Luận án hiệu quả lựa chọn phôi kết hợp PGT-A và time-lapse trong TTTON - Trường Đại học Y Hà Nội

Nghiên cứu hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm khi kết hợp kỹ thuật PGT-A và time-lapse nhằm tối ưu hóa lựa chọn phôi và nâng cao tỷ lệ đậu thai.

• Tác giả: Diêm Thị Yến
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Khang Sơn
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Mô phôi thai học
• Đề tài: Nghiên cứu hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm của phương pháp lựa chọn phôi dựa trên kết hợp kỹ thuật PGT-A và time-lapse
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2026
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về lựa chọn phôi kết hợp PGT A và time lapse trong TTTON

Thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) hiện đại đòi hỏi các tiêu chuẩn khắt khe về đánh giá phôi. Mục tiêu cốt lõi là chọn ra một phôi duy nhất có khả năng phát triển tối ưu. Trước đây, đánh giá hình thái tĩnh theo tiêu chuẩn Gardner là phương pháp phổ biến nhất. Phương pháp này chỉ quan sát phôi tại một số thời điểm cố định. Kỹ thuật viên không thể theo dõi liên tục tiến trình phân chia tế bào. Do đó, các bất thường phân chia dễ bị bỏ sót. Nghiên cứu tại Trường Đại học Y Hà Nội ghi nhận sự cần thiết của việc cải tiến kỹ thuật. Sự kết hợp giữa xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGT-A và hệ thống nuôi cấy time-lapse tạo ra bước đột phá mới. PGT-A giúp phân tích bộ nhiễm sắc thể của tế bào lá nuôi. Time-lapse cung cấp dữ liệu hình ảnh động học phôi theo thời gian thực. Việc tích hợp cả hai công nghệ mang lại cái nhìn toàn diện về chất lượng phôi. Chuyên viên y tế có thể đánh giá đồng thời tiềm năng di truyền và động học phát triển. Giải pháp này giúp tối ưu hóa tỷ lệ thụ thai, giảm thiểu tỷ lệ sảy thai và rút ngắn thời gian điều trị cho các cặp vợ chồng hiếm muộn.

1.1. Vai trò của kỹ thuật PGT A trong sàng lọc lệch bội

PGT-A là kỹ thuật xét nghiệm di truyền tiền làm tổ nhằm phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể. Phôi lệch bội là nguyên nhân hàng đầu gây thất bại làm tổ và sảy thai tự nhiên. Kỹ thuật này thực hiện sinh thiết từ 4 đến 8 tế bào lá nuôi ngoại bì của phôi nang ngày 5 hoặc ngày 6. Khối tế bào mầm phôi bên trong được bảo tồn an toàn. Sau đó, mẫu tế bào được giải trình tự gen thế hệ mới để xác định số lượng nhiễm sắc thể. Kết quả PGT-A phân loại rõ ràng phôi nguyên bội, lệch bội hoặc thể khảm. Việc loại trừ các phôi lệch bội giúp tăng cơ hội sinh con khỏe mạnh. Đây là nền tảng vững chắc trong quy trình điều trị thụ tinh trong ống nghiệm hiện đại.

1.2. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy và theo dõi time lapse

Hệ thống time-lapse là công nghệ tủ cấy tích hợp kính hiển vi và camera chụp ảnh tự động. Thiết bị chụp ảnh phôi định kỳ từ 5 đến 10 phút một lần. Phôi được nuôi cấy trong môi trường ổn định liên tục. Kỹ thuật viên không cần đưa phôi ra ngoài môi trường tủ cấy để kiểm tra. Điều này hạn chế tối đa sốc nhiệt độ và biến đổi độ pH. Dữ liệu hình ảnh được phần mềm chuyên dụng xử lý thành video tua nhanh. Các thông số động học hình thái như thời điểm phân chia và tạo khoang được ghi nhận chính xác. Nhờ đó, phôi học viên nhận diện sớm các kiểu phân chia bất thường. Công nghệ time-lapse cung cấp nguồn dữ liệu khách quan để xếp hạng chất lượng phôi nuôi cấy.

II. Vấn đề lựa chọn phôi kết hợp PGT A và time lapse trong TTTON

Đánh giá phôi trong hỗ trợ sinh sản đối mặt với nhiều thách thức lớn. Phương pháp đánh giá hình thái Gardner truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế khách quan. Nhiều phôi có hình thái bên ngoài rất đẹp nhưng lại mang bất thường di truyền. Ngược lại, một số phôi có điểm hình thái trung bình vẫn có thể nguyên bội. Hình thái tĩnh không phản ánh được toàn bộ bản chất sinh học bên trong. Bên cạnh đó, việc thực hiện PGT-A đơn độc cũng tồn tại rào cản nhất định. Quá trình sinh thiết phôi nang đòi hỏi xâm lấn và kỹ thuật cao. Chi phí xét nghiệm di truyền còn đắt đỏ đối với nhiều bệnh nhân. Hơn nữa, PGT-A chỉ cung cấp thông tin di truyền tại thời điểm sinh thiết. Phương pháp này không thể ghi nhận các sai sót trong quá trình phân chia sớm. Đồng thời, theo dõi time-lapse đơn thuần cũng không thể thay thế xét nghiệm di truyền. Dữ liệu động học hình thái giai đoạn sớm không đủ độ nhạy để khẳng định tính nguyên bội. Khi xuất hiện từ hai bất thường phân chia trở lên, tỷ lệ nguyên bội sụt giảm nghiêm trọng. Việc thiếu sự phối hợp chặt chẽ giữa hai công cụ này dẫn đến nguy cơ chọn nhầm phôi chuyển, kéo dài thời gian mong con.

2.1. Hạn chế của phương pháp đánh giá hình thái tĩnh truyền thống

Đánh giá hình thái tĩnh là phương pháp quan sát phôi dưới kính hiển vi quang học. Bác sĩ phôi học chấm điểm khoang phôi nang, khối ICM và lớp lá nuôi TE. Tuy nhiên, phương pháp này mang tính chủ quan cao giữa các quan sát viên. Việc đưa phôi ra khỏi tủ cấy gây biến động môi trường sống của phôi. Đặc biệt, hình thái không phản ánh được tình trạng nhiễm sắc thể của phôi. Nghiên cứu thực tế chỉ ra nhiều phôi nang loại xuất sắc vẫn bị lệch bội di truyền. Nếu chỉ dựa vào hình thái, tỷ lệ phôi chuyển thất bại vẫn ở mức đáng kể. Do đó, các trung tâm hỗ trợ sinh sản cần công cụ đánh giá chuyên sâu hơn.

2.2. Mối liên quan giữa bất thường phân chia và di truyền phôi

Dữ liệu time-lapse cho thấy các hiện tượng phân chia tế bào bất thường diễn ra khá phổ biến. Điển hình là phân chia trực tiếp từ 1 tế bào thành 3 tế bào hoặc phân chia hỗn loạn. Những phôi có hiện tượng này thường có tiềm năng phát triển thành phôi nang rất kém. Nghiên cứu của Diêm Thị Yến chỉ ra rằng khi có từ hai bất thường phân chia cùng xuất hiện, tỷ lệ nguyên bội giảm xuống còn 27,6%. Động học phôi giai đoạn sớm giúp dự đoán khả năng tạo phôi nang nhưng chưa phản ánh đầy đủ bộ nhiễm sắc thể. Ngược lại, các mốc động học giai đoạn muộn có mối tương quan chặt chẽ với tình trạng nguyên bội của phôi.

III. Phương pháp lựa chọn phôi kết hợp PGT A và time lapse trong TTTON

Quy trình phối hợp PGT-A và time-lapse thiết lập chuẩn mực mới trong chọn lọc phôi thụ tinh trong ống nghiệm. Phương pháp này kết hợp phân tích bộ gen chuẩn xác với giám sát động học hình thái liên tục. Toàn bộ tiến trình nuôi cấy phôi từ ngày 1 đến ngày 6 được camera time-lapse tự động ghi lại. Các mốc thời gian then chốt bao gồm thời điểm bắt đầu tạo khoang phôi nang (tSB) và thời điểm khoang phôi nở rộng (tEB). Khoảng thời gian hiệu số giữa tEB và tSB đóng vai trò như chỉ dấu sinh học dự đoán tiềm năng nguyên bội. Khi phôi đạt đến giai đoạn phôi nang mở rộng chất lượng tốt, chuyên viên tiến hành sinh thiết tế bào lá nuôi. Mẫu tế bào được đưa đi phân tích di truyền bằng kỹ thuật PGT-A nhằm loại trừ lệch bội. Mô hình hồi quy logistic tích hợp đồng thời các biến số động học và kết quả di truyền. Thuật toán này giúp xây dựng bảng điểm ưu tiên lựa chọn phôi chuyển. Phôi nguyên bội có động học phân chia đạt chuẩn được ưu tiên chuyển đơn phôi vào tử cung. Chiến lược tích hợp này tối đa hóa tỷ lệ phôi làm tổ và nâng cao độ an toàn điều trị.

3.1. Các mốc động học dự đoán tiềm năng nguyên bội của phôi

Dữ liệu nghiên cứu ghi nhận thời điểm phôi bắt đầu tạo khoang và nở rộng có ý nghĩa lâm sàng đặc biệt. Những phôi có mốc tSB dưới 96,2 giờ đạt tỷ lệ nguyên bội lên tới 48,2%. Ngược lại, nhóm phôi có tSB từ 96,2 giờ trở lên chỉ đạt tỷ lệ nguyên bội khoảng 36,6%. Thời điểm nở rộng khoang phôi nang cũng quyết định lớn đến chất lượng di truyền. Phôi nở rộng muộn với tEB trên 116 giờ khiến tỷ lệ nguyên bội sụt giảm còn 30%. Đặc biệt, khoảng thời gian hiệu số tEB trừ tSB không quá 13 giờ là dấu hiệu tiên lượng phôi nguyên bội vượt trội. Việc theo dõi sát sao các chỉ số này giúp phân tầng chất lượng phôi khách quan.

3.2. Mô hình hồi quy logistic tối ưu hóa lựa chọn phôi

Mô hình hồi quy logistic được xây dựng nhằm dự đoán xác suất nguyên bội của phôi nang trước khi sinh thiết. Thuật toán kết hợp các thông số động học chính gồm tSB, tEB và khoảng chênh lệch tEB-tSB. Nếu phôi xuất hiện từ hai bất thường động học trở lên, mô hình cảnh báo nguy cơ lệch bội cao. Hệ thống hỗ trợ chuyên viên phôi học phân loại thứ tự ưu tiên sinh thiết di truyền. Những phôi có điểm tiên lượng tốt được đưa vào xét nghiệm PGT-A trước. Phương pháp này giảm bớt gánh nặng chi phí xét nghiệm cho người bệnh mà vẫn giữ tỷ lệ thành công cao. Sự kết hợp toán học và y học nâng tầm độ chính xác trong điều trị hiếm muộn.

IV. Ứng dụng lựa chọn phôi kết hợp PGT A và time lapse trong TTTON

Nghiên cứu tại Trường Đại học Y Hà Nội khẳng định giá trị thực tiễn to lớn của việc phối hợp PGT-A và time-lapse. Mô hình tích hợp này mang lại bước tiến vượt bậc cho ngành hỗ trợ sinh sản Việt Nam. Bác sĩ lâm sàng sở hữu thêm cơ sở dữ liệu tin cậy để lựa chọn phôi chuyển thích hợp nhất. Tỷ lệ đậu thai lâm sàng tăng cao, trong khi nguy cơ đa thai và sảy thai giảm rõ rệt. Việc ứng dụng phương pháp tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện chiến lược chuyển đơn phôi (eSET). Bệnh nhân giảm bớt các biến chứng sản khoa nguy hiểm trong suốt thai kỳ. Thời gian chờ đợi để có một em bé khỏe mạnh chào đời được rút ngắn đáng kể. Trong tương lai, công nghệ trí tuệ nhân tạo (AI) kết hợp dữ liệu time-lapse và di truyền sẽ tiếp tục hoàn thiện. Các trung tâm IVF có thể tự động hóa quy trình phân tích và nâng cao độ chính xác sàng lọc. Đây là xu hướng tất yếu giúp nâng cao hiệu quả điều trị vô sinh hiếm muộn, đem lại niềm hạnh phúc trọn vẹn cho các gia đình.

4.1. Hiệu quả nâng cao tỷ lệ thành công khi chuyển đơn phôi

Chiến lược chuyển đơn phôi (eSET) đang trở thành tiêu chuẩn vàng trong điều trị thụ tinh ống nghiệm hiện đại. Nhờ kết hợp PGT-A và time-lapse, bác sĩ dễ dàng xác định phôi nang nguyên bội có động học tối ưu nhất. Tỷ lệ làm tổ của phôi được chuyển tăng lên rõ rệt qua từng chu kỳ điều trị. Đồng thời, phương pháp này hạn chế tối đa nguy cơ mang đa thai cho thai phụ. Đa thai thường đi kèm các rủi ro nguy hiểm như sinh non, tiền sản giật và nhẹ cân. Việc chuyển một phôi khỏe mạnh duy nhất bảo đảm an toàn cho cả mẹ và thai nhi. Kết quả điều trị mang lại tỷ lệ trẻ sinh sống chào đời khỏe mạnh cao hơn.

4.2. Định hướng ứng dụng lâm sàng tại Trường Đại học Y Hà Nội

Trường Đại học Y Hà Nội tiếp tục giữ vai trò tiên phong trong nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Quy trình phối hợp PGT-A và time-lapse được chuẩn hóa và chuyển giao vào thực tiễn lâm sàng. Nghiên cứu mở ra hướng đi mới giúp xây dựng các thuật toán phân tầng phôi phù hợp với thể trạng phụ nữ Việt Nam. Đội ngũ phôi học viên được đào tạo chuyên sâu về đọc dữ liệu động học kết hợp di truyền tế bào. Các trung tâm IVF có thể tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, giảm thiểu rủi ro sinh thiết không cần thiết. Đề tài luận án tiến sĩ tạo nền móng vững chắc cho việc cá thể hóa phác đồ điều trị hiếm muộn trong nước.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tỉ lệ thành công của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON/IVF) hiện nay vẫn duy trì ở mức tương đối thấp, với tỉ lệ trẻ sinh sống ước tính khoảng 30% trên mỗi chu kỳ chuyển phôi. Nhằm gia tăng cơ hội thụ thai, thực hành lâm sàng trước đây thường áp dụng chiến lược chuyển nhiều phôi trong một chu kỳ; tuy nhiên, điều này làm tăng đáng kể nguy cơ đa thai cùng các tai biến sản khoa nguy hiểm. Do đó, yêu cầu cấp thiết đặt ra trong chuyên ngành hỗ trợ sinh sản là xây dựng giải pháp lựa chọn phôi chuẩn xác nhằm tối ưu hóa kết quả lâm sàng, đồng thời hướng đến mục tiêu thực hiện chuyển một phôi duy nhất có chọn lọc (elective single embryo transfer - eSET).

Để giải quyết vấn đề lựa chọn phôi, hai kỹ thuật đã được phát triển và áp dụng phổ biến: xét nghiệm di truyền tiền làm tổ để sàng lọc phôi lệch bội (PGT-A) và hệ thống nuôi cấy, theo dõi phôi liên tục (time-lapse). PGT-A cho phép khảo sát cấu trúc di truyền, phát hiện các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể vốn là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiện tượng thất bại làm tổ và sảy thai tự nhiên sớm. Trong khi đó, hệ thống time-lapse ghi lại toàn bộ tiến trình phân chia của phôi, giúp chuyên viên phôi học phân tích các chỉ số động học hình thái (morphokinetics) và phát hiện các dạng phân chia bất thường mà phương pháp quan sát tĩnh truyền thống dễ bỏ sót.

Mặc dù vậy, việc sử dụng đơn lẻ từng kỹ thuật đều bộc lộ những giới hạn nhất định:

• Một phôi có hình thái và động học phát triển đạt tiêu chuẩn trên time-lapse vẫn có thể mang các sai hỏng lệch bội nhiễm sắc thể. Các nghiên cứu tổng quan hệ thống đã chứng minh các thông số động học hình thái không thể thay thế xét nghiệm di truyền trong việc dự đoán chính xác trạng thái lệch bội.
• Ngược lại, PGT-A là thủ thuật can thiệp xâm lấn tế bào lá nuôi (trophectoderm - TE) và không phản ánh trọn vẹn tiềm năng phát triển sinh học của từng phôi nang nguyên bội.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định: Về mặt lý thuyết, PGT-A giúp nhận diện nhóm phôi có năng lực di truyền tốt (genetically competent), sau đó dữ liệu time-lapse được dùng để xếp hạng và ưu tiên chuyển phôi nang có năng lực phát triển sinh học cao nhất (developmentally competent). Tuy nhiên, các bằng chứng lâm sàng về hiệu quả cải thiện tỉ lệ sinh sống của chiến lược phối hợp này còn hạn chế, và tại Việt Nam chưa có công trình nào đánh giá cụ thể hiệu quả sinh sống khi kết hợp hai kỹ thuật trên. Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Diêm Thị Yến được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống này với hai mục tiêu cụ thể:

1. Đánh giá đặc điểm phôi có phân tích di truyền PGT-A ở những trường hợp nuôi cấy và theo dõi phôi bằng time-lapse.
2. Đánh giá hiệu quả lâm sàng thụ tinh trong ống nghiệm của việc lựa chọn phôi bằng kỹ thuật PGT-A và time-lapse.

Nghiên cứu được triển khai trên nhóm bệnh nhân thực hiện chu kỳ TTTON tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc và Bộ môn Mô Phôi - Trường Đại học Y Hà Nội, hoàn thành năm 2026.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu trong luận án hệ thống hóa các hướng tiếp cận đánh giá chất lượng phôi từ hình thái học cổ điển đến sinh lý, di truyền và động học phát triển:

Các hệ thống đánh giá hình thái học phôi

Tên đồng thuận / Tổ chức	Năm ban hành	Quốc gia / Khu vực
British Fertility Society & Association of Clinical Embryologists (ACE)	2008	Vương quốc Anh
Society for Assisted Reproductive Technology (SART)	2010	Hoa Kỳ
Alpha Scientists in Reproductive Medicine & ESHRE Special Interest Group of Embryology	2011	Đa quốc gia (Đồng thuận Istanbul)
Spanish Society for professionals working in the IVF laboratory (ASEBIR)	2017	Tây Ban Nha

Đồng thuận Istanbul (2011) và thang phân loại phôi nang của David Gardner xác định các mốc thời gian quan sát chuẩn: ngày 1 (26 ± 1 giờ sau ICSI, giai đoạn 2 tế bào); ngày 2 (44 ± 1 giờ, 4 tế bào); ngày 3 (68 ± 1 giờ, 8 tế bào); ngày 4 (92 ± 2 giờ, phôi dâu) và ngày 5 (116 ± 2 giờ, phôi nang).

Hướng nghiên cứu sinh lý, chuyển hóa và biểu hiện gen

• Katz-Jaffe (2006) ghi nhận các phôi có cùng phân độ hình thái ở cùng một bệnh nhân vẫn có sự sai khác đáng kể về các hoạt động sinh lý.
• Gardner và cộng sự (2011) chứng minh mối liên quan giữa mức độ tiêu thụ glucose và tiềm năng tạo phôi nang ở người.
• McReynolds và cộng sự (2011) khảo sát proteome môi trường nuôi cấy và nhận thấy nồng độ lipocalin-1 gia tăng ở nhóm phôi nang lệch bội.
• Gardner (2001) và Brison và cộng sự (2004) phân tích metabolome, chỉ ra sự biến thiên hàm lượng các axit amin (alanine, arginine, glutamin, methionine, asparagine, glycine, leucine) trong dịch nuôi cấy tương quan với khả năng tạo phôi nang và kết cục thai lâm sàng.

Hướng nghiên cứu các mô hình và thuật toán time-lapse

Tác giả (Năm)	Cỡ mẫu (N)	Thiết kế	Thông số khảo sát chính
Meseguer và cs. (2011)	247 phôi	Quan sát	t5 (48,8–56,6 giờ), s2 (t4–t3 < 0,75 giờ); loại trừ phân chia trực tiếp, đa nhân
Azzarello và cs. (2012)	159 phôi	Quan sát	Thời điểm hòa nhập tiền nhân
Aguilar và cs. (2014)	899 phôi	Quan sát	Trục xuất thể cực 2, xuất hiện và biến mất tiền nhân
Athayde và cs. (2014)	122 phôi	Quan sát	Hòa nhập tiền nhân, bất thường phân chia lần đầu, phân chia hỗn loạn
VerMilyea và cs. (2014)	331 phôi	Quan sát	Khoảng thời gian P2 (t3–t2), P3 (t4–t3)
Basile và cs. (2015)	1.664 phôi	Quan sát	t3 (34–40 giờ), t3–t2 (9–12 giờ), t5 (45–55 giờ); loại trừ phân chia trực tiếp, đa nhân
Goodman và cs. (2016)	235 chu kỳ	Thử nghiệm RCT	Điểm trừ: cc2 < 5 giờ, phôi đa nhân, phân chia bất thường
Yang và cs. (2018)	600 chu kỳ	Thử nghiệm RCT	Nhận diện các dạng phân chia bất thường
Petersen và cs. (2018)	11.218 phôi	Quan sát	t3–tPNf, t5–t3, t3–t2
Fishel và cs. (2018)	781 phôi	Quan sát	Thời điểm bắt đầu tạo phôi nang và thời gian hoàn thành phôi nang
Kovacs và cs. (2019)	161 chu kỳ	Thử nghiệm RCT	cc1, cc2, s2, t5, tỉ lệ phân mảnh, không bào

Mô hình của Meseguer và cộng sự (2011) từng được kiểm chứng qua thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng quy mô lớn (n = 856), ghi nhận tỉ lệ thai diễn tiến với tỉ số chênh OR = 1,23 (khoảng tin cậy 95%: 1,06–1,43). Ngoài ra, hệ thống ghi nhận dữ liệu làm tổ đã biết (KID score) với 3.275 ca chuyển phôi ngày 3 và hệ thống iDAScore ứng dụng trí tuệ nhân tạo (AI) đã được phát triển trên tập dữ liệu đa trung tâm.

Hướng nghiên cứu mối liên quan giữa động học và tình trạng di truyền của phôi

Tác giả (Năm)	Giai đoạn đánh giá	Biến số động học liên quan	Tương quan với trạng thái nhiễm sắc thể
Chavez và cs. (2012)	Phân cắt	cc2, s2	Có liên quan
Basile và cs. (2014)	Phân cắt	t5–t2, cc3 (n = 504 phôi, kỹ thuật aCGH)	Có liên quan (thuật toán phân tầng A, B, C, D)
Campbell và cs. (2013)	Phôi nang	tSC, tSB, tB (n = 88 ca chuyển phôi)	Có liên quan (phôi lệch bội chậm tạo phôi nang)
Kramer và cs. (2014)	Phôi nang	Không ghi nhận	Không có liên quan
Yang và cs. (2014)	Phôi nang	Không ghi nhận	Không có liên quan
Rienzi và cs. (2015)	Phôi nang	Không ghi nhận	Không có liên quan
Minasi và cs. (2016)	Phôi nang	tSB, tB, tEB, tHB (n = 1.730 phôi nang)	Có liên quan (phôi nguyên bội nở và thoát màng sớm)
Patel và cs. (2016)	Phôi nang	t5–t2, cc3	Có liên quan
Mumusoglu và cs. (2017)	Phôi nang	t9, tSC, tSB, tB, tEB	Có liên quan (lệch bội chậm từ giai đoạn t9)
Desai và cs. (2018)	Phôi nang	tB, tEB, tEB–tSB, ≥ 2 bất thường phân cắt	Có liên quan (tỉ lệ nguyên bội giảm còn 27,6%)
Zhang và cs. (2017)	Phôi nang	Không ghi nhận	Không có liên quan

Desai và cộng sự (2017) phân tích 767 phôi nang sinh thiết ghi nhận tỉ lệ nguyên bội chung đạt 41,6%. Khi phôi xuất hiện từ hai bất thường phân chia trở lên, tỉ lệ nguyên bội giảm xuống 27,6%. Các phôi có thời gian bắt đầu tạo khoang phôi nang tSB ≥ 96,2 giờ có tỉ lệ nguyên bội (36,6%) thấp hơn nhóm có tSB < 96,2 giờ (48,2%); phôi có thời gian bắt đầu giãn nở tEB > 116 giờ có tỉ lệ nguyên bội giảm còn 30%. Tác giả kết luận các thông số giai đoạn sớm dự đoán tiềm năng tạo phôi nang nhưng không phản ánh trạng thái di truyền, trong khi các mốc tạo phôi nang muộn có mối tương quan rõ ràng hơn.

Khoảng trống luận án lựa chọn: Hầu hết công trình quốc tế chỉ dừng lại ở chỉ số tạo phôi nang hoặc tỉ lệ làm tổ, thiếu dữ liệu theo dõi đến kết cục sinh sống khi phối hợp cả hai kỹ thuật. Luận án này định vị vào việc đánh giá toàn diện hiệu quả sinh sống của việc phối hợp sàng lọc lệch bội PGT-A và đánh giá động học time-lapse trên đối tượng bệnh nhân tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết sinh học phát triển phôi

Môi trường nuôi cấy phôi in vitro được thiết kế mô phỏng các giai đoạn sinh lý in vivo:

• Giai đoạn từ vòi trứng đến phôi nén: dịch vòi trứng chứa nồng độ pyruvate và lactate cao, glucose thấp.
• Giai đoạn di chuyển vào buồng tử cung tạo phôi nang và làm tổ: dịch buồng tử cung chứa nồng độ glucose cao, pyruvate và lactate thấp.

Tiến trình phân chia và hoạt hóa bộ gen phôi:

1. Giai đoạn hợp tử: Tinh trùng thụ tinh giải nén ADN, thay thế protamine bằng histone tạo tiền nhân đực; vật liệu di truyền noãn đóng gói tạo tiền nhân cái. Hai tiền nhân di chuyển lại gần nhau nhờ các vi ống của thể sao. ADN nhân đôi trong 12 giờ. Sau 24–26 giờ, màng hai tiền nhân tiêu biến (pronuclear fading - PNf), nhiễm sắc thể sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc để bước vào lần phân bào đầu tiên.
2. Giai đoạn phân cắt: Hợp tử phân chia tạo 2 phôi bào, tiếp tục nhân đôi đối xứng theo chu kỳ 12–15 giờ để đạt 8 tế bào sau khoảng 72 giờ. Khi phân chia không đối xứng, phôi nhận lượng bào tương không đều, dễ phát sinh lệch bội. Các mảnh vỡ bào tương nếu chiếm dưới 10% thể tích ít ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển. Sau giai đoạn 8 tế bào, phôi bước vào giai đoạn nén (compaction) tạo phôi dâu; màng phôi bào tan dần ranh giới, hình thành liên kết khe.
3. Hoạt hóa bộ gen phôi (Embryonic Genome Activation - EGA): Ở lần phân bào đầu tiên, phôi sử dụng protein và mRNA dự trữ từ noãn. Hoạt hóa sao chép và phiên mã của bộ gen phôi bắt đầu tăng dần từ giai đoạn 4 tế bào và hoạt hóa toàn diện ở giai đoạn 8 tế bào (48–72 giờ sau thụ tinh), tham gia điều hòa chu trình tế bào, biến dưỡng và quá trình chết theo chương trình.
4. Giai đoạn phôi nang: Cuối ngày 4, các phôi bào biệt hóa thành hai dòng tế bào riêng biệt: lớp tế bào lá nuôi (Trophectoderm - TE) gồm khoảng 100 tế bào dẹt bên ngoài phát triển thành bánh nhau và màng thai; khối tế bào mầm phôi (Inner Cell Mass - ICM) gồm 1–2 tế bào toàn năng ở cực phôi phát triển thành thai nhi. Tỉ lệ tế bào ICM:TE xấp xỉ 1:10. Khoang phôi nang hình thành do tế bào TE tiết dịch.

Kỹ thuật PGT-A

Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (PGT) phân tích ADN từ noãn hoặc phôi, bao gồm ba phân nhóm:

• PGT-A: Sàng lọc thể lệch bội số lượng nhiễm sắc thể.
• PGT-M: Xác định các bệnh lý đơn gen.
• PGT-SR: Xác định các bất thường tái cấu trúc nhiễm sắc thể.

Chỉ định PGT-A theo khuyến cáo của Hiệp hội Sinh sản và Phôi người châu Âu (ESHRE 2020) gồm: tuổi mẹ lớn (advanced maternal age - AMA), thất bại làm tổ liên tiếp (recurrent implantation failure - RIF), sảy thai liên tiếp (recurrent miscarriages - RM) và bất thường tinh trùng mức độ nặng.

Kỹ thuật sinh thiết tế bào lá nuôi (TE) vào ngày 5 hoặc ngày 6 lấy từ 3–5 tế bào đem lại độ an toàn và chính xác cao hơn sinh thiết thể cực hay sinh thiết phôi ngày 3 (vốn làm giảm tiềm năng làm tổ và có tỉ lệ khảm sai lệch). Kỹ thuật cho phép phát hiện các dạng lệch bội toàn bộ (trisomy, monosomy), lệch bội đoạn (chiếm khoảng 16% phôi nang thụ tinh trong ống nghiệm) và trạng thái thể khảm qua giải trình tự gen thế hệ mới (NGS).

Kỹ thuật nuôi cấy và theo dõi phôi liên tục (Time-lapse)

Hệ thống nuôi cấy time-lapse (như tủ Geri của Genea Biomedx, EmbryoScope) kết hợp kính hiển vi độ phân giải cao, chụp ảnh tự động đa tiêu cự (3–17 mặt phẳng) theo chu kỳ 5–60 phút với nguồn chiếu sáng LED bước sóng an toàn, vận hành trong điều kiện nồng độ oxy thấp và buồng khí kiểm soát CO2 độc lập. Đĩa nuôi cấy vi giếng chuyên dụng (như đĩa Well of the Well - WOW, LinKID, Primo Vision) cho phép nuôi cấy riêng rẽ từng phôi trong các vi giếng đáy tròn đường kính xấp xỉ 150 µm phủ dầu khoáng.

Các thông số động học chuẩn theo khuyến cáo ESHRE (2020) bao gồm:

• tPB2: Trục xuất thể cực 2.
• tPNa và tPNf: Xuất hiện và biến mất của các tiền nhân.
• t2, t3, t4, ..., t8: Các mốc thời gian đạt số lượng phôi bào tương ứng.
• cc2 (t3–t2), cc3 (t5–t4): Chu kỳ phân bào của phôi bào.
• s2 (t4–t3), s3 (t8–t5): Tính đồng bộ của các chu kỳ phân cắt.
• tSC: Bắt đầu nén; tM: Hoàn thành nén.
• tSB: Bắt đầu tạo khoang phôi nang.
• tB: Phôi nang hoàn chỉnh trước khi màng trong suốt mỏng đi.
• tEB: Bắt đầu giãn nở khoang phôi nang.
• tHN, tHD: Bắt đầu và hoàn thành thoát màng.

Các dạng phân chia bất thường được theo dõi gồm:

• Phân chia trực tiếp (Direct cleavage - DC): Một phôi bào phân chia trực tiếp thành 3 phôi bào (1→3 hoặc 2→5) do thoi vô sắc đa cực từ trung thể thừa của tinh trùng. Tần suất chiếm khoảng 6,4% phôi nang sinh thiết đến 13,7% toàn bộ phôi giai đoạn phân cắt.
• Phân chia ngược (Reverse cleavage - RC): Số lượng phôi bào sụt giảm do sự hợp nhất tế bào con; chia thành Type II (thất bại phân chia tế bào chất sau phân chia nhân, chiếm 82%) và Type I (hợp nhất màng tế bào sau khi đã phân tách, chiếm 18%).
• Phôi bào đa nhân (Multinucleation - MN): Tồn tại từ 2 nhân trở lên trong một phôi bào ở giai đoạn phân cắt do lỗi phân chia tế bào chất, tần suất dao động 15–33% (một số nghiên cứu ghi nhận tới 57,4%).
• Pha S2 kéo dài: Thời gian t4–t3 vượt quá 4 giờ, biểu hiện sự mất đồng bộ chu kỳ 2.
• Phân cắt hỗn loạn (Chaos): Màng tế bào xáo trộn, xuất hiện nhiều rãnh phân cắt không đều và nhiều mảnh vỡ.

Phương pháp nghiên cứu và phân tích thống kê

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu quan sát có đối chứng, kết hợp hồi cứu và tiến cứu các chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm.
• Kiểm soát sai số: Quy trình nuôi cấy, phân loại phôi, sinh thiết tế bào lá nuôi và chuyển phôi đông lạnh (FET) được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn phòng lab.
• Phương pháp ghép cặp điểm xu hướng (Propensity Score Matching - PSM): Được sử dụng để ghép cặp giữa nhóm lựa chọn phôi bằng time-lapse kết hợp PGT-A và nhóm chứng (chỉ lựa chọn bằng PGT-A kết hợp hình thái truyền thống), giúp triệt tiêu các sai lệch chọn mẫu về tuổi mẹ, chỉ số khối cơ thể (BMI), tiền sử sinh sản và chất lượng phôi chuyển. Độ lệch chuẩn hóa được đánh giá trước và sau ghép cặp.
• Phân tích thống kê đa biến:
  • Sử dụng phương trình ước lượng tổng quát (Generalized Estimating Equations - GEE) đa biến để xử lý cấu trúc dữ liệu phôi phụ thuộc (nhiều phôi thuộc cùng một cặp vợ chồng/bệnh nhân), xác định các yếu tố độc lập liên quan đến bất thường động học.
  • Xây dựng mô hình hồi quy đa biến nhằm xác định các yếu tố tác động trực tiếp đến kết cục sinh sống sau chuyển phôi nguyên bội.
• Đạo đức nghiên cứu: Đề tài được thông qua hội đồng chuyên môn và hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học (trang 63 của văn bản).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng thuật toàn diện cơ sở sinh học và kỹ thuật nuôi cấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm:

• Phân tích sự dịch chuyển nhu cầu chuyển hóa từ pyruvate/lactate sang glucose theo từng giai đoạn phát triển in vivo và việc mô phỏng môi trường in vitro.
• Trình bày tiến trình tế bào học: từ giải nén vật chất di truyền, nhân đôi ADN, phân chia đối xứng, hiện tượng nén tạo liên kết khe đến hoạt hóa bộ gen phôi (EGA) ở giai đoạn 4–8 phôi bào và sự phân nhánh dòng tế bào ICM/TE tại phôi nang.
• Hệ thống hóa các bảng đồng thuận quốc tế về phân loại chất lượng tiền nhân, phôi phân cắt, phôi nén và phôi nang (Istanbul 2011, tiêu chuẩn Gardner).
• Trình bày nguyên lý, chỉ định (ESHRE 2020) và phương pháp sinh thiết TE của xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGT-A, các dạng bất thường nhiễm sắc thể (lệch bội toàn thể, lệch bội đoạn, ADN ty thể) và hướng tiếp cận PGT-A không xâm lấn qua dịch khoang phôi nang hoặc môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng (spent medium - SM).
• Phân tích cấu trúc hệ thống tủ nuôi cấy time-lapse (tủ Geri, thiết kế vi giếng, kiểm soát nồng độ oxy thấp, chiếu sáng LED), chuẩn hóa hệ thống danh pháp động học hình thái, cơ chế bệnh sinh của các dạng phân chia bất thường (DC, RC, MN, S2 kéo dài, phân cắt hỗn loạn).
• Tổng hợp các mô hình thuật toán trên time-lapse (Meseguer, Eeva, KID score, iDAScore) và tổng quan các công trình nghiên cứu mối liên quan giữa các mốc động học với trạng thái lệch bội di truyền (Campbell, Basile, Desai, Minasi, Mumusoglu).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết phương pháp luận triển khai đề tài:

• Địa điểm và thời gian: Thực hiện tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản - Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc và Bộ môn Mô Phôi - Trường Đại học Y Hà Nội.
• Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ bệnh nhân rõ ràng, bảo đảm tính đại diện của nhóm nghiên cứu.
• Các quy trình chuyên môn tại phòng lab:
  • Thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI).
  • Nuôi cấy phôi liên tục trong tủ time-lapse Geri (Genea Biomedx) với đĩa vi giếng chuyên dụng.
  • Đánh giá chất lượng phôi ngày 3 và ngày 5 theo tiêu chuẩn của bệnh viện Đức Phúc.
  • Quy trình sinh thiết tế bào lá nuôi (TE) ngày 5 hoặc ngày 6, lấy 3–5 tế bào.
  • Quy trình phân tích di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) xác định tình trạng nguyên bội, khảm và lệch bội.
  • Kỹ thuật đông rã phôi thủy tinh hóa (vitrification) với các dung dịch chuyên dụng (ES, VS, TS, DS, WS) và quy trình chuẩn bị niêm mạc tử cung chuyển phôi đông lạnh (FET).
• Phân tích và xử lý số liệu: Ứng dụng kỹ thuật ghép cặp điểm xu hướng (PSM) để loại trừ các yếu tố gây nhiễu lâm sàng; sử dụng mô hình GEE đa biến phân tích dữ liệu động học phôi; phân tích hồi quy đa biến đánh giá các yếu tố liên quan đến tỉ lệ sinh sống; các biện pháp kiểm soát sai số nghiên cứu và bảo đảm chuẩn mực đạo đức y sinh.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu được chia thành các nhóm nội dung chính:

• Đặc điểm bệnh nhân và kết quả nuôi cấy phôi time-lapse: Các chỉ số về tuổi, BMI, tiền sử điều trị, số lượng noãn thu nhận, tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ tạo phôi phân cắt và tỉ lệ phát triển đến phôi nang.
• Đặc điểm phôi theo kết quả PGT-A: Phân bố tỉ lệ phôi nguyên bội, phôi khảm và phôi lệch bội theo chất lượng phôi hình thái (ICM, TE, độ nở khoang phôi nang) và theo tuổi phôi sinh thiết (phôi ngày 5 so với phôi ngày 6).
• Đặc điểm động học hình thái trên hệ thống time-lapse:
  • Phân bố các mốc thời gian phát triển chuẩn (tPB2, tPNf, t2, t3, t4, t5, t8, tSC, tSB, tB, tEB).
  • Tần suất và đặc điểm của các dạng phân chia bất thường: phân chia trực tiếp (DC), phân chia ngược (RC), phôi đa nhân (MN).
• Phân tích mối liên quan giữa kết quả PGT-A và động học phát triển phôi:
  • So sánh các mốc thời gian phân chia giữa nhóm phôi nguyên bội và nhóm phôi lệch bội.
  • Mối liên quan giữa các dạng bất thường phân chia đơn lẻ hoặc phối hợp (≥ 2 bất thường) với kết quả PGT-A.
  • Phân tích kết quả PGT-A theo số lần xuất hiện và thứ tự xuất hiện của các bất thường phân chia.
  • Kết quả phương trình GEE đa biến xác định các yếu tố độc lập liên quan đến bất thường động học phôi.
• Kết quả lâm sàng của phương pháp lựa chọn phôi kết hợp PGT-A và time-lapse:
  • Kết quả áp dụng kỹ thuật ghép cặp điểm xu hướng (PSM): bảng so sánh độ lệch chuẩn hóa giữa nhóm can thiệp (time-lapse) và nhóm chứng trước và sau khi ghép cặp.
  • Đặc điểm bệnh nhân, độ tuổi phôi và chất lượng phôi chuyển sau ghép cặp.
  • So sánh kết cục lâm sàng: tỉ lệ làm tổ, tỉ lệ thai lâm sàng, tỉ lệ sảy thai và tỉ lệ sinh sống giữa hai nhóm.
  • Phân tích mối liên quan giữa kết quả lâm sàng với các mốc động học phân chia, các dạng bất thường phân chia, chất lượng phôi chuyển và độ tuổi của người mẹ.
  • Kết quả mô hình phân tích hồi quy đa biến xác định các yếu tố dự báo kết cục sinh sống.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung luận giải và so sánh các kết quả nghiên cứu với y văn trong nước và quốc tế:

• Bàn luận về đặc điểm lâm sàng của nhóm bệnh nhân và hiệu quả của hệ thống nuôi cấy time-lapse trong việc tạo điều kiện môi trường ổn định cho phôi phát triển.
• Phân tích mối liên quan giữa chất lượng hình thái, ngày sinh thiết phôi với trạng thái lệch bội di truyền: Luận giải ưu thế của phôi nang ngày 5 so với ngày 6 và giá trị của phân loại ICM/TE.
• Luận giải sâu sắc về động học phát triển và các bất thường phân chia:
  • Khẳng định các mốc thời gian phân chia giai đoạn sớm (t2 đến t8) ít có giá trị dự đoán trạng thái lệch bội do chịu ảnh hưởng từ giao tử và cơ chế tự sửa chữa tế bào chất.
  • Phân tích cơ chế khiến các mốc thời gian tạo phôi nang (tSB, tB, tEB) và khoảng cách thời gian nở giãn (tEB–tSB) có mối tương quan chặt chẽ với tình trạng nguyên bội, tương đồng với các phát hiện của Campbell và Desai.
  • Bàn luận về cơ chế phát sinh thoi vô sắc đa cực trong phân chia trực tiếp (DC) và lỗi phân chia tế bào chất trong phân chia ngược (RC), giải thích lý do phôi có từ hai bất thường phân chia trở lên có tỉ lệ lệch bội tăng vọt.
• Đánh giá vai trò của kỹ thuật ghép cặp điểm xu hướng (PSM): Phân tích tính ưu việt của PSM trong việc loại bỏ yếu tố nhiễu lâm sàng khi so sánh kết cục sinh sống.
• Biện luận về hiệu quả lâm sàng của chiến lược phối hợp: Chứng minh việc sử dụng PGT-A để chọn lọc phôi nguyên bội (loại bỏ nguy cơ sai lệch di truyền) kết hợp với thông số time-lapse để chọn phôi có tốc độ giãn nở và động học tối ưu giúp cải thiện rõ rệt tỉ lệ sinh sống trong các chu kỳ chuyển đơn phôi đông lạnh.
• Tổng kết tính mới và các hạn chế của nghiên cứu (trang 136).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

• Làm sáng tỏ mối liên quan giữa các thông số động học hình thái, các dạng bất thường phân chia (DC, RC, MN) và trạng thái nhiễm sắc thể của phôi nang người trên quần thể bệnh nhân Việt Nam.
• Cung cấp cơ sở lý luận khẳng định tính bổ trợ hai chiều giữa di truyền và động học: PGT-A sàng lọc năng lực di truyền (genetically competent) và time-lapse đánh giá năng lực phát triển sinh học (developmentally competent), giải quyết bất cập khi áp dụng đơn lẻ từng kỹ thuật.

Đóng góp về mặt thực tiễn lâm sàng

• Xây dựng thành công chiến lược lựa chọn phôi kết hợp: Sau khi sàng lọc được các phôi nang nguyên bội qua xét nghiệm PGT-A, labo sử dụng tiếp các mốc thời gian động học time-lapse (đặc biệt là các mốc tSB, tEB và việc loại trừ các phôi có bất thường phân cắt nghiêm trọng) để xếp hạng ưu tiên chuyển phôi.
• Việc áp dụng phương pháp ghép cặp điểm xu hướng (PSM) trong phân tích dữ liệu lâm sàng giúp cung cấp bằng chứng khách quan về việc cải thiện tỉ lệ sinh sống của chiến lược phối hợp so với lựa chọn phôi PGT-A truyền thống.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng ủng hộ chính sách chuyển một phôi nang duy nhất (eSET), giúp nâng cao hiệu quả thụ thai, giảm tỉ lệ sảy thai và triệt tiêu nguy cơ biến chứng sản khoa do đa thai.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Khuyến nghị ứng dụng quy trình phối hợp time-lapse và PGT-A cho các nhóm bệnh nhân tiên lượng khó như phụ nữ lớn tuổi (AMA), bệnh nhân có tiền sử thất bại làm tổ liên tiếp (RIF) hoặc sảy thai liên tiếp (RM).
• Đề xuất labo hỗ trợ sinh sản chuẩn hóa quy trình chú thích động học hình thái và theo dõi chặt chẽ các dạng bất thường phân chia để làm tiêu chí phụ trợ trong quyết định chuyển hoặc trữ đông phôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

Theo nội dung mục hạn chế nghiên cứu (trang 136) được nêu trong văn bản:

• Dữ liệu nghiên cứu được thu thập tại một cơ sở điều trị hỗ trợ sinh sản (Bệnh viện Đức Phúc kết hợp Đại học Y Hà Nội), do đó các thông số động học có thể chịu ảnh hưởng cục bộ từ điều kiện vi môi trường của hệ thống nuôi cấy và thiết bị tủ cấy Geri tại labo.
• Tần suất xuất hiện của một số dạng phân chia bất thường hiếm gặp (như phân cắt hỗn loạn hoặc phối hợp nhiều dạng phân chia bất thường trên cùng một phôi) có cỡ mẫu phân nhóm còn khiêm tốn.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm với cỡ mẫu lớn hơn nhằm kiểm chứng tính phổ quát của các ngưỡng thời gian động học trên các hệ thống tủ time-lapse khác nhau.
• Triển khai các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng (RCT) để củng cố giá trị chứng cứ lâm sàng về tỉ lệ trẻ sinh sống tích lũy.
• Tích hợp các thuật toán học máy, trí tuệ nhân tạo (AI) tự động phân tích video time-lapse kết hợp với các kỹ thuật xét nghiệm di truyền không can thiệp (niPGT-A thông qua cfADN trong dịch nuôi cấy) nhằm hạn chế tối đa xâm lấn lên phôi.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên sau đại học chuyên ngành Mô phôi thai học, Sản phụ khoa và Di truyền y học: Luận án cung cấp bức tranh tổng quan hệ thống về sinh lý phôi tiền làm tổ, quy chuẩn Istanbul, cơ chế phân chia tế bào và phương pháp luận ứng dụng kỹ thuật thống kê nâng cao (PSM và GEE) trong nghiên cứu y học sinh sản.
• Đối với bác sĩ lâm sàng hỗ trợ sinh sản: Cung cấp bằng chứng khoa học phục vụ công tác hội chẩn, cá thể hóa phác đồ điều trị và tư vấn chiến lược lựa chọn phôi cho bệnh nhân, tăng cường thực hành chuyển một phôi duy nhất an toàn.
• Đối với chuyên viên phôi học (embryologist): Luận án đóng vai trò như một cẩm nang kỹ thuật về vận hành hệ thống tủ time-lapse, chuẩn hóa nhận diện các mốc động học (tPB2 đến tEB) và phát hiện chính xác các dạng phân chia bất thường (DC, RC, MN) phục vụ công tác đánh giá phôi thường quy tại phòng lab IVF.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao động học phân chia giai đoạn sớm không thể thay thế xét nghiệm PGT-A trong việc xác định lệch bội nhiễm sắc thể?

Các phân tích gộp quốc tế và số liệu trong luận án chỉ ra rằng phôi giai đoạn sớm (từ 2 đến 8 tế bào) phát triển chủ yếu nhờ protein và mRNA có sẵn từ noãn; bộ gen của phôi chỉ thực sự hoạt hóa toàn diện từ giai đoạn 4–8 phôi bào. Cả phôi nguyên bội lẫn lệch bội đều có thể trải qua các chu kỳ phân cắt ban đầu với động học tương đương nhau cho đến giai đoạn nén. Do đó, các thông số động học phân cắt sớm không thể dự đoán chính xác và tin cậy trạng thái lệch bội di truyền của phôi.

2. Sự kết hợp giữa PGT-A và time-lapse mang lại lợi ích gì so với việc áp dụng đơn lẻ từng kỹ thuật?

PGT-A chỉ xác định phôi có bình thường về số lượng nhiễm sắc thể hay không (năng lực di truyền - genetically competent) nhưng là kỹ thuật can thiệp xâm lấn và không đánh giá hết tiềm năng phát triển sinh học giữa các phôi nguyên bội. Trong khi đó, time-lapse theo dõi liên tục tiến trình phát triển và nhận diện các bất thường phân bào (năng lực phát triển sinh học - developmentally competent) nhưng không loại trừ được lệch bội. Việc kết hợp cho phép sàng lọc phôi nguyên bội trước, sau đó dùng dữ liệu time-lapse để xếp thứ tự ưu tiên chuyển phôi nang có tiềm năng làm tổ và sinh sống cao nhất.

3. Những dạng bất thường phân chia nào được hệ thống time-lapse theo dõi trong nghiên cứu?

Hệ thống time-lapse ghi nhận các dạng bất thường chính:

• Phân chia trực tiếp (direct cleavage - DC): Một phôi bào phân tách thành 3 tế bào con (1→3 hoặc 2→5) do thoi vô sắc đa cực.
• Phân chia ngược (reverse cleavage - RC): Hiện tượng hợp nhất phôi bào sau phân chia, gồm Type I (hợp nhất màng) và Type II (thất bại phân chia tế bào chất).
• Phôi bào đa nhân (multinucleation - MN): Tồn tại từ hai nhân trở lên trong một phôi bào.
• Pha S2 kéo dài: Thời gian phân chia từ 3 lên 4 tế bào (t4–t3) vượt quá 4 giờ.
• Phân chia hỗn loạn (chaos): Phân bào xáo trộn màng với nhiều rãnh phân cắt không đều và mảnh vỡ.

4. Các mốc động học nào ở giai đoạn phôi nang có mối liên quan chặt chẽ với tình trạng lệch bội?

Theo nghiên cứu tổng quan của Desai và các tác giả trong luận án, tình trạng nhiễm sắc thể có tương quan đáng kể với thời điểm bắt đầu tạo khoang phôi nang (tSB), thời điểm khoang phôi nang nở rộng (tEB) và khoảng thời gian nở giãn (tEB–tSB). Phôi có tSB ≥ 96,2 giờ hoặc tEB > 116 giờ có tỉ lệ phôi nguyên bội thấp hơn rõ rệt so với nhóm phôi phát triển đúng chu trình sinh lý.

5. Kỹ thuật ghép cặp điểm xu hướng (PSM) đóng vai trò gì trong đánh giá kết quả lâm sàng của luận án?

Trong các nghiên cứu lâm sàng hỗ trợ sinh sản, các biến số nền của bệnh nhân (tuổi mẹ, chỉ số khối cơ thể BMI, tiền sử điều trị, số lượng noãn và chất lượng phôi) có thể tạo ra sai lệch chọn mẫu lớn giữa nhóm time-lapse và nhóm đối chứng. Luận án đã áp dụng kỹ thuật PSM để ghép cặp các đối tượng có điểm xu hướng tương đồng, đưa độ lệch chuẩn hóa về mức cân bằng tối ưu, bảo đảm kết quả so sánh tỉ lệ trẻ sinh sống giữa hai nhóm phản ánh chính xác hiệu quả của phương pháp lựa chọn phôi can thiệp.

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Diêm Thị Yến đã cung cấp bằng chứng khoa học toàn diện về việc phối hợp xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGT-A và hệ thống nuôi cấy theo dõi phôi liên tục time-lapse trong thụ tinh trong ống nghiệm. Bằng phương pháp nghiên cứu chặt chẽ kết hợp các mô hình thống kê nâng cao (PSM và GEE đa biến), công trình đã phân tích sâu sắc mối liên quan giữa các mốc động học hình thái, các dạng bất thường phân chia với tình trạng lệch bội nhiễm sắc thể của phôi nang. Kết quả của luận án khẳng định giá trị thực tiễn của chiến lược phối hợp trong việc tối ưu hóa khả năng lựa chọn phôi nang nguyên bội có tiềm năng phát triển cao nhất, nâng cao tỉ lệ trẻ sinh sống và hỗ trợ vững chắc cho mục tiêu chuyển một phôi duy nhất an toàn trong chuyên ngành hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Đại cương về nuôi cấy và đánh giá chất lượng phôi trong TTTON 1. Đại cương về nuôi cấy phôi 1. Đại cương về nuôi cấy phôi Trong cơ thể sống (in vivo), hợp tử sau khi được tạo ra sẽ di chuyển dần từ vòi trứng đến niêm mạc tử cung để làm tổ.

Ở vòi trứng, dịch tiết của vòi trứng chứa một lượng pyruvate và lactate có nồng độ cao và lượng glucose có nồng độ thấp. Tại đây, phôi bắt đầu quá trình phân chia và phát triển cho đến giai đoạn phôi nén. Khi phôi di chuyển đến tử cung, môi trường trong buồng tử cung chứa lượng lớn glucose, lượng thấp pyruvate và lactate. Tại đây, phôi bắt đầu phát triển tới giai đoạn phôi nang và bắt đầu quá trình làm tổ.8 Việc xây dựng một hệ thống nuôi cấy phôi trong labo thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization – IVF) dựa trên cơ sở nguyên lý phát triển của phôi trong môi trường in vivo (hình 1.

Đầu tiên, hệ thống nuôi cấy phôi phải tạo nên môi trường mô phỏng điều kiện in vivo cho noãn, tinh trùng và phôi. Thứ hai, hệ thống nuôi cấy phôi cần đáp ứng được những nhu cầu cho phôi phát triển trong labo (in vitro) và tránh những điều kiện bất lợi đối với phôi. Khi phôi bị tác động bất lợi (stress) trong quá trình nuôi cấy, phôi có thể phát triển chậm hoặc không đạt được đến giai đoạn phôi nang. Hơn nữa, stress còn có thể gây rối loạn các hoạt động biến dưỡng, sự biểu hiện gen, làm giảm khả năng sống cũng như khả năng làm tổ của phôi.9 Thứ ba, một hệ thống nuôi cấy phôi bao gồm môi trường xung quanh, thiết bị, môi trường nuôi cấy và hoạt động kỹ thuật của chuyên viên phôi học 4 cũng có thể gây ra một loạt các ảnh hưởng lên phôi.

Vì vậy, để cải thiện kết quả nuôi cấy phôi, nên tập trung vào việc làm giảm các tác nhân gây stress có thể ảnh hưởng đến khả năng tạo phôi của hệ thống nuôi cấy hiện hành. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy phôi. Sự phát triển của phôi giai đoạn tiền làm tổ a. Giai đoạn hợp tử Sau khi tinh trùng xâm nhập vào bào tương noãn, ADN từ tinh trùng được giải nén, protamine được thay bằng histone.

Nhân tinh trùng được đóng gói tạo thành tiền nhân đực. Cùng thời điểm đó, vật liệu di truyền của noãn cũng bắt đầu được giải nén và đóng gói để tạo tiền nhân cái. Lúc này, nhiễm sắc thể (NST) trong hai tiền nhân ở trạng thái đơn bội. Sau khi được hình thành, hai tiền nhân tiến lại gần nhau với sự hỗ trợ từ các vi ống.

Các vi ống này được tạo thành do sự kéo dài của thể sao, một phần trung thể của tinh trùng phát triển trong bào tương của noãn ngay sau khi tinh trùng xâm nhập vào noãn. Trong khi các vi ống kéo hai tiền nhân lại gần nhau vào vùng trung tâm của noãn, sự tổng hợp ADN cũng bắt đầu được thực hiện bên trong hai tiền 5 nhân để nhân đôi số lượng NST trong vòng 12 giờ nhằm chuẩn bị cho giai đoạn phân chia tế bào sau đó. Sau 24 - 26 giờ từ thời điểm tinh trùng xâm nhập vào noãn, màng của hai tiền nhân tan ra, các NST bên trong hai tiền nhân bắt cặp với nhau và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc. Hợp tử lúc này được xem là tế bào đầu tiên của một “sinh vật mới” với bộ gene riêng và ở trạng thái lưỡng bội.

Thoi vô sắc sau đó kéo các NST về hai cực và chuẩn bị cho lần phân bào đầu tiên. Giai đoạn phôi phân chia Sự phân cắt đơn thuần Khoảng 24 - 26 giờ sau khi diễn ra sự thụ tinh, hợp tử bắt đầu sự phân chia đầu tiên. Một mặt phẳng xích đạo được tạo thành bởi đường thẳng định hướng theo các thể cực và phân chia phôi thành 2 cực, tạm gọi là cực phôi và cực đối diện. Sự phân chia của hợp tử thành phôi có hai phôi bào, một trong hai tế bào sẽ định hướng về cực phôi và tế bào còn lại sẽ định hướng về cực đối diện.

Tiếp theo, mỗi phôi bào lại phân chia đối xứng qua trục theo cơ chế phân bào nguyên phân tạo thành phôi bốn tế bào. Các phôi bào sắp xếp thành hình tứ diện trong không gian hình cầu được tạo thành bởi màng trong suốt. Cứ mỗi 12 - 15 giờ, các phôi bào lại phân chia để nhân đôi số lượng. Lần phân bào đầu tiên thường kéo dài hơn những lần phân bào sau đó.

Thông thường, phôi sẽ mất khoảng 72 giờ để đạt đến giai đoạn 8 tế bào. Nếu sự phân chia của các phôi bào không đối xứng, một trong các phôi bào ở thế hệ tiếp theo chỉ nhận được ít hơn một nửa lượng bào tương từ tế bào mẹ. Sự phân chia bất đối xứng này thường gây ra hiện tượng lệch bội. Những nghiên cứu dựa vào hình ảnh phôi trên hệ thống nuôi cấy time-lapse cho thấy sự phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang có thể được dự đoán ngay ở giai đoạn phôi bốn tế bào, thông qua các thông số của ba chu kỳ phân bào đầu tiên.

6 Những phôi phân chia quá nhanh hoặc quá chậm có thể có sai hỏng về khả năng chuyển hoá hoặc sai hỏng về NST. Trong quá trình phân chia của phôi bào, một số phần bào tương không có nhân và có màng bao độc lập với màng bào tương của phôi bào sẽ bị tống xuất ra bên ngoài. Kết quả là sự xuất hiện những mảnh vỡ bào tương. Kích thước và sự phân bố của những mảnh vỡ này rất khác nhau.

Số lượng các mảnh vỡ bào tương càng nhiều thường ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của phôi và có liên quan đến sự phân chia lệch bội của phôi. Nếu tỉ lệ các mảnh vỡ bào tương không quá 10% so với thể tích tổng thể của phôi thì tiềm năng phát triển của phôi sẽ không bị ảnh hưởng. Mỗi phôi bào sau khi phân chia thường có một nhân. Phôi bào mang đa nhân thường liên quan đến sự rối loạn về di truyền của phôi.

Một số nghiên cứu cho thấy tốc độ phân chia, khả năng làm tổ thấp và tỉ lệ sẩy thai tăng lên ở những trường hợp phôi bào có nhiều hơn một nhân. Khi phôi đạt đến 8 phôi bào, phôi bắt đầu nén tạo thành phôi dâu. Đây được xem là cột mốc đánh dấu sự thay đổi lớn về hình thái của phôi, phôi lúc này không còn cấu trúc đối xứng xuyên tâm như các giai đoạn trước. Màng của các phôi bào tan dần và ranh giới giữa các phôi bào dần biến mất.

Lúc này, các phôi bào gắn chặt với nhau và giữa các phôi bào bắt đầu phát triển các liên kết khe, nhờ vậy chúng phát triển đồng bộ và phối hợp với nhau trong các phản ứng với những tín hiệu sinh lý và môi trường. Nếu các phôi bào không qua giai đoạn nén, phôi sẽ giảm khả năng phát triển thành phôi nang bình thường. Cho đến giai đoạn phôi dâu, các phôi bào liên tục tăng lên về số lượng theo cấp số nhân nhưng kích thước tổng thể của phôi không thay đổi so với các giai đoạn trước đó.11 7 Sự hoạt hoá bộ gene phôi Trong lần phân bào đầu tiên, hợp tử hoàn toàn dựa vào các protein và axit ribonucleic thông tin của noãn, vào cuối giai đoạn hợp tử ở trạng thái một tế bào (hai tiền nhân đã hoà màng), bộ gene của hợp tử, hay nói đúng hơn là của riêng phôi, bắt đầu hoạt hoá sự sao chép ADN, tổng hợp protein. Sự hoạt hoá này càng lúc càng mạnh ở cuối giai đoạn phôi bốn và tám phôi bào (48 - 72 giờ sau thụ tinh).

Qua quan sát sự biểu hiện gene ở phôi vào các giai đoạn khác nhau từ 2, 4, 8 phôi bào, phôi đang nén, phôi dâu và phôi nang bằng kỹ thuật ADN microarray, cho thấy có một số gene bắt đầu hoạt hoá trước khi phôi đạt giai đoạn 4 phôi bào. Những gene này mã hoá cho các protein giúp ổn định và kiểm soát các hoạt động của mRNA và protein sẵn có từ noãn. Đồng thời Ca2+ được giải phóng từ thời điểm thụ tinh cũng góp phần cản trở sự dịch mã của mRNA sẵn có từ noãn trong giai đoạn này. Sau đó, các protein sẵn có từ noãn được chỉnh sửa lại bởi sự phosphoryl hoá qua trung gian các men kinase hoặc phosphatase của phôi và trở nên bất hoạt.

Tất cả quá trình kiểm soát và thay thế dần mRNA và protein sẵn có từ noãn được xem là bước quan trọng chuẩn bị cho điều hoà sự phát triển của phôi trước sự kiện hoạt hoá bộ gene của phôi. Khi phôi phát triển từ giai đoạn 4 phôi bào sang 8 phôi bào, một số lượng lớn các gene trong phôi bắt đầu được điều hoà tăng, trong đó 1/3 số gene liên quan đến chuyển hoá protein và axit nucleic. Lúc này, bộ gene của phôi hoàn toàn hoạt hoá và thực hiện quá trình phiên mã, dịch mã cho tất cả protein cho điều hoà sự chuyển hoá, chu trình tế bào và sự chết theo chương trình. Tuy nhiên, rất ít gene được điều hoà tăng khi phôi bắt đầu bước vào giai đoạn nén và thay đổi hình thái.

Điều này chứng tỏ, các gene biểu hiện ở 8 các giai đoạn từ khi phôi nén trở về sau đều được sao chép và dịch mã trước hoặc ngay thời điểm phôi 8 phôi bào. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng việc nuôi cấy phôi dài ngày trong thụ tinh trong ống nghiệm có thể gây rối loạn sự chuyển hoá của phôi và có thể dẫn đến sự sai lệch trong quá trình hoạt hoá bộ gene của phôi. Giai đoạn phôi nang Vào cuối ngày thứ 4 sau khi thụ tinh, các phôi bào bắt đầu biệt hoá và phát triển thành hai dòng tế bào với hình dạng và chức năng khác nhau. Cụ thể, các tế bào ở lớp ngoài cùng của phôi dâu (vẫn còn dính với ZP) bắt đầu liên kết với nhau và tạo thành một lớp tế bào biểu mô dày.

Hình dạng của các tế bào ở lớp này trở nên dẹt, kích thước nhỏ hơn so với phôi bào ở giai đoạn trước đó và liên kết chặt chẽ với nhau thông qua nhiều cầu nối tiếp giáp. Lớp tế bào bên ngoài này (khoảng 100 tế bào) được gọi là tế bào lá nuôi (Trophectoderm - TE). Đồng thời, hai đến bốn tế bào ở lớp trong cùng của phôi dâu trước đó phân chia và phát triển thành khối tế bào mầm phôi (Inner cell mass - ICM) của phôi nang. ICM (khoảng một - hai tế bào) thường tập trung ở cực phôi của phôi nang.