiễm 0,1 MOI, pH 7,2–7,4, thời gian thu hoạch 72–96 giờ) và phương pháp bảo quản giống gốc (đông khô hoặc -80°C) ổn định trong 24 tháng.
• Chế tạo thành công vaccine PRRS nhược độc từ giống gốc Hanvet1.vn có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cao (hiệu giá kháng thể đạt 1/4.305,389), bảo hộ tốt trước thử thách công cường độc với thời gian miễn dịch kéo dài 6 tháng.

Kiến nghị của tác giả

• Đưa chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc vào sản xuất vaccine PRRS quy mô công nghiệp để chủ động nguồn vaccine nội địa thay thế hàng nhập khẩu.
• Tiếp tục duy trì giám sát dịch tễ học phân tử đối với các chủng virus PRRS lưu hành ngoài thực địa để kịp thời phát hiện các biến đổi kháng nguyên mới.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Luận án tập trung nghiên cứu trên chủng virus PRRS Type 2 (dòng Bắc Mỹ) phân lập tại miền Bắc Việt Nam (02HY), chưa tiến hành đánh giá hiệu lực bảo hộ chéo đối với các chủng virus thuộc Type 1 (dòng Châu Âu) nếu có xâm nhập. Thử nghiệm bảo hộ thực địa chủ yếu thực hiện trên đàn lợn thịt và lợn con, chưa mở rộng theo dõi đầy đủ trên đàn lợn nái mang thai qua nhiều chu kỳ sinh sản.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục đánh giá độ bền miễn dịch và hiệu quả bảo hộ của vaccine Hanvet1.vn trên đàn lợn nái chửa và lợn đực giống ở các quy mô chăn nuôi trang trại công nghiệp; nghiên cứu sâu hơn về chức năng cụ thể của từng đột biến trong 51 đột biến axit amin đối với cơ chế suy giảm độc lực của virus.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Vi sinh học, Hóa sinh học, Công nghệ sinh học và Thú y: Luận án là tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình nhược độc hóa virus in vitro, phương pháp giải trình tự và phân tích đột biến hệ gen hoàn chỉnh của virus RNA, cũng như kỹ thuật thiết kế thí nghiệm đánh giá đáp ứng miễn dịch động vật.
• Đối với các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế và thú y: Cung cấp các thông số kỹ thuật thực nghiệm chi tiết về nuôi cấy tế bào dòng Marc-145, tối ưu hóa điều kiện nhân giống virus quy mô lớn, kỹ thuật đông khô và kiểm định an toàn sinh học của giống gốc (Master seed).
• Đối với cơ quan quản lý dịch bệnh thú y: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu dịch tễ phân tử phục vụ công tác giám sát, xây dựng chiến lược phòng chống dịch PRRS bằng vaccine nội địa tương đồng kháng nguyên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng virus PRRS nào được lựa chọn làm ứng viên để tạo giống gốc nhược độc và dựa trên các căn cứ nào?

Tác giả đã so sánh 2 chủng virus PRRS cường độc thực địa là 02HY (Hưng Yên) và 05TB (Thái Bình). Chủng 02HY được chọn do thể hiện độc lực cao điển hình trên lợn thí nghiệm (sốt 40,5–41,5°C, gây tổn thương phổi nặng, virus huyết kéo dài) và có khả năng thích ứng, phát triển ổn định trên tế bào Marc-145 với hiệu giá đạt $10^{6,63} TCID_{50}/ml$.

2. Quá trình cấy truyền nhược độc hóa chủng 02HY diễn ra qua bao nhiêu thế hệ và sự suy giảm độc lực được ghi nhận ra sao?

Quá trình nhược độc hóa được thực hiện qua 80 đời cấy truyền liên tiếp (P1 đến P80) trên tế bào Marc-145. Độc lực giảm dần qua các đời P1, P50, P60, P70 và đến đời P80 (chủng Hanvet1.vn), virus hoàn toàn mất tính gây bệnh: lợn tiêm không bị sốt, không có triệu chứng lâm sàng, không có bệnh tích đại thể/vi thể, không xuất hiện virus huyết nhưng vẫn kích thích sinh kháng thể đặc hiệu cao.

3. Phân tích hệ gen đã phát hiện những biến đổi phân tử nào giữa chủng nhược độc Hanvet1.vn và chủng cường độc 02HY?

So sánh hệ gen hoàn chỉnh giữa Hanvet1.vn (mã GenBank: KU842720) và 02HY (GenBank Submission: 2490633) đã phát hiện 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rải rác trên 7 gen và 7 protein tương ứng. Tuy nhiên, gen ORF5 mã hóa glycoprotein kháng nguyên GP5 vẫn giữ được tính ổn định và tương đồng 94%–99% với các chủng PRRS thực địa tại Việt Nam.

4. Giống gốc Hanvet1.vn đã vượt qua các kiểm tra an toàn sinh học nào trước khi dùng sản xuất vaccine?

Giống gốc Hanvet1.vn được kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm, Mycoplasma), thuần khiết (không nhiễm PCV2, CSFV, PRV), an toàn tuyệt đối khi tiêm liều cao $10^5 TCID_{50}$ trên lợn và đặc biệt là không xảy ra hiện tượng hồi phục độc lực khi tiếp truyền liên tục qua 5 đời lợn thí nghiệm in vivo.

5. Hiệu lực bảo hộ và độ dài miễn dịch của vaccine chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn đạt mức độ nào?

Vaccine nhược độc chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn kích thích lợn tạo hiệu giá kháng thể IPMA lên tới 1/4.305,389, bảo hộ 100% lợn thí nghiệm trước thử thách công cường độc bằng chủng virus PRRS độc lực cao và duy trì độ dài miễn dịch bảo hộ kéo dài 6 tháng.

---

Kết luận

Luận án của tác giả Nguyễn Thị Nga đã hoàn thành mục tiêu nghiên cứu khi nhược độc hóa thành công chủng virus PRRS cường độc thực địa 02HY qua 80 đời cấy truyền trên tế bào Marc-145, tạo ra chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc đạt chuẩn chất lượng. Công trình đã giải mã toàn bộ hệ gen, xác định 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin liên quan đến sự giảm độc lực mà vẫn bảo tồn tính kháng nguyên GP5 với độ tương đồng 94%–99% so với các chủng lưu hành. Các kết quả kiểm định in vitro và in vivo khẳng định giống gốc Hanvet1.vn an toàn, thuần khiết, ổn định di truyền, không hồi độc và vaccine sản xuất từ giống gốc này có khả năng bảo hộ lợn kéo dài đến 6 tháng. Công trình có giá trị khoa học và thực tiễn cao, cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học virus PRRS và đặt nền tảng công nghệ cho việc tự chủ sản xuất vaccine PRRS chất lượng cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1. Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) Khái niệm: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn do virus thuộc họ Arteriviridae gây ra. Lợn bị nhiễm virus này có biểu hiện rối loạn hô hấp và sinh sản trên mọi lứa tuổi với các triệu chứng chủ yếu là bỏ ăn hàng loạt, hắt hơi, sổ mũi, tăng tần số hô hấp, thở khó, lợn con thường có tỷ lệ chết cao, lợn trưởng thành tỷ lệ chết thấp hơn nhưng thường bị đồng nhiễm thêm các loại vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh ở hệ hô hấp.

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận vào năm 1987 ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota. Năm 1988 bệnh lan sang Canada. Sau đó bệnh xuất hiện ở Đức năm 1990; Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ và Anh năm 1991 và ở Pháp năm 1992 (Benfield D et al. Từ khi xuất hiện đến nay, bệnh đã được gọi với nhiều tên khác nhau.

Thời gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên gọi bệnh này là Bệnh bí hiểm ở lợn (MDS). Một số tác giả khác căn cứ vào bệnh tích ở tai gọi tên bệnh Tai xanh (BED) hoặc căn cứ vào các đặc điểm trên lợn mắc virus PRRS như sảy thai, đẻ non, chết non, sức sống yếu ớt, tỷ lệ chết của lợn con cao và rối loạn hô hấp trên đàn lợn (Keffaber, 1989; Loula, 1991) gọi tên là Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (PEARS). Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế tổ chức tại Minesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine respiratory and reproductive syndrome-PRRS), đây là tên gọi chính thức của bệnh. Hàng năm ước tính chi phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở Mỹ là 560 triệu USD cho PRRS (Neumann et al.

Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam +Tình hình PRRS trên thế giới Theo báo cáo của tổ chức Thú y thế giới (2014), virus PRRS type 2 xuất hiện ở Trung Quốc và lan rộng khắp Châu Á (Đông, Nam và Bắc Á): Bhutan, 6 Campuchia, Trung Quốc, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Philippine, Nga, Singapore, Việt Nam. Sự phân bố của các type PRRSV trên thế giới (Nguồn: http://www.com/wps/portal/hipra/prrscontrol/prrs-knowledge/porcine- reproductive-and-respiratory-syndrome) Đại dịch PRRS bùng phát lây lan nhanh hơn 10 tỉnh thành của Trung Quốc làm chết 2.000 con lợn, trong đó có hơn 400.000 sảy thai, đẻ non. Trong năm 2007 PRRS đã xảy ra ở trên 25 tỉnh, với trên 180.000 lợn mắc bệnh và 45. Qua một số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta đã xác định virus PRRS tại Trung Quốc thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường độc gây ra (Tian et al.

Ở Hàn Quốc, PRRS ở lợn chủ yếu do 2 chủng virus thuộc type EU-1 và type 2 (Bắc mỹ) gây ra (Yeom et al. Từ 4/2012 đến 8/2013 (Marinou et al., 2015) đã thu thập 359 mẫu huyết thanh từ lợn rừng tại các địa phương khác nhau thuộc Hy Lạp để xác định tỷ lệ lưu hành một số mầm bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trong đó có hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Kết quả cho thấy 5,6% số mẫu dương tính với virus PRRS. Từ năm 2008 đến năm 2013 (Jantafong et al., 2015) cho biết: hàng năm có khoảng 13,86% số lợn ở Thái Lan nhiễm virus hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp.

7 Năm 2008, virus PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Thái Lan và Campuchia, 2 năm sau đó, nó trở thành nguyên nhân gây bùng phát dịch tại 2 nước này. Tornimbene et al.