Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc và đánh giá khả năng sản xuất vaccine

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo chủng virus prrs porcine reproductive and respiratory syndrome nhược độc và đánh giá, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Nguyễn Thị Nga
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ sinh học
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.2. Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
• 1.3. Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS
• 1.5. Bệnh tích PRRS
• 1.6. Tác nhân gây bệnh và con đường truyền lây PRRS
• 1.7. Cơ chế bệnh sinh
• 1.8. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.9. Nguồn gốc, phân loại virus PRRS
• 1.10. Cấu trúc, chức năng hệ gen virus PRRS
• 1.11. Đa dạng di truyền hệ gen virus PRRS
• 1.12. Các protein kháng nguyên quan trọng của virus PRRS
• 1.13. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm
• 1.14. Sức đề kháng của virus PRRS
• 1.15. Đặc điểm nuôi cấy virus PRRS
• 1.16. Nghiên cứu tạo vaccine PRRS
• 1.17. Các loại vaccine được nghiên cứu phòng PRRS
• 1.18. Một số nghiên cứu về vaccine PRRS ở Việt Nam
• 1.19. Nghiên cứu tạo vaccine nhược độc phòng PRRS
• 1.20. Giống gốc trong sản xuất vaccine
• 1.21. Yêu cầu của giống gốc
• 1.22. Một số phương pháp bảo quản giống gốc virus PRRS
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp mổ khám. Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
• 2.4. Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
• 2.5. Xử lý bệnh phẩm
• 2.6. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
• 2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 2.8. Phương pháp nhân virus PRRS
• 2.9. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 2.10. Phương pháp cấy truyền virus PRRS
• 2.11. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus
• 2.12. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng)
• 2.13. Phương pháp Realtime RT-PCR
• 2.14. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.15. Phương pháp RT-PCR. Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen
• 2.16. Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ
• 2.17. Phương pháp điện di
• 2.18. Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể
• 2.19. Phương pháp đếm tế bào Marc 145
• 2.20. Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.2. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.3. Khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm
• 3.4. Kết quả kiểm tra bệnh tích ở lợn thí nghiệm
• 3.5. Kiểm tra virus huyết ở lợn thí nghiệm
• 3.6. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.7. Kiểm tra đặc tính nhân lên của virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145
• 3.8. Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc 145
• 3.9. Đánh giá đặc tính nhân lên của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền trên tế bào Marc 145
• 3.10. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền
• 3.11. Kiểm tra độc lực của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80
• 3.12. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng virus Hanvet1.vn nhược độc và chủng 02HY cường độc
• 3.13. Khuếch đại các đoạn gen thuộc hệ gen virus PRRS
• 3.14. Tách dòng các đoạn gen khuếch đại
• 3.15. Kết quả giải mã, phân tích hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc
• 3.16. Phân tích so sánh gen chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và thế giới
• 3.17. Đánh giá đặc tính giống gốc chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc
• 3.18. Kiểm tra thuần khiết
• 3.19. Kết quả kiểm tra tính an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn
• 3.20. Khả năng kích thích sinh kháng thể của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc
• 3.21. Đánh giá đặc tính ổn định của giống gốc virus PRRS Hanvet1
• 3.22. Nghiên cứu điều kiện bảo quản giống gốc (Master seed)
• 3.23. Đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch ở lợn sau khi tiêm vaccine nhược độc được chế tạo từ giống gốc Hanvet1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Về nghiên cứu đánh giá độc lực chủng virus PRRS 02HY cường độc Việt Nam chọn làm chủng ứng viên để tạo virus giống gốc PRRS nhược độc
• 4.2. Về nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp trên môi trường tế bào Marc 145
• 4.3. Về đánh giá giống gốc Hanvet1.vn nhược độc sử dụng cho chế tạo vaccine PRRS
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PRRS và tình hình nghiên cứu

Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là tác nhân gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Virus PRRS được phát hiện lần đầu vào năm 1987 và hiện đã trở thành dịch địa phương ở nhiều quốc gia. Tại Việt Nam, từ năm 2007, virus PRRS đã bùng phát thành dịch, gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng. Nghiên cứu virus PRRS tập trung vào việc phân loại, cấu trúc gen, và cơ chế gây bệnh. Virus PRRS gây bệnh thông qua việc tấn công hệ thống miễn dịch của lợn, dẫn đến các triệu chứng như sảy thai, viêm phổi và suy hô hấp. Công nghệ vaccine hiện nay chủ yếu dựa trên việc sử dụng chủng virus nhược độc để tạo miễn dịch. Tuy nhiên, sự khác biệt di truyền giữa các chủng virus PRRS ở các vùng địa lý khác nhau làm giảm hiệu quả của vaccine nhập khẩu. Do đó, việc phát triển vaccine từ chủng virus PRRS bản địa là cần thiết.

1.1. Lịch sử và phân loại virus PRRS

Virus PRRS thuộc họ Arteriviridae, được chia thành hai genotype chính: Bắc Mỹ và Châu Âu. Sự khác biệt di truyền giữa hai genotype này lên đến 40%, dẫn đến sự đa dạng trong virus gây bệnh PRRS. Tại Việt Nam, virus PRRS thuộc genotype Châu Á, có đặc điểm di truyền và khả năng gây bệnh riêng biệt. Nghiên cứu virus PRRS đã chỉ ra rằng, sự đa dạng di truyền này ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của vaccine PRRS. Do đó, việc phân loại và nghiên cứu sâu về chủng virus PRRS là bước quan trọng trong phát triển vaccine.

1.2. Tình hình dịch bệnh PRRS tại Việt Nam

Từ năm 2007, virus PRRS đã gây ra nhiều đợt dịch tại Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc. Virus PRRS gây bệnh với các triệu chứng như sảy thai, viêm phổi và tỷ lệ tử vong cao ở lợn con. Nghiên cứu virus PRRS tại Việt Nam đã chỉ ra rằng, sự lưu hành của chủng virus PRRS địa phương là nguyên nhân chính gây ra dịch bệnh. Việc thiếu vaccine PRRS hiệu quả và giá thành cao của vaccine nhập khẩu đã làm tăng nhu cầu sản xuất vaccine từ chủng virus nhược độc bản địa.

II. Phương pháp nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc

Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc được thực hiện thông qua quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS cường độc trên tế bào Marc 145. Chủng virus PRRS 02HY được chọn làm ứng viên để tạo chủng virus nhược độc do đặc tính gây bệnh mạnh và khả năng nhân lên ổn định trên tế bào. Quá trình cấy truyền liên tiếp 80 đời đã làm giảm độc lực của virus PRRS, tạo ra chủng virus nhược độc Hanvet1.vn. Công nghệ sản xuất vaccine dựa trên chủng virus nhược độc này đã được đánh giá về tính an toàn, hiệu quả và khả năng kích thích miễn dịch.

2.1. Quá trình cấy truyền và tạo chủng nhược độc

Quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145 đã làm giảm độc lực của virus. Sau 80 đời cấy truyền, chủng virus nhược độc Hanvet1.vn được tạo ra, có hiệu giá virus đạt 106,63 TCID50. Chủng virus nhược độc này đáp ứng các tiêu chuẩn về tính an toàn và khả năng kích thích miễn dịch, phù hợp cho sản xuất vaccine PRRS.

2.2. Đánh giá đặc tính sinh học và phân tử

Chủng virus nhược độc Hanvet1.vn được đánh giá về đặc tính sinh học và phân tử. Kết quả giải trình tự gen cho thấy, chủng virus nhược độc có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin so với chủng virus cường độc ban đầu. Tuy nhiên, gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 không thay đổi, đảm bảo tính kháng nguyên của vaccine PRRS. Công nghệ vaccine dựa trên chủng virus nhược độc này đã được chứng minh là hiệu quả và an toàn.

III. Ứng dụng chủng virus nhược độc trong sản xuất vaccine

Chủng virus nhược độc Hanvet1.vn đã được ứng dụng trong sản xuất vaccine PRRS. Vaccine PRRS được tạo ra từ chủng virus nhược độc này đã được đánh giá về tính an toàn, hiệu quả và khả năng kích thích miễn dịch. Kết quả cho thấy, vaccine PRRS có hiệu giá kháng thể cao, đạt 1/4.305,389, và độ dài miễn dịch kéo dài đến 6 tháng. Ứng dụng công nghệ vaccine này đã mở ra triển vọng lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam.

3.1. Đánh giá hiệu quả của vaccine PRRS

Vaccine PRRS được sản xuất từ chủng virus nhược độc Hanvet1.vn đã được đánh giá về hiệu quả bảo hộ. Kết quả cho thấy, vaccine PRRS có khả năng kích thích miễn dịch mạnh, với hiệu giá kháng thể đạt 1/4.305,389. Ứng dụng vaccine này đã giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở lợn, đặc biệt là trong các đợt dịch PRRS.

3.2. Triển vọng phát triển vaccine PRRS tại Việt Nam

Việc sản xuất vaccine PRRS từ chủng virus nhược độc bản địa đã mở ra triển vọng lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam. Công nghệ sản xuất vaccine này không chỉ giảm chi phí mà còn tăng hiệu quả bảo hộ, phù hợp với đặc điểm di truyền của virus PRRS lưu hành tại Việt Nam. Phát triển vaccine từ chủng virus nhược độc là bước tiến quan trọng trong việc chủ động phòng chống dịch bệnh PRRS.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), thường được gọi là bệnh Tai xanh, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn toàn cầu. Được phát hiện lần đầu tại Bắc Mỹ vào năm 1987 và Tây Âu vào đầu thập niên 1990 (Benfield et al., 1992), PRRSV gây tổn thất ước tính 560 triệu USD mỗi năm riêng tại Hoa Kỳ (Neumann et al., 2005). Tại Việt Nam, từ đại dịch 2007–2008 đến giai đoạn 2010–2016, virus PRRS độc lực cao đã bùng phát trên diện rộng tại hơn 25 tỉnh thành, làm hàng triệu con lợn mắc bệnh và tiêu hủy bắt buộc (Tô Long Thành và cs., 2008; Cục Thú y, 2016). Đặc thù chăn nuôi quy mô nông hộ và an toàn sinh học chưa đồng bộ tại Việt Nam khiến việc kiểm soát virus đòi hỏi giải pháp can thiệp miễn dịch chủ động bằng vaccine có độ tương thích kháng nguyên cao.

Khoảng trống nghiên cứu then chốt xuất phát từ sự đa hình di truyền cực kỳ phức tạp của PRRSV. Bộ gen RNA sợi đơn dương của virus có tỷ lệ đột biến cao và tiến hóa theo cơ chế biến chủng liên hợp (viral quasispecies). Giữa hai kiểu gen chính là Type 1 (chủng Lelystad - Châu Âu) và Type 2 (chủng VR-2332 - Bắc Mỹ) có sự sai khác cấu trúc nucleotide lên tới 40% (Thiel et al.; Kapur et al., 1996; Nelsen et al., 1999). Ngay trong nội bộ Type 2, các chủng thực địa lưu hành tại châu Á và Việt Nam cũng có độ phân kỳ di truyền lên tới 20% so với các chủng vaccine cổ điển (Tian et al., 2007; Charerntantanakul, 2012). Do đó, các chế phẩm vaccine nhược độc nhập ngoại (như Ingelvac PRRS MLV dòng Bắc Mỹ, Amervac dòng Châu Âu, BSL-PS100 dòng Bắc Mỹ) khi khảo nghiệm tại Việt Nam chỉ đạt tỷ lệ bảo hộ dao động từ 52,08% đến 70,83% (Nguyễn Đức Hiền, 2012; Nguyễn Ngọc Hải và cs., 2010). Thực tế đòi hỏi cấp bách phải làm chủ công nghệ giải mã, làm suy giảm độc lực và thiết lập chủng giống gốc vaccine (Master Seed Virus - MSV) từ chính nguồn chủng thực địa độc lực cao lưu hành tại Việt Nam.

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Nga tập trung giải quyết bốn câu hỏi nghiên cứu cốt lõi:

1. Chủng virus PRRS thực địa nào tại các ổ dịch Việt Nam sở hữu độc lực cao điển hình và có khả năng thích ứng, nhân lên ổn định trên dòng tế bào Marc-145?
2. Quy luật suy giảm độc lực và động học thích ứng sinh học diễn ra như thế nào khi cấy truyền liên tiếp chủng cường độc qua 80 đời (Passage 80 - P80) trên tế bào Marc-145?
3. Những đột biến nucleotide và biến đổi axit amin nào trên toàn bộ hệ gen quy định sự mất độc lực nhưng vẫn duy trì tính toàn vẹn của các epitope kháng nguyên trung hòa trên glycoprotein cấu trúc GP5?
4. Chủng nhược độc tạo thành có đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn khắt khe của một giống gốc vaccine về tính thuần khiết, tính an toàn sinh học, tính ổn định di truyền và hiệu lực bảo hộ thực địa kéo dài 6 tháng trên động vật mục tiêu hay không?

Hệ thống giả thuyết nghiên cứu được kiểm định bao gồm:

• Giả thuyết H1: Chủng virus PRRS phân lập tại thực địa miền Bắc Việt Nam (02HY) có độc lực cao, gây bệnh tích phổi nhục hóa điển hình và đạt hiệu giá nhân lên cao trên tế bào Marc-145 ($\ge 10^{6.5} \text{TCID}_{50}/\text{ml}$).
• Giả thuyết H2: Quá trình cấy truyền liên tiếp 80 đời trên tế bào Marc-145 sẽ làm suy giảm độc lực hoàn toàn trên lợn sống mà không làm biến đổi các epitope trung hòa chủ chốt của protein GP5.
• Giả thuyết H3: Giống gốc Hanvet1.vn nhược độc đạt tính ổn định di truyền qua 10 đời cấy truyền tiếp theo và 5 đời truyền qua lợn, kích thích sản sinh kháng thể trung hòa cao và bảo hộ 100% lợn trước thử thách công cường độc.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp: Thuyết tiến hóa biến chủng liên hợp (Viral Quasispecies Evolution Theory - Domingo & Holland, 1992), Thuyết bẫy miễn dịch qua trung gian kháng thể (Antibody-Dependent Enhancement - ADE - Yoon et al., 1995; Lopez et al., 2004), và Mô hình tương tác thụ thể tế bào CD163/Vimentin trong cơ chế xâm nhiễm của chi Arterivirus (Snijder & Meulenberg, 1998; Ma et al., 2021). Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm bao quát quá trình phân lập, cấy truyền 80 thế hệ tế bào, giải mã toàn bộ bộ gen 15.353 bp, thử nghiệm trên các lô lợn thí nghiệm thực địa và theo dõi biến động kháng thể, bài thải virus và chỉ số tăng trọng trong thời gian 180 ngày.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về PRRSV trong y văn thế giới phân tách thành ba dòng học thuật chính:

Dòng nghiên cứu cấu trúc phân tử và cơ chế bệnh sinh: Snijder & Meulenberg (1998), Dea et al. (2000), và Wissink et al. (2003, 2004) đã xác lập cấu trúc bộ gen RNA dài ~15 kb chứa 9 khung đọc mở (ORF1a, ORF1b, ORFs 2–7). Các protein phi cấu trúc (NSP1–NSP12) chịu trách nhiệm sao chép và ức chế miễn dịch bẩm sinh (đặc biệt là NSP1α, NSP1β, NSP2 và NSP11 đóng vai trò là chất đối kháng Interferon mạnh mẽ). Các glycoprotein cấu trúc bao gồm GP2a, GP3, GP4 tạo phức hợp dị tam hợp (heterotrimer), cùng phức hợp GP5-M đóng vai trò quyết định trong việc bám dính thụ thể heparan sulfate và CD163 trên đại thực bào phế nang lợn (PAM) (Das, 2011; Charerntantanakul, 2012).

Dòng nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và hiện tượng ADE: Yoon et al. (1995) và Lopez et al. (2004) đã phát hiện nghịch lý miễn dịch ở PRRS: kháng thể xuất hiện sớm nhất là kháng thể kháng nucleoprotein N (từ ngày 7–11 sau nhiễm), nhưng đây là kháng thể không trung hòa. Ngược lại, kháng thể không trung hòa này liên kết với virion tạo điều kiện cho virus xâm nhập ồ ạt vào đại thực bào qua thụ thể Fc, kích hoạt hiện tượng "Tăng cường bệnh phụ thuộc vào kháng thể" (Antibody-Dependent Enhancement - ADE). Trong khi đó, kháng thể trung hòa đặc hiệu kháng epitope B trên glycoprotein GP5 (vị trí aa 36–52) xuất hiện rất muộn (sau 4 tuần) và bị cản trở bởi hiện tượng "rào chắn N-glycan" bao quanh epitope (Ostrowski, 2002; Mateu et al., 2006).

Dòng nghiên cứu công nghệ vaccine: Khảo sát các công nghệ chế tạo vaccine PRRS từ vô hoạt, vector tái tổ hợp, DNA vaccine đến nhược độc cổ điển (Modified Live Vaccine - MLV). Zuckermann et al. (2007) và Scortti et al. (2007) khẳng định vaccine vô hoạt an toàn nhưng hiệu lực bảo hộ thực địa rất kém, không kích hoạt được đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI) và không làm giảm virus huyết. Ngược lại, MLV tạo ra miễn dịch tế bào và dịch thể mạnh mẽ, giảm rõ rệt triệu chứng lâm sàng và tổn thương phổi khi công cường độc (Darwich et al., 2003; Ansari et al., 2006).

Trong y văn thế giới, việc tạo chủng vaccine nhược độc qua cấy truyền tế bào in vitro đã được triển khai bởi một số nhóm tác giả quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu của Allende et al. (2000) (Hoa Kỳ): Cấy truyền chủng Bắc Mỹ VR-2332 qua 37 đời trên tế bào Marc-145 để tạo ra dòng vaccine thương mại Ingelvac PRRS MLV. Chủng này kiểm soát tốt các dòng virus cổ điển tại Bắc Mỹ nhưng hiệu quả bảo hộ chéo trước các biến chủng độc lực cao tại châu Á bị suy giảm đáng kể.
2. Nghiên cứu của Leng et al. (2012) và Tian et al. (2007) (Trung Quốc): Cấy truyền chủng virus PRRS độc lực cao dòng TJ và JXA1 qua 92 đến 112 đời trên tế bào Marc-145 để tạo chủng nhược độc JXA1-R và TJM-F92.

Công trình của Nguyễn Thị Nga định vị tại điểm giao thoa giữa virus học phân tử và dịch tễ học thực địa Việt Nam: xác lập quy trình cấy truyền tối ưu chính xác ở 80 đời (P80) đối với chủng thực địa 02HY phân lập tại Hưng Yên. Công trình giải quyết triệt để rào cản dị chủng di truyền của các vaccine nhập ngoại, tạo ra chế phẩm tương đồng kháng nguyên tới 99% với các chủng virus PRRS lưu hành tại hơn 20 tỉnh thành Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng Thuyết tiến hóa biến chủng liên hợp (Viral Quasispecies Evolution) của Domingo & Holland (1992) trong bối cảnh áp lực chọn lọc in vitro nhân tạo. Bằng việc giải mã và đối chiếu toàn bộ hệ gen giữa chủng cường độc ban đầu 02HY (GenBank Submission 2490633) và chủng nhược độc Hanvet1.vn (GenBank KU842720), nghiên cứu chứng minh rằng quá trình thích ứng trên tế bào thận khỉ Marc-145 tạo ra sự tích lũy có định hướng của 89 đột biến nucleotide dẫn đến 51 đột biến thay thế axit amin trên 7 khung đọc mở.

Mô hình lý thuyết của luận án thiết lập 4 mệnh đề chuyển dịch độc lực:

• Mệnh đề P1: Sự tích lũy đột biến trên các protein phi cấu trúc (đặc biệt là NSP1, NSP2 và NSP11) làm suy giảm năng lực đối kháng Interferon và khả năng phá hủy đại thực bào phế nang (PAM), làm triệt tiêu độc lực gây sốt cao và tổn thương mô học trên vật chủ.
• Mệnh đề P2: Quá trình cấy truyền in vitro tạo ra áp lực chọn lọc làm tăng ái lực của virus với thụ thể Vimentin trên tế bào Marc-145 nhưng giảm khả năng bám dính thụ thể CD163 trên đại thực bào in vivo.
• Mệnh đề P3: Các đột biến suy giảm độc lực phân bố rải rác nhưng bảo tồn cấu trúc không gian bậc ba của protein GP5 tại vùng ectodomain (aa 36–52), duy trì khả năng kích thích tế bào lympho B sản sinh kháng thể trung hòa đặc hiệu.
• Mệnh đề P4: Độc lực của PRRSV trên động vật mục tiêu tỷ lệ thuận với cường độ và thời gian tồn tại của virus huyết (viremia), và quá trình nhược độc hóa tại P80 đã cắt đứt hoàn toàn pha virus huyết kéo dài trên lợn thí nghiệm.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba lý thuyết nền tảng:

1. Lý thuyết thụ thể và cơ chế nội bào (Receptor-mediated Endocytosis): Giải thích cơ chế xâm nhập qua trung gian heparan sulfate và CD163/Vimentin.
2. Lý thuyết động học miễn dịch dịch thể và ADE: Đánh giá sự phân ly giữa kháng thể không trung hòa sớm (kháng protein N) và kháng thể trung hòa muộn (kháng GP5/M).
3. Lý thuyết an toàn sinh học giống vi sinh vật (Master Seed Paradigm): Đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe của OIE và TCVN 8400-21:2014 về độ thuần khiết vô trùng, tính an toàn không đảo độc lực qua 5 đời truyền lợn, và tính ổn định di truyền qua 10 đời cấy truyền tiếp theo.

Điều kiện biên (Boundary conditions) của khung phân tích được xác lập rõ ràng: Mô hình áp dụng cho phân nhóm virus PRRS Type 2 (dòng Bắc Mỹ biến chủng độc lực cao châu Á), nuôi cấy trên hệ thống dòng tế bào liên tục Marc-145 trong môi trường DMEM bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) từ 2% đến 10% ở dải pH tối ưu 7,0–7,4.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận dụng thế giới quan thực chứng luận (Positivism), kết hợp chặt chẽ giữa phân tích sinh học phân tử in vitro và thực nghiệm mù đôi có đối chứng trên động vật sống in vivo.

Thiết kế đa tầng được phân định thành 4 giai đoạn logic nối tiếp:

• Tầng 1 - Sàng lọc và tuyển chọn ứng viên cường độc: Đánh giá so sánh độc lực và động học nhân lên của hai chủng phân lập thực địa là 02HY (Hưng Yên) và 05TB (Thái Bình) trên lợn thí nghiệm và tế bào Marc-145.
• Tầng 2 - Nhược độc hóa qua cấy truyền liên tục: Tiến hành cấy truyền liên tiếp 80 đời (P1 đến P80) trên tế bào dòng Marc-145, định kỳ đánh giá hiệu giá virus và thử nghiệm độc tính trên lợn tại các mốc P1, P50, P60, P70, P80.
• Tầng 3 - Phân tích sinh học phân tử toàn diện: Thiết kế hệ thống 15 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 15 phân đoạn bao phủ 100% hệ gen virus, dòng hóa vào vector plasmid, giải mã trình tự nucleotide tự động Sanger và phân tích cây phả hệ phát sinh loài.
• Tầng 4 - Đánh giá tiêu chuẩn Giống gốc (Master Seed) và Hiệu lực Vaccine: Kiểm tra vô trùng vi khuẩn/nấm/mycoplasma, kiểm tra thuần khiết không tạp nhiễm 6 loại virus ngoại lai (PCV2, Dịch tả lợn CSFV, Giả dại PRV, Parvovirus PPV, Cúm lợn SIV, TGEV), thử nghiệm đảo độc lực qua 5 đời lợn, tối ưu hóa công nghệ đông khô và đánh giá độ dài miễn dịch 6 tháng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình chọn mẫu động vật: Lợn thí nghiệm được tuyển chọn nghiêm ngặt từ các cơ sở an toàn dịch bệnh, đạt trọng lượng 15–20 kg/con, khỏe mạnh, có kết quả xét nghiệm âm tính hoàn toàn với kháng nguyên và kháng thể kháng PRRSV (bằng Realtime RT-PCR và ELISA), đồng thời âm tính với PCV2 và CSFV.

Quy trình thu thập và xử lý dữ liệu:

• Đo thân nhiệt hàng ngày bằng nhiệt kế điện tử chuẩn hóa, theo dõi triệu chứng hô hấp và tính điểm bệnh lý lâm sàng.
• Định lượng hiệu giá virus theo phương pháp Karber hoặc Reed-Muench, tính theo đơn vị $\text{TCID}_{50}/\text{ml}$.
• Đánh giá tổn thương đại thể tại phổi theo thang điểm phần trăm nhục hóa phế nang; giải phẫu bệnh học vi thể nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) xác định hiện tượng viêm phổi kẽ và thâm nhiễm đại thực bào.
• Định lượng kháng thể bằng kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme đơn lớp tế bào (Immunoperoxidase Monolayer Assay - IPMA) và phản ứng trung hòa virus (Virus Neutralization Test - VNT).
• Định lượng virus huyết bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR với cặp mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu.

Data và phân tích

Dữ liệu giải trình tự gen được lắp ráp, căn chỉnh bằng phần mềm BioEdit v7.2 và DNAStar Lasergene. Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.0 sử dụng thuật toán Neighbor-Joining với giá trị kiểm định Bootstrap 1.000 lần lặp. Dữ liệu sinh học thực nghiệm (thân nhiệt, hiệu giá kháng thể, mức tăng trọng) được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS và Excel, kiểm định sự khác biệt bằng phân tích phương sai ANOVA và Student's t-test, với mức ý nghĩa thống kê được xác lập tại $p < 0.05$ và $p < 0.01$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Phát hiện 1: Sàng lọc chính xác chủng ứng viên cường độc 02HY. Kết quả gây nhiễm thực nghiệm chứng minh chủng 02HY (phân lập tại Hưng Yên) có độc lực vượt trội so với chủng 05TB (Thái Bình). Lợn nhiễm 02HY biểu hiện sốt cao liên tục $40.5 - 41.8^\circ\text{C}$, bỏ ăn hoàn toàn, ho khó thở nặng, tai và vùng da mỏng tím tái; phổi bị nhục hóa chắc đặc màu đỏ xám điển hình. Trên tế bào Marc-145, chủng 02HY nhân lên nhanh chóng, tạo bệnh tích tế bào (CPE) rõ rệt và đạt hiệu giá virus cực đại lên tới $10^{6.63} \text{TCID}_{50}/\text{ml}$ sau 48–72 giờ nuôi cấy.

Phát hiện 2: Quy luật suy giảm độc lực qua 80 đời cấy truyền in vitro. Hiệu giá virus trên tế bào Marc-145 tăng dần từ $10^{4.5} \text{TCID}{50}/\text{ml}$ ở P1 lên đỉnh $10^{6.5} - 10^{6.63} \text{TCID}{50}/\text{ml}$ từ đời P50 trở đi. Khi tiêm thử nghiệm trên lợn sống:

• Chủng P1 gây sốt cao, tổn thương phổi nặng và bài thải virus huyết kéo dài;
• Chủng P50 và P60 bắt đầu giảm độc tính nhưng vẫn gây sốt nhẹ ($39.8 - 40.2^\circ\text{C}$);
• Chủng P70 và đặc biệt là P80 (đặt tên là Hanvet1.vn) đã suy giảm độc lực hoàn toàn: lợn tiêm P80 có thân nhiệt hoàn toàn bình thường ($38.5 - 39.3^\circ\text{C}$), tăng trọng tương đương lô đối chứng khỏe mạnh ($p > 0.05$), không có bệnh tích đại thể ở phổi và không phát hiện virus huyết sau 14 ngày.

Phát hiện 3: Giải mã bản đồ đột biến 89 nucleotide và bảo tồn epitope kháng nguyên GP5. Phân tích so sánh toàn bộ hệ gen giữa Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc ban đầu đã định danh chính xác 89 đột biến nucleotide dẫn đến 51 đột biến thay thế axit amin nằm rải rác trên 7 khung đọc mở:

Vùng Gen / Protein	Số đột biến Nucleotide	Số đột biến Axit Amin	Chức năng sinh học liên quan
ORF1a (NSP1–8)	38	21	Suy giảm năng lực ức chế miễn dịch bẩm sinh và sao chép
ORF1b (NSP9–12)	22	12	Giảm hoạt tính RNA polymerase và helicase
ORF2 (GP2a/b)	6	4	Tương tác phối tử tế bào Marc-145 / CD163
ORF3 (GP3)	7	4	Protein cấu trúc vỏ phụ
ORF4 (GP4)	5	3	Tương tác gắn kết thụ thể CD163
ORF5 (GP5)	6	4	Kháng nguyên vỏ chính; bảo tồn epitope trung hòa aa 36–52
ORF6 (Protein M)	3	2	Phức hợp màng M-GP5
ORF7 (Protein N)	2	1	Vỏ capsid nhân nucleoprotein
Tổng cộng	89	51	Chuyển đổi hoàn toàn từ cường độc sang nhược độc

Đặc biệt, đột biến trên ORF5 không làm thay đổi các axit amin tại epitope trung hòa chủ chốt (aa 36–52 thuộc vùng ectodomain), đảm bảo chủng nhược độc Hanvet1.vn giữ nguyên vẹn tính kháng nguyên kích thích kháng thể trung hòa.

Phát hiện 4: Tính tương đồng di truyền vượt trội với các chủng thực địa. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 và axit amin protein GP5 của Hanvet1.vn với 29 chủng virus PRRS phân lập từ hơn 20 tỉnh thành tại Việt Nam và khu vực trên GenBank cho thấy mức độ tương đồng rất cao, đạt từ 94% đến 99%. Điều này giải thích cơ sở phân tử vì sao giống gốc Hanvet1.vn đem lại tỷ lệ bảo hộ chéo vượt trội so với các chủng vaccine nhập ngoại có độ tương đồng thấp hơn.

Phát hiện 5: Đáp ứng toàn diện các tiêu chuẩn khắt khe của Giống gốc (Master Seed Virus).

• Tính thuần khiết: Chủng giống âm tính hoàn toàn với tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, Mycoplasma và 6 loại virus gây bệnh phổ biến trên lợn.
• Tính an toàn và không hồi độc: Thử nghiệm tiếp truyền liên tục qua 5 đời lợn sống (in vivo back-passages) cho thấy virus không hề hồi phục độc lực; lợn ở cả 5 thế hệ tiếp truyền đều có thân nhiệt bình thường và không biểu hiện bệnh lý.
• Tính sinh miễn dịch: Tiêm phòng cho lợn ở liều $10^5 \text{TCID}_{50}$ kích thích tạo hàm lượng kháng thể IPMA tăng mạnh, đạt đỉnh hiệu giá $1/4.305,389$.
• Hiệu lực bảo hộ: Khi thử thách công cường độc bằng chủng 02HY độc lực cao, 100% lợn được tiêm vaccine từ giống Hanvet1.vn được bảo hộ hoàn toàn (không sốt, không tổn thương phổi, tăng trọng bình thường), trong khi 100% lợn đối chứng không tiêm phòng phát bệnh nặng và biểu hiện bệnh tích phổi điển hình.
• Độ dài miễn dịch và bảo quản: Miễn dịch bảo hộ kéo dài tới 6 tháng sau tiêm phòng; giống virus bảo quản đông khô ổn định hoạt lực trong ít nhất 24 tháng.

Implications đa chiều

Về mặt lý thuyết học thuật: Công trình cung cấp bằng chứng thực nghiệm sáng tỏ về mối liên hệ giữa các đột biến điểm trên hệ gen RNA của Arterivirus với sự chuyển dịch kiểu hình từ cường độc sang nhược độc, đồng thời xác lập nguyên lý bảo tồn epitope trung hòa trong áp lực chọn lọc tế bào liên tục.

Về mặt phương pháp luận: Luận án chuẩn hóa quy trình phân lập, cấy truyền 80 đời và giải mã đồng thời 15 đoạn gen hệ gen PRRSV, cung cấp một khung phương pháp có độ tin cậy cao có thể chuyển giao cho việc nghiên cứu các biến chủng virus RNA mới nổi khác.

Về mặt ứng dụng thực tiễn và sản xuất công nghiệp: Tạo ra chủng giống gốc Hanvet1.vn sẵn sàng cho sản xuất công nghiệp vaccine PRRS nhược độc đạt tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế, trực tiếp phục vụ các nhà máy sản xuất sinh phẩm thú y tại Việt Nam.

Về mặt chính sách quản lý thú y: Cung cấp luận cứ khoa học để Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp & PTNT chủ động chiến lược tiêm phòng dịch bệnh Tai xanh bằng vaccine nội địa hóa, giảm thiểu phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu đắt đỏ và tăng cường an ninh sinh học quốc gia.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu thể hiện tính trung thực học thuật cao khi thẳng thắn chỉ rõ các giới hạn nội tại:

1. Cơ chế chức năng của từng đột biến đơn lẻ: Luận án đã xác định 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nhưng chưa thể bóc tách tác động đóng góp độc lập của từng đột biến cụ thể do giới hạn của phương pháp cấy truyền thích ứng tự nhiên (cần phối hợp kỹ thuật di truyền ngược reverse genetics để gây đột biến định hướng từng vị trí).
2. Phạm vi bảo hộ chéo giữa hai kiểu gen: Nghiên cứu tập trung giải quyết phân nhóm PRRSV Type 2 (dòng Bắc Mỹ/châu Á lưu hành chủ đạo tại Việt Nam), do đó khả năng bảo hộ chéo đối với các chủng Type 1 (chủng Châu Âu thuần túy) chưa được đánh giá đầy đủ.
3. Động học đáp ứng miễn dịch tế bào (CMI): Dữ liệu tập trung chủ yếu vào kháng thể dịch thể (IPMA, VNT) và bệnh lý lâm sàng; các chỉ số miễn dịch qua trung gian tế bào chuyên sâu (như đo lường tế bào T CD4+/CD8+ tiết IFN-$\gamma$ bằng ELISPOT hoặc Flow Cytometry) cần được mở rộng thêm.

Chương trình nghiên cứu tương lai được vạch ra với 4 hướng phát triển rõ rệt:

• Hướng 1: Ứng dụng hệ thống di truyền ngược (Reverse Genetics System) và dòng cDNA nhiễm trùng (infectious cDNA clone) để giải mã chính xác các đột biến then chốt trên NSP1, NSP2 và GP5 quy định tính nhược độc.
• Hướng 2: Nghiên cứu phát triển vaccine đa giá kết hợp chủng Hanvet1.vn với các kháng nguyên tái tổ hợp của virus Dịch tả lợn châu Phi (ASFV) hoặc Circo virus (PCV2/PCV3).
• Hướng 3: Đánh giá miễn dịch tế bào qua trung gian tế bào lympho T bài tiết IFN-$\gamma$ trên đàn lợn nái mang thai và lợn đực giống qua các chu kỳ sinh sản liên tiếp.
• Hướng 4: Triển khai giám sát dịch tễ học phân tử quy mô lớn trên toàn quốc nhằm theo dõi sự tiến hóa của các biến chủng thực địa mới có thể đe dọa hiệu lực bảo hộ của giống gốc.

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động đa tầng đối với khoa học và kinh tế - xã hội:

Tác động học thuật: Đăng ký thành công trình tự hệ gen hoàn chỉnh của chủng Hanvet1.vn trên Ngân hàng Gen thế giới (GenBank accession number: KU842720) và chủng cường độc 02HY (GenBank Submission 2490633), trở thành nguồn dữ liệu chuẩn quốc tế (reference sequence) cho các công trình nghiên cứu về virus học thú y. Tác giả đã công bố 4 công trình khoa học chuyên ngành trên các tạp chí uy tín trong nước và quốc tế.

Tác động công nghiệp và kinh tế: Cho phép các doanh nghiệp dược phẩm thú y trong nước (điển hình là Công ty Hanvet) chủ động sản xuất hàng triệu liều vaccine PRRS nhược độc chất lượng cao với giá thành chỉ bằng 50–60% so với vaccine nhập ngoại, tiết kiệm hàng trăm tỷ đồng chi phí phòng dịch cho người chăn nuôi lợn Việt Nam.

Tác động chính sách và an sinh: Góp phần thực hiện thành công "Kế hoạch quốc gia phòng chống bệnh Hoại tử tai xanh ở lợn", bảo vệ đàn lợn hạt nhân giống và lợn thương phẩm, ổn định nguồn cung thực phẩm và đảm bảo an sinh sinh kế cho hàng triệu hộ chăn nuôi.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận cơ sở dữ liệu phân tử chuẩn xác về hệ gen PRRSV Việt Nam, tham khảo phương pháp luận phân lập, cấy truyền nhược độc hóa và thiết kế 15 cặp mồi khuếch đại toàn bộ hệ gen vi sinh vật.
• Doanh nghiệp Sản xuất Sinh phẩm Dược Thú y: Sở hữu chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc đạt chuẩn MSV đã được tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trên tế bào Marc-145 ($10^{6.5} \text{TCID}_{50}/\text{ml}$, liều gây nhiễm 0.1 MOI, pH duy trì 7.0–7.4, thu hoạch ở 48–72 giờ) và công nghệ đông khô giữ hoạt lực 24 tháng.
• Bác sĩ Thú y và Người Chăn nuôi: Được tiếp cận giải pháp phòng bệnh hiệu quả cao, bảo hộ 100% trước các ổ dịch Tai xanh thực địa, kéo dài thời gian bảo hộ lên tới 6 tháng chỉ với 1 liều tiêm duy nhất.
• Cơ quan Quản lý Thú y Quốc gia: Nâng cao năng lực tự chủ công nghệ sinh học thú y, giảm áp lực nhập siêu vaccine và củng cố hàng rào an toàn dịch bệnh quốc gia.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào? Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là chứng minh quy luật tích lũy đột biến có chọn lọc (89 nucleotide, 51 axit amin) làm mất hoàn toàn độc lực gây bệnh của virus PRRS Type 2 nhưng vẫn duy trì cấu trúc không gian của epitope trung hòa chủ chốt (aa 36–52 trên ectodomain protein GP5). Phát hiện này mở rộng Thuyết biến chủng liên hợp (Quasispecies Evolution Theory) của Domingo & Holland trong mô hình chọn lọc thích ứng in vitro trên tế bào dị loại.

2. Đổi mới phương pháp luận của nghiên cứu khi so sánh với các công trình quốc tế? So với nghiên cứu của Allende et al. (2000) (cấy truyền 37 đời cho chủng VR-2332) và Leng et al. (2012) (cấy truyền 92 đời cho chủng TJ), luận án đã xác lập điểm cân bằng tối ưu chính xác tại đời P80 cho chủng thực địa Việt Nam 02HY. Nghiên cứu đã thiết kế sáng tạo hệ thống 15 cặp mồi bao phủ toàn bộ bộ gen 15.353 bp, kết hợp kiểm định nghiêm ngặt tính an toàn qua 5 đời tiếp truyền liên tục trên động vật sống (in vivo serial back-passages), điều mà nhiều nghiên cứu quốc tế trước đây chỉ thực hiện trên tế bào in vitro.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì? Mặc dù hệ gen tích lũy tới 89 đột biến nucleotide trên khắp 7 gen cấu trúc và phi cấu trúc, mức độ tương đồng nucleotide và axit amin của gen ORF5/protein GP5 giữa chủng Hanvet1.vn với 29 chủng thực địa tại hơn 20 tỉnh thành Việt Nam vẫn đạt con số kinh ngạc: từ 94% đến 99%. Điều này bác bỏ lo ngại ban đầu rằng quá trình nuôi cấy 80 đời trên tế bào Marc-145 sẽ làm trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift) khiến vaccine mất khả năng nhận diện các biến chủng thực địa.

4. Luận án có cung cấp quy trình chuẩn để tái lập (Replication Protocol) không? Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm: từ thông số nồng độ tế bào Marc-145 ($10^6 \text{ tế bào/ml}$), môi trường nuôi cấy DMEM bổ sung 10% FBS khi nhân tế bào và 2% FBS khi nuôi virus, pH duy trì 7.0–7.4, liều gây nhiễm tối ưu 0.1 MOI, thời điểm thu hoạch 48–72 giờ, trình tự 15 cặp mồi RT-PCR, quy trình kiểm tra vô trùng/thuần khiết và công thức chất bảo quản đông khô.

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào? Lộ trình 10 năm tập trung vào: (1) Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) để lập bản đồ chức năng chi tiết của 51 đột biến axit amin; (2) Phát triển vaccine nhược độc nhị giá/tam giá phối hợp phòng PRRS, PCV2 và Mycoplasma hyopneumoniae; (3) Tối ưu hóa công nghệ sản xuất vaccine trên hệ thống bioreactor nuôi cấy tế bào hạt vi mang (microcarrier suspension culture) quy mô công nghiệp hàng vạn lít; (4) Giám sát biến dị kháng nguyên toàn diện định kỳ tại khu vực Đông Nam Á.

Kết luận

1. Tuyển chọn thành công chủng ứng viên cường độc 02HY: Phân lập từ ổ dịch thực địa tại Hưng Yên, mang đầy đủ đặc tính bệnh lý lâm sàng và vi thể điển hình của PRRSV độc lực cao, có khả năng thích ứng và nhân lên đạt hiệu giá cao $10^{6.63} \text{TCID}_{50}/\text{ml}$ trên tế bào dòng Marc-145.
2. Làm suy giảm độc lực thành công qua 80 đời cấy truyền: Thiết lập thành công chủng nhược độc Hanvet1.vn tại đời P80; chứng minh chủng hoàn toàn mất độc lực trên lợn, không gây sốt, không gây tổn thương phổi và không gây virus huyết.
3. Giải mã toàn bộ hệ gen và cơ sở phân tử của tính nhược độc: Xác định 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin trên 7 khung đọc mở (GenBank KU842720), chứng minh sự bảo tồn nguyên vẹn của epitope trung hòa chính (aa 36–52) trên glycoprotein GP5.
4. Xác lập độ tương đồng kháng nguyên vượt trội: Chứng minh chủng Hanvet1.vn đạt độ tương đồng rất cao từ 94% đến 99% so với 29 chủng virus PRRS thực địa lưu hành tại hơn 20 tỉnh thành trên cả nước.
5. Thiết lập và chứng nhận tiêu chuẩn Giống gốc (Master Seed Virus): Giống gốc Hanvet1.vn đạt chuẩn tuyệt đối về tính vô trùng, tính thuần khiết không tạp nhiễm 6 virus ngoại lai, tính an toàn không đảo độc lực qua 5 đời lợn, hiệu giá ổn định $10^{6.5} \text{TCID}_{50}/\text{ml}$, kích thích hiệu giá kháng thể IPMA đạt $1/4.305,389$ và bảo hộ 100% lợn trước thử thách công độc với độ dài miễn dịch kéo dài 6 tháng.
6. Mở ra kỷ nguyên tự chủ công nghệ sinh phẩm thú y tại Việt Nam: Chuyển giao thành công giống gốc để sản xuất thương mại vaccine PRRS nhược độc nội địa chất lượng cao, tạo ra bước đột phá trong kiểm soát dịch bệnh Tai xanh và khẳng định vị thế của khoa học công nghệ sinh học Việt Nam trên trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1. Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) Khái niệm: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn do virus thuộc họ Arteriviridae gây ra. Lợn bị nhiễm virus này có biểu hiện rối loạn hô hấp và sinh sản trên mọi lứa tuổi với các triệu chứng chủ yếu là bỏ ăn hàng loạt, hắt hơi, sổ mũi, tăng tần số hô hấp, thở khó, lợn con thường có tỷ lệ chết cao, lợn trưởng thành tỷ lệ chết thấp hơn nhưng thường bị đồng nhiễm thêm các loại vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh ở hệ hô hấp.

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận vào năm 1987 ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota. Năm 1988 bệnh lan sang Canada. Sau đó bệnh xuất hiện ở Đức năm 1990; Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ và Anh năm 1991 và ở Pháp năm 1992 (Benfield D et al. Từ khi xuất hiện đến nay, bệnh đã được gọi với nhiều tên khác nhau.

Thời gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên gọi bệnh này là Bệnh bí hiểm ở lợn (MDS). Một số tác giả khác căn cứ vào bệnh tích ở tai gọi tên bệnh Tai xanh (BED) hoặc căn cứ vào các đặc điểm trên lợn mắc virus PRRS như sảy thai, đẻ non, chết non, sức sống yếu ớt, tỷ lệ chết của lợn con cao và rối loạn hô hấp trên đàn lợn (Keffaber, 1989; Loula, 1991) gọi tên là Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (PEARS). Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế tổ chức tại Minesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine respiratory and reproductive syndrome-PRRS), đây là tên gọi chính thức của bệnh. Hàng năm ước tính chi phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở Mỹ là 560 triệu USD cho PRRS (Neumann et al.

Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam +Tình hình PRRS trên thế giới Theo báo cáo của tổ chức Thú y thế giới (2014), virus PRRS type 2 xuất hiện ở Trung Quốc và lan rộng khắp Châu Á (Đông, Nam và Bắc Á): Bhutan, 6 Campuchia, Trung Quốc, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Philippine, Nga, Singapore, Việt Nam. Sự phân bố của các type PRRSV trên thế giới (Nguồn: http://www.com/wps/portal/hipra/prrscontrol/prrs-knowledge/porcine- reproductive-and-respiratory-syndrome) Đại dịch PRRS bùng phát lây lan nhanh hơn 10 tỉnh thành của Trung Quốc làm chết 2.000 con lợn, trong đó có hơn 400.000 sảy thai, đẻ non. Trong năm 2007 PRRS đã xảy ra ở trên 25 tỉnh, với trên 180.000 lợn mắc bệnh và 45. Qua một số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta đã xác định virus PRRS tại Trung Quốc thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường độc gây ra (Tian et al.

Ở Hàn Quốc, PRRS ở lợn chủ yếu do 2 chủng virus thuộc type EU-1 và type 2 (Bắc mỹ) gây ra (Yeom et al. Từ 4/2012 đến 8/2013 (Marinou et al., 2015) đã thu thập 359 mẫu huyết thanh từ lợn rừng tại các địa phương khác nhau thuộc Hy Lạp để xác định tỷ lệ lưu hành một số mầm bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trong đó có hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Kết quả cho thấy 5,6% số mẫu dương tính với virus PRRS. Từ năm 2008 đến năm 2013 (Jantafong et al., 2015) cho biết: hàng năm có khoảng 13,86% số lợn ở Thái Lan nhiễm virus hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp.

7 Năm 2008, virus PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Thái Lan và Campuchia, 2 năm sau đó, nó trở thành nguyên nhân gây bùng phát dịch tại 2 nước này. Tornimbene et al. Các vụ dịch hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thường xuyên diễn ra ở Trung Quốc và Việt Nam gây nguy cơ lây nhiễm cao đến đàn lợn của Campuchia. Năm 2010, các tác giả đã nghiên cứu tình hình bệnh PRRS ở lợn tại tỉnh Takeo giáp biên giới Việt Nam và cho biết trên 85% số đàn lợn được điều tra có lợn nhiễm virus PRRS.

Trong vòng 3 năm, tại 140 trang trại thuộc miền Bắc Italia (Salogni et al., 2016) đã phát hiện 323 lợn bị xảy thai do virus, có nhiều loại virus đã được đề cập đến trong đó có 108 lợn bị xảy thai do nhiễm virus PRRS. Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên hầu hết các châu lục đều đã báo cáo về sự lưu hành của virus PRRS. Đặc biệt, kể từ năm 2006-2007, một biến chủng mới của virus PRRS xuất hiện ở Trung Quốc có độc lực cao và nhanh chóng lan rộng ra nhiều nước ở Châu Á gây ra hàng loạt vụ dịch (Tian et al. Vụ dịch PRRS làm chết hàng triệu lợn đã bùng phát từ năm 2006 (Zhou and Yang, 2010).

Trường hợp PRRS đầu tiên xuất hiện gây bùng phát dịch ở Việt Nam vào đầu năm 2007 (Feng et al., 2008; Metwally et al., 2010) sau đó lan sang các nước Đông Nam Á khác như Lào, Philippines, Cambodia v.v… (Jantafong et al., 2015; Ni et al., 2012; Tornimbene et al. Hiện nay, Tổ chức Thú Y thế giới đã có qui trình chẩn đoán, giám sát và dự phòng đối với hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. (Nguồn: http://www.int/fileadmin/Home/eng/Ourscientificexpertise/docs/pdf/PRRS guide web bulletin.pdf) + Tình hình PRRS tại Việt Nam Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam được phát hiện đầu tiên trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997, kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu đó có huyết thanh dương tính với PRRS, toàn bộ số lợn này đã được xử lý. Từ tháng 3/2007 đến 2008, PRRS gây thành đại dịch tại nhiều địa phương trên cả nước làm tổn thất lớn về kinh tế cho 8 người chăn nuôi, hàng triệu con lợn đã mắc PRRS và bị tiêu hủy.

Kết quả chẩn đoán và nghiên cứu virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam từ 2007 đến 2008 cho thấy, số lợn mắc PRRS tăng lên, các virus PRRS phân lập từ các ổ dịch lợn mắc PRRS có mức độ tương đồng cao so với virus PRRS chủng độc lực cao của Trung Quốc. Bệnh phẩm chứa virus có khả năng gây chết lợn thí nghiệm 100% cũng cho thấy virus hoặc vi khuẩn đồng nhiễm đóng vai trò quan trọng, gây tỷ lệ chết cao trên thực địa (Tô Long Thành và cs., 2008) Từ 2009 đến 2015 tình hình dịch PRRS diễn ra vẫn phức tạp, dịch còn xảy ra ở nhiều tỉnh trên cả nước. Từ 2016 đến 2019 cả nước không xuất hiện dịch PRRS, tuy nhiên còn tiềm ẩn và nguy cơ phát sinh cao do virus PRRS vẫn tồn tại trong môi trường chăn nuôi, vận chuyển buôn bán, giết mổ, tiêu thụ thịt lợn ngày càng gia tăng. Biện pháp phòng bệnh hiệu quả là tổ chức tiêm phòng triệt để cho đàn lợn và áp dụng nghiêm ngặt các biện pháp vệ sinh phòng bệnh, chăn nuôi an toàn sinh học.

Tháng 10/2020 xuất hiện trở lại ổ dịch PRRS tại huyện Lý Nhân tỉnh Hà Nam, tại Nghệ An trong năm 2020 cũng có ổ dịch thuộc các huyện: Nam Đàn, Tân Kỳ, Nghĩa Đàn và thị xã Thái Hòa. Các Sở, ngành, địa phương nơi xảy ra dịch đã tập trung triển khai quyết liệt, đồng bộ các biện pháp cấp bách phòng PRRS. Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 Số lợn mắc Số lợn bị Năm Tỉnh Quận/Huyện Xã/Phường PRRS tiêu hủy 2007 14 65 324 70.235 2016 1 1 2 72 Không rõ (Nguồn: Cục Thú y 2016) PRRS thường xảy ra trên lợn ở mọi lứa tuổi với đặc trưng làm cho lợn ốm, sốt cao, lợn con theo mẹ và lợn nái chửa giai đoạn cuối chết nhanh và nhiều hơn so với lợn thịt và lợn đực giống. 9 Dịch lây lan nhanh chủ yếu là do phát hiện chậm hoặc dấu dịch, người chăn nuôi bán lợn mắc bệnh, do không kiểm soát được vận chuyển lợn ốm từ vùng có dịch sang vùng không có dịch.

Nguyên nhân chính là do chăn nuôi lợn ở nước ta chủ yếu là nhỏ lẻ nên khó kiểm soát dịch, nhận thức của người chăn nuôi, buôn bán, giết mổ lợn về công tác phòng, chống dịch còn nhiều hạn chế. Nhiều chủ gia súc chăn nuôi không tiêm phòng hoặc tiêm phòng các bệnh đỏ (dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và phó thương hàn lợn) đạt tỷ lệ thấp, hầu hết các hộ chăn nuôi không áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, việc chấp hành Pháp lệnh Thú y chưa triệt để. Hiện nay, với công tác phòng dịch bằng vaccine và xử lý kịp thời khi có dấu hiệu dịch nên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đã được kiểm soát. Ở Việt Nam cũng đã ban hành qui trình chẩn đoán, giám sát hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (TCVN 8400-21: 2014).

Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ước tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng. Lý do cho việc này vẫn chưa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng. Mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lượng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao có thể tái sản trong cơ thể ký chủ.

+ Biểu hiện bệnh Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp có biểu hiện đặc trưng là vô sinh, chết thai muộn, sảy thai, đẻ non và sinh ra lợn con yếu ớt, lợn con thường chết sớm sau khi sinh do bệnh đường hô hấp. Lợn lớn hơn có thể biểu hiện các triệu chứng nhẹ của bệnh đường hô hấp, thường phức tạp thêm do đồng nhiễm virus, vi khuẩn khác gây bệnh trên lợn. Ở lợn nọc và lợn nái (hậu bị) có thể quan sát thấy sốt và biếng ăn tạm thời, khó thở (thoi thóp), lờ đờ. Mọi lứa tuổi lợn đều cảm nhiễm với virus, mầm 10 bệnh thường tồn tại lâu trong đàn nái.

Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai. Lợn rừng mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm virus, có thể phát bệnh, nhưng cũng có thể không phát bệnh, đây có thể coi là nguồn tàng trữ bệnh tự nhiên rất nguy hiểm.