Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc và đánh giá khả năng sản xuất vaccine

• Tác giả: Nguyễn Thị Nga
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ sinh học
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.2. Lịch sử xuất hiện hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
• 1.3. Tình hình PRRS trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS
• 1.5. Bệnh tích PRRS
• 1.6. Tác nhân gây bệnh và con đường truyền lây PRRS
• 1.7. Cơ chế bệnh sinh
• 1.8. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
• 1.9. Nguồn gốc, phân loại virus PRRS
• 1.10. Cấu trúc, chức năng hệ gen virus PRRS
• 1.11. Đa dạng di truyền hệ gen virus PRRS
• 1.12. Các protein kháng nguyên quan trọng của virus PRRS
• 1.13. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm
• 1.14. Sức đề kháng của virus PRRS
• 1.15. Đặc điểm nuôi cấy virus PRRS
• 1.16. Nghiên cứu tạo vaccine PRRS
• 1.17. Các loại vaccine được nghiên cứu phòng PRRS
• 1.18. Một số nghiên cứu về vaccine PRRS ở Việt Nam
• 1.19. Nghiên cứu tạo vaccine nhược độc phòng PRRS
• 1.20. Giống gốc trong sản xuất vaccine
• 1.21. Yêu cầu của giống gốc
• 1.22. Một số phương pháp bảo quản giống gốc virus PRRS
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp mổ khám. Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
• 2.4. Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
• 2.5. Xử lý bệnh phẩm
• 2.6. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
• 2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 2.8. Phương pháp nhân virus PRRS
• 2.9. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 2.10. Phương pháp cấy truyền virus PRRS
• 2.11. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus
• 2.12. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng)
• 2.13. Phương pháp Realtime RT-PCR
• 2.14. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.15. Phương pháp RT-PCR. Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen
• 2.16. Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ
• 2.17. Phương pháp điện di
• 2.18. Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể
• 2.19. Phương pháp đếm tế bào Marc 145
• 2.20. Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.2. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.3. Khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm
• 3.4. Kết quả kiểm tra bệnh tích ở lợn thí nghiệm
• 3.5. Kiểm tra virus huyết ở lợn thí nghiệm
• 3.6. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
• 3.7. Kiểm tra đặc tính nhân lên của virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145
• 3.8. Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc 145
• 3.9. Đánh giá đặc tính nhân lên của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền trên tế bào Marc 145
• 3.10. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền
• 3.11. Kiểm tra độc lực của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80
• 3.12. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng virus Hanvet1.vn nhược độc và chủng 02HY cường độc
• 3.13. Khuếch đại các đoạn gen thuộc hệ gen virus PRRS
• 3.14. Tách dòng các đoạn gen khuếch đại
• 3.15. Kết quả giải mã, phân tích hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc
• 3.16. Phân tích so sánh gen chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và thế giới
• 3.17. Đánh giá đặc tính giống gốc chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc
• 3.18. Kiểm tra thuần khiết
• 3.19. Kết quả kiểm tra tính an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn
• 3.20. Khả năng kích thích sinh kháng thể của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc
• 3.21. Đánh giá đặc tính ổn định của giống gốc virus PRRS Hanvet1
• 3.22. Nghiên cứu điều kiện bảo quản giống gốc (Master seed)
• 3.23. Đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch ở lợn sau khi tiêm vaccine nhược độc được chế tạo từ giống gốc Hanvet1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Về nghiên cứu đánh giá độc lực chủng virus PRRS 02HY cường độc Việt Nam chọn làm chủng ứng viên để tạo virus giống gốc PRRS nhược độc
• 4.2. Về nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp trên môi trường tế bào Marc 145
• 4.3. Về đánh giá giống gốc Hanvet1.vn nhược độc sử dụng cho chế tạo vaccine PRRS
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về virus PRRS và tình hình nghiên cứu

Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là tác nhân gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Virus PRRS được phát hiện lần đầu vào năm 1987 và hiện đã trở thành dịch địa phương ở nhiều quốc gia. Tại Việt Nam, từ năm 2007, virus PRRS đã bùng phát thành dịch, gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng. Nghiên cứu virus PRRS tập trung vào việc phân loại, cấu trúc gen, và cơ chế gây bệnh. Virus PRRS gây bệnh thông qua việc tấn công hệ thống miễn dịch của lợn, dẫn đến các triệu chứng như sảy thai, viêm phổi và suy hô hấp. Công nghệ vaccine hiện nay chủ yếu dựa trên việc sử dụng chủng virus nhược độc để tạo miễn dịch. Tuy nhiên, sự khác biệt di truyền giữa các chủng virus PRRS ở các vùng địa lý khác nhau làm giảm hiệu quả của vaccine nhập khẩu. Do đó, việc phát triển vaccine từ chủng virus PRRS bản địa là cần thiết.

1.1. Lịch sử và phân loại virus PRRS

Virus PRRS thuộc họ Arteriviridae, được chia thành hai genotype chính: Bắc Mỹ và Châu Âu. Sự khác biệt di truyền giữa hai genotype này lên đến 40%, dẫn đến sự đa dạng trong virus gây bệnh PRRS. Tại Việt Nam, virus PRRS thuộc genotype Châu Á, có đặc điểm di truyền và khả năng gây bệnh riêng biệt. Nghiên cứu virus PRRS đã chỉ ra rằng, sự đa dạng di truyền này ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của vaccine PRRS. Do đó, việc phân loại và nghiên cứu sâu về chủng virus PRRS là bước quan trọng trong phát triển vaccine.

1.2. Tình hình dịch bệnh PRRS tại Việt Nam

Từ năm 2007, virus PRRS đã gây ra nhiều đợt dịch tại Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc. Virus PRRS gây bệnh với các triệu chứng như sảy thai, viêm phổi và tỷ lệ tử vong cao ở lợn con. Nghiên cứu virus PRRS tại Việt Nam đã chỉ ra rằng, sự lưu hành của chủng virus PRRS địa phương là nguyên nhân chính gây ra dịch bệnh. Việc thiếu vaccine PRRS hiệu quả và giá thành cao của vaccine nhập khẩu đã làm tăng nhu cầu sản xuất vaccine từ chủng virus nhược độc bản địa.

II. Phương pháp nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc

Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc được thực hiện thông qua quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS cường độc trên tế bào Marc 145. Chủng virus PRRS 02HY được chọn làm ứng viên để tạo chủng virus nhược độc do đặc tính gây bệnh mạnh và khả năng nhân lên ổn định trên tế bào. Quá trình cấy truyền liên tiếp 80 đời đã làm giảm độc lực của virus PRRS, tạo ra chủng virus nhược độc Hanvet1.vn. Công nghệ sản xuất vaccine dựa trên chủng virus nhược độc này đã được đánh giá về tính an toàn, hiệu quả và khả năng kích thích miễn dịch.

2.1. Quá trình cấy truyền và tạo chủng nhược độc

Quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145 đã làm giảm độc lực của virus. Sau 80 đời cấy truyền, chủng virus nhược độc Hanvet1.vn được tạo ra, có hiệu giá virus đạt 106,63 TCID50. Chủng virus nhược độc này đáp ứng các tiêu chuẩn về tính an toàn và khả năng kích thích miễn dịch, phù hợp cho sản xuất vaccine PRRS.

2.2. Đánh giá đặc tính sinh học và phân tử

Chủng virus nhược độc Hanvet1.vn được đánh giá về đặc tính sinh học và phân tử. Kết quả giải trình tự gen cho thấy, chủng virus nhược độc có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin so với chủng virus cường độc ban đầu. Tuy nhiên, gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 không thay đổi, đảm bảo tính kháng nguyên của vaccine PRRS. Công nghệ vaccine dựa trên chủng virus nhược độc này đã được chứng minh là hiệu quả và an toàn.

III. Ứng dụng chủng virus nhược độc trong sản xuất vaccine

Chủng virus nhược độc Hanvet1.vn đã được ứng dụng trong sản xuất vaccine PRRS. Vaccine PRRS được tạo ra từ chủng virus nhược độc này đã được đánh giá về tính an toàn, hiệu quả và khả năng kích thích miễn dịch. Kết quả cho thấy, vaccine PRRS có hiệu giá kháng thể cao, đạt 1/4.305,389, và độ dài miễn dịch kéo dài đến 6 tháng. Ứng dụng công nghệ vaccine này đã mở ra triển vọng lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam.

3.1. Đánh giá hiệu quả của vaccine PRRS

Vaccine PRRS được sản xuất từ chủng virus nhược độc Hanvet1.vn đã được đánh giá về hiệu quả bảo hộ. Kết quả cho thấy, vaccine PRRS có khả năng kích thích miễn dịch mạnh, với hiệu giá kháng thể đạt 1/4.305,389. Ứng dụng vaccine này đã giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở lợn, đặc biệt là trong các đợt dịch PRRS.

3.2. Triển vọng phát triển vaccine PRRS tại Việt Nam

Việc sản xuất vaccine PRRS từ chủng virus nhược độc bản địa đã mở ra triển vọng lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam. Công nghệ sản xuất vaccine này không chỉ giảm chi phí mà còn tăng hiệu quả bảo hộ, phù hợp với đặc điểm di truyền của virus PRRS lưu hành tại Việt Nam. Phát triển vaccine từ chủng virus nhược độc là bước tiến quan trọng trong việc chủ động phòng chống dịch bệnh PRRS.