HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG QUANG BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA spp.) THU THẬP TẠI QUẢNG NINH NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP- 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG QUANG BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA spp.) THU THẬP TẠI QUẢNG NINH CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 9620110 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO TS. NGUYỄN VĂN PHÚ HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu trong luận án là hoàn toàn trung thực, khách quan, chƣa từng đƣợc tập thể, cá nhân công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án này đã đƣợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Đặng Quang Bích i LỜI CẢM ƠN Sau hơn 03 năm học tập, nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trong quá trình thực hiện luận án tại bộ môn Sinh lý Thực vật và bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật, nhờ sự hƣớng dẫn và tận tình giúp đỡ của các thầy cô giáo, cùng các cán bộ tại phòng thí nghiệm của bộ môn, với sự nỗ lực, học tập, nghiên cứu của bản thân, tôi đã hoàn thành luận án nghiên cứu của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Quản lý đào tạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Nông học, khoa Công nghệ Sinh học và các thầy cô giáo đã hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.
Nguyễn Thị Phƣơng Thảo; TS. Nguyễn Văn Phú đã tận tình hƣớng dẫn chỉ bảo và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Trƣờng Sơn, Ths.
Ninh Thị Thảo, Ths. Nguyễn Thị Thùy Linh; TS. Hoàng Hải Hà; Ths. Phạm Thị Thu Hằng đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ nghiên cứu thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới các em sinh viên cùng toàn thể bạn bè và các anh, chị đang thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý Thực vật, bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật và phòng thí nghiệm Hóa sinh khoa Công nghệ Thực phẩm đã hợp tác, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, những ngƣời thân luôn động viên, hỗ trợ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2018. Tác giả Đặng Quang Bích ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN 1.
Tính cấp thiết của đề tài 1 1. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3 1. Những đóng góp mới của luận án 3 1.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2. Giới thiệu về chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp. Nguồn gốc chi trà Camellia 4 2.
Đặc điểm hình thái thực vật học chi trà Camellia 5 2. Đặc điểm phân bố chi trà Camellia 8 2. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện và sự phân bố trà hoa vàng (Camellia spp. Những nghiên cứu về chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) trên thế giới 13 2.
Những nghiên cứu về đa dạng di truyền và nhân giống chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp. Nghiên cứu về giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) trên thế giới 20 2. Những nghiên cứu về chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp. Những nghiên cứu về đa dạng di truyền, nhân giống chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.
Giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp. Một số đặc điểm về trà hoa vàng Camellia spp. tại Quảng Ninh 38 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 3.
Đối tƣợng nghiên cứu 41 3. Vật liệu nghiên cứu 41 3. Nội dung nghiên cứu 42 3. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 3.
Phƣơng pháp thu thập mẫu, mô tả đặc điểm hình thái và xác định thành phần hàm lƣợng một số hợp chất 42 3. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây trà hoa vàng thu thập đƣợc bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử 44 3. Phƣơng pháp nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh 47 3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 58 PHẦN 4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 4. Thu thập nguồn gen cây trà hoa vàng tại tỉnh Quảng Ninh và đánh giá đặc điểm hình thái thực vật và hóa sinh của chúng 59 4. Thu thập nguồn gen và đánh giá đặc điểm hình thái thực vật cây trà hoa vàng (Camellia spp.) tại Quảng Ninh. Hàm lƣợng một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong lá và nụ hoa cây trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại tỉnh Quảng Ninh 65 4.
Đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng thu thập đƣợc bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử 75 4. Kết quả phân tích đa dạng kiểu hình mẫu giống trà hoa vàng thu thập 76 4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng bằng chỉ thị RAPD và ISSR 78 4. Xây dựng qui trình nhân giống cây trà hoa vàng 86 4.
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây trà hoa vàng 87 4. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây trà hoa vàng bằng phƣơng pháp giâm cành 105 iv PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119 5. Kiến nghị 119 Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 121 Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục 143 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt (tiếng Anh) AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism.
BLAST Basic Local Alignment Search Tool. BA Benzyl adenine C Catechin CF Caffeic acid CV(%) Coefficient of variation (%) CR Coumarin Ct Công thức Cs Cộng sự CP Cổ phần CK Chất khô C00 Chu vi gốc DPPH 2,2 - Diphenyl -1 - picrylhydrazyl D00 Đƣờng kính gốc D1.3 Đƣờng kính thân ngang ngực Đc Đối chứng EC Epicatechin EGCG Epigallocatechin 3-gallate ECG Epicatechin 3-gallate GA3 Gibberellic acid HSN Hệ số nhân HPLC High performance Liquid Chromatography Hvn Chiều cao vút ngọn IUCN International Union for Conservation of Nature ISSR Inter Simple Sequence Repeat. IBA Indol butyric acid Ki Kinetin LSD0.05 Least significant different 5% MS Murashige and Skoog vi MAS Marker Assisted Selection ND Nƣớc dừa NCBI National Center for Biotechnology information. PCR Polymerase Chain Reaction.
PCA P - Coumaric acid QC Quercetin RES Resveratrol RAPD Random Amplified Polymorphism DNA. RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism. RP Resolving power RT Rutin VA Vanilic acid SSR Simple Sequence Repeat. SLA Salicylic acid Tm Nhiệt độ gắn mồi.
THT Than hoạt tính TB Trung bình TNHH Trách nhiệm hữu hạn WPM Wooden plant medium α – NAA Axit α - naphtyl axetic vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3. Danh sách 25 mẫu giống trà hoa vàng dùng trong đánh giá đa dạng di truyền 41 3. Chế độ gradient với 2 kênh A và kênh B 44 3. Danh sách mồi sử dụng trong RADP và ISSR 44 3.
Thành phần phản ứng RAPD - PCR và ISSR - PCR 46 3. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 46 4. Kết quả tính chiều cao vút ngọn trung bình cây trà hoa vàng của 12 tuyến thu thập 60 4. Kết quả tính đƣờng kính gốc trung bình cây trà hoa vàng của 12 tuyến thu thập 61 4.
Các chỉ tiêu về lá cây trà hoa vàng của 12 tuyến thu thập 63 4. Danh sách mẫu lá và nụ hoa trà hoa vàng thu thập tại Quảng Ninh đƣợc sử dụng cho phân tích hợp chất có hoạt tính sinh học 66 4. Hàm lƣợng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin và quercetin trong lá trà hoa vàng 68 4. Hàm lƣợng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol và coumarin trong lá trà hoa vàng 70 4.
Hàm lƣợng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin và quercetin trong nụ hoa trà hoa vàng 73 4. Hàm lƣợng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol và coumarin trong nụ hoa trà hoa vàng 74 4. Đa hình của 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa trên chỉ thị RAPD và ISSR 80 4. Hệ số tƣơng đồng di truyền của 25 mẫu giống trà hoa vàng 83 4.
Hiệu quả tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn cành mang mắt ngủ 88 4. Ảnh hƣởng của vật liệu nuôi cấy tới hiệu quả tạo nguồn vật liệu ban đầu 90 4. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và GA3 tới sự nảy mầm của hạt trà hoa vàng 92 4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền tới sự sinh trƣởng của chồi trà hoa vàng 94 4.
Ảnh hƣởng của tổ hợp các chất điều tiết sinh trƣởng tới khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa vàng 95 viii 4. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa tới khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa vàng 98 4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng môi trƣờng đến khả năng ra rễ của chồi in vitro cây trà hoa vàng 99 4. Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng thích nghi của cây in vitro ngoài vƣờn ƣơm 101 4.
Ảnh hƣởng của tuổi cây in vitro tới khả năng thích nghi của cây ngoài vƣờn ƣơm. Ảnh hƣởng của biện pháp xử lý đến tỷ lệ sống của cành giâm trà hoa vàng 106 4. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cành giâm trà hoa vàng 108 4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến tỷ lệ ra rễ của cành giâm trà hoa vàng 109 4.
Ảnh hƣởng của chế phẩm giâm chiết cành đến tỷ lệ hom giâm tạo chồi 111 4. Ảnh hƣởng của thời vụ giâm đến khả năng ra rễ của cành giâm cây trà hoa vàng 113 4. Ảnh hƣởng của che sáng đến sinh trƣởng của cây con trà hoa vàng trong giai đoạn vƣờn ƣơm 114 4. Ảnh hƣởng của số lần bón phân đến sinh trƣởng của cây trà hoa vàng trong vƣờn ƣơm 115 4.
Ảnh hƣởng của thời gian đảo bầu đến sinh trƣởng của cây giống trong giai đoạn vƣờn ƣơm. 117 ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2. Hình dạng chóp lá 7 2.
