Khảo sát lên men tăng kháng khuẩn dịch chiết Bạc hà á - Nguyễn Thị Thu Huyền

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu phương pháp lên men dịch chiết bạc hà á (Mentha arvensis L.) nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn. Phân tích các điều kiện tối ưu.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Huyền
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Ngọc Quang
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Khảo sát một số điều kiện lên men nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây bạc hà Á (Mentha arvensis L.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây bạc hà và hoạt tính kháng khuẩn

Cây bạc hà Á (Mentha arvensis L.) là một loại thảo dược quý giá trong y học cổ truyền và hiện đại. Cây này chứa nhiều hợp chất hữu ích như menthol, menthone và các tinh dầu có tính chất kháng khuẩn mạnh mẽ. Hoạt tính kháng khuẩn của bạc hà đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu khoa học, giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, hoạt tính này còn có thể được tăng cường thông qua các phương pháp xử lý hiện đại. Việc áp dụng công nghệ lên men dịch chiết bạc hà là một giải pháp hiệu quả để nâng cao hiệu lực dược liệu. Phương pháp này không chỉ giữ nguyên các thành phần có lợi mà còn tạo ra những hợp chất mới có tác dụng kháng khuẩn vượt trội.

1.1. Thành phần hóa học chính của bạc hà

Dịch chiết bạc hà chứa nhiều hợp chất tích cực như menthol, menthone, pulegone và các flavonoid. Các thành phần này có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hiệu quả. Menthol là thành phần chính chiếm khoảng 40-50% tinh dầu, với đặc tính mạnh mẽ trong việc tiêu diệt các chủng vi khuẩn có hại. Các hợp chất phenolic trong bạc hà cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt động kháng khuẩn. Sự hiện diện của những chất này làm cho bạc hà trở thành một nguồn tài nguyên quý báu cho ngành dược phẩm.

1.2. Tầm quan trọng của hoạt tính kháng khuẩn trong dược liệu

Hoạt tính kháng khuẩn của các dược liệu thiên nhiên ngày càng được chú trọng trong bối cảnh kháng thuốc kháng sinh gia tăng. Dịch chiết bạc hà có khả năng ức chế nhiều chủng vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Việc tìm kiếm các nguồn hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên giúp giảm thiểu tác dụng phụ và phát triển thuốc an toàn hơn. Các nghiên cứu cho thấy dụng dịch chiết từ thảo dược có tác dụng bổ sung hiệu quả cho điều trị kháng sinh.

II. Phương pháp lên men tăng cường hoạt tính

Lên men dịch chiết bạc hà là một kỹ thuật sinh công nghệ hiện đại, sử dụng các vi sinh vật (chủ yếu là nấm men) để biến đổi thành phần hóa học của dịch chiết. Quá trình này giúp tăng cường hoạt tính kháng khuẩn thông qua việc tạo ra các hợp chất mới có sinh học hoạt tính cao hơn. Các yếu tố như nồng độ saccarose, hàm lượng bạc hà, nồng độ nấm men ban đầu đều ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả lên men. Nghiên cứu khảo sát các điều kiện lên men giúp tối ưu hóa quy trình để đạt được dịch chiết bạc hà có hoạt tính kháng khuẩn tối đa. Phương pháp này mở ra hướng đi mới trong phát triển sản phẩm dược phẩm chất lượng cao từ các dược liệu truyền thống.

2.1. Cơ chế lên men và tác động đến thành phần hoạt chất

Trong quá trình lên men dịch chiết bạc hà, nấm men phân hủy các hợp chất phức tạp thành những chất đơn giản hơn, dễ hấp thụ hơn. Vi sinh vật sản sinh ra các enzyme làm thay đổi cấu trúc của flavonoid, polyphenol và các hợp chất khác, tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Quá trình này cũng tạo ra những hợp chất mới có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh hơn. Sự gia tăng độ sinh khả dụng của các thành phần hoạt chất làm cho dịch chiết bạc hà lên men hiệu quả hơn so với dịch chiết thô.

2.2. Các điều kiện tối ưu hóa quá trình lên men

Để đạt được hoạt tính kháng khuẩn tối đa trong dịch chiết bạc hà lên men, cần khảo sát các yếu tố như nồng độ đường, tỷ lệ chất lên men, nhiệt độ và thời gian lên men. Nồng độ saccarose phù hợp cung cấp năng lượng cho nấm men phát triển tối ưu mà không gây ức chế. Hàm lượng bạc hà tương ứng đảm bảo đủ chất nền để nấm men tác động. Nồng độ nấm men ban đầu quyết định tốc độ lên men và hiệu suất biến đổi chất hoạt tính thành công.

III. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lên men

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà lên men rất quan trọng để xác định hiệu quả của quá trình xử lý. Phương pháp khuếch tán giếng thạch là một trong những kỹ thuật phổ biến và hiệu quả nhất để thử hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết. Phương pháp này cho phép đo lường kích thước vòng vô khuẩn được tạo ra khi mẫu dịch chiết được tiếp xúc với các chủng vi khuẩn trong môi trường thạch. Kích thước vòng vô khuẩn càng lớn thì hoạt tính kháng khuẩn của mẫu càng mạnh. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp này trên dịch chiết bạc hà đã chứng minh rằng quá trình lên men giúp tăng cường hoạt tính kháng khuẩn đáng kể.

3.1. Phương pháp khuếch tán giếng thạch

Phương pháp khuếch tán giếng thạch để thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà có quy trình chuẩn hóa rõ ràng. Trước hết, chuẩn bị thạch được inoculate với chủng vi khuẩn kiểm tra. Sau đó, tạo giếng bằng cách khoan lỗ trên bề mặt thạch và nhỏ dịch chiết vào. Trong quá trình ủ, các chất kháng khuẩn khuếch tán từ dịch chiết sang thạch, tạo ra vòng vô khuẩn. Qua đó có thể tăng cường hoạt tính kháng khuẩn được định lượng chính xác thông qua kích thước vòng.

3.2. Các chủng vi khuẩn kiểm tra và tiêu chuẩn đánh giá

Trong các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà lên men, thường sử dụng các chủng vi khuẩn đại diện như Staphylococcus aureus, Escherichia coli và các chủng khác. Các vi khuẩn Gram dương và Gram âm được chọn để đánh giá phổ hoạt động của dịch chiết. Kích thước vòng vô khuẩn được so sánh giữa các mẫu lên men với điều kiện khác nhau để xác định điều kiện tối ưu nhất cho hoạt tính kháng khuẩn lớn nhất.

IV. Ứng dụng và triển vọng phát triển sản phẩm

Lên men dịch chiết bạc hà để tăng cường hoạt tính kháng khuẩn có nhiều ứng dụng tiềm năng trong ngành dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Sản phẩm dịch chiết bạc hà lên men có thể được sử dụng trong các công thức thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn, hay các sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Triển vọng phát triển sản phẩm từ bạc hà thông qua lên men rất lớn, đặc biệt là trong bối cảnh tìm kiếm các giải pháp điều trị tự nhiên. Các sản phẩm này không chỉ hiệu quả mà còn an toàn, thân thiện với môi trường, giảm thiểu tác dụng phụ. Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm thế hệ mới với hoạt tính kháng khuẩn vượt trội.

4.1. Ứng dụng trong sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng

Dịch chiết bạc hà lên men có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ có thể được ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc, viên uống bổ sung sức khỏe. Trong lĩnh vực thực phẩm chức năng, bạc hà lên men có thể được sử dụng làm thành phần chính của các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe đường tiêu hóa, hệ miễn dịch. Khả năng tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của quá trình lên men làm cho sản phẩm an toàn hơn và hiệu quả hơn so với các sản phẩm truyền thống.

4.2. Hướng phát triển nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các điều kiện lên men tối ưu để đạt hoạt tính kháng khuẩn cao nhất từ dịch chiết bạc hà. Các nghiên cứu về ổn định sản phẩm lên men, shelf-life, và khả năng quy mô hóa sản xuất cần được thực hiện. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trong các mô hình sinh học in vivo sẽ cung cấp dữ liệu quý giá cho ứng dụng lâm sàng của dịch chiết bạc hà lên men.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Bạc hà (Mentha arvensis L.1 Tên khoa học và phân loại khoa học - Tên khoa học: Mentha arvensis L. - Phân loại khoa học [1]: Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnolyophyta) Lớp Ngọc lan (Magnolyopsida) Phân lớp Hoa môi (Lamidae) Bộ Hoa môi (Lamiales) Họ Bạc hà (Lamiaceae) Chi Mentha Loài Mentha arvensis L.2 Đặc điểm thực vật và phân bố M. là cây thân thảo sống lâu năm, cao từ 10 đến 60 – 70 cm, có thể cao tới 1 m. Thân vuông mọc đứng hay hơi bò, trên thân có nhiều lông.

Lá đơn, mọc đối, cuống dài từ 2 – 10 mm, phiến lá hình trứng hay thuôn dài, rộng 2 – 3 cm, mép có răng cưa, mặt trên và mặt dưới của lá đều có lông che chở và lông bài tiết chứa nhiều tinh dầu. Hoa mọc vòng ở kẽ lá, cánh hoa hình môi màu tím hay hồng nhạt có khi màu trắng [2]. Ở nước ta bạc hà Á thường mọc hoang. Một số vùng trồng bạc hà Á với mục đích làm thuốc như làng dược liệu Nghĩa Trai (Hưng Yên); Gia Lâm (Hà Nội); Sơn La; Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Đà Lạt… 2 Hình 1.3 Thành phần hóa học Tinh dầu là thành phần chính của lá bạc hà.

Ngoài ra trong cây bạc hà còn có các hợp chất flavonoid, coumarin, phenolic và các hợp chất khác. Tinh dầu tập trung nhiều ở lông tiết của lá. Tỷ lệ tinh dầu trong bạc hà thường từ 0,5 đến 1%, có khi lên tới 1,3 đến 1,5% [2]. Tinh dầu thường là chất lỏng không màu, vàng nhạt hay vàng xanh.

Thành phần chủ yếu trong tinh dầu bao gồm những chất sau đây: - Menthol (C10H19OH) có trong tinh dầu với tỷ lệ 40-50%, chủ yếu ở dạng tự do, một phần nhỏ ở dạng kết hợp với acid acetic. - Menthon (C10H18O) có hàm lượng từ 10 - 20% trong tinh dầu bạc hà. Ngoài ra, trong tinh dầu bạc hà còn chứa các hợp chất: limonen, cineol, eugenol, α- pinen … Các hợp chất khác cũng được tìm thấy trên cây bạc hà gồm: các hợp chất flavonoid: luteolin, menthoside, rutin, hesperidin…; các hợp chất phenolic: acid caffeic, chlorogenic, rosmarinic…[2].4 Các đặc tính dược lý - Hoạt tính kháng khuẩn Năm 2014, Megha M. Kumbalwar và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết nước và dịch chiết dung môi hữu cơ của Mentha arvensis L.

trên một số chủng vi khuẩn Gram (-). Kết quả cho thấy các dịch chiết đều có khả năng kháng khuẩn, tuy nhiên dịch chiết nước có tiềm năng hoạt tính thấp hơn các dịch chiết trong các dung môi hữu cơ còn lại. Nghiên cứu chỉ ra rằng, dịch chiết của loại cây này có khả năng kháng khuẩn và có thể là gợi ý để khám phá ra các chất kháng khuẩn mới có nguồn gốc tự nhiên [17]. Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn trên nhiều chủng vi khuẩn gram (-) và (+) của dịch chiết ethanol và tinh dầu bạc hà [4], [26], [27].

- Hoạt tính chống oxi hóa Cineol, eugenol và thymol có trong bạc hà được báo cáo là một chất chống oxy hóa tốt và ức chế quá trình peroxy hóa lipid [3], [29]. Các flavonoid như quercetin, có trong bạc hà đã được báo cáo là loại bỏ các gốc tự do OH và superoxide và cũng ức chế peroxy hóa lipid [15], [25]. - Hoạt tính chống viêm và chống dị ứng Histamine - được sản xuất bởi tế bào mast, là một chất giữ vai trò quan trọng trong phản ứng viêm và dị ứng. Hoạt động chống viêm và chống dị ứng của dịch chiết ethanol và dịch chiết nước (lá, thân và rễ) của M.

được xác định bằng phản ứng phù chân do histamine gây ra ở chuột và thử nghiệm ức chế giải phóng histamine tương ứng. (đặc biệt là lá) là nguồn giàu phytoconstituents thứ cấp, có tác dụng điều trị chống lại các bệnh dị ứng và viêm nhiễm. Kết quả chống dị ứng cho thấy chiết xuất ethanol của lá và rễ có hoạt tính ức chế rõ rệt được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm ức chế, tương ứng là 57% và 53%. Khả năng chống viêm được thể hiện qua chiết xuất ethanol của các bộ phận thực vật là lá (68,3%) > rễ (48,8%) > thân (10,7%) và so với phần trăm khả năng ức chế của thuốc đối chiếu Natri diclofenac (gây ức chế phù nề 77,87%) [21].

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác đã được thực hiện và chứng minh các tác dụng có ý nghĩa quan trọng của bạc hà như tác động đến phản ứng phản vệ và sản xuất yếu tố hoại tử khối u TNF-α, chống vô sinh, lợi ích trong một số bệnh tim mạch… [27].5 Công dụng của bạc hà Bạc hà Á được trồng để thu lấy tinh dầu để sản xuất methol tự nhiên. Bên cạnh đó, loài bạc hà hà này được sử dụng phổ biến như một loại gia vị. Lá của Mentha arvensis L. được mô tả có nhiều đặc tính y học trong đó bao gồm đặc tính kháng khuẩn [26].

Bạc hà Á được sử dụng như một phương thuốc dân gian tại nhiều đất nước. Phần lá được dùng để chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy, kiết lỵ, đầy hơi, viêm ruột. Ngoài ra nó còn có tác dụng an thần, hạ sốt, giảm cảm giác buồn nôn, kháng khuẩn và kháng nấm [4]. Ngày nay, bạc hà sau khi thu hái được chế biến để đạt độ ẩm thích hợp (thường là sấy nhiệt hoặc sấy lạnh) và được sử dụng như một thức trà dùng hàng ngày.2 Phương pháp lên men 1.1 Tổng quan về phương pháp lên men Lên men (Fermentation) là một trong những biện pháp lâu đời nhất được con người sử dụng để bảo quản thực phẩm.

Đây là biện pháp với chi phí thấp, nhưng giúp đảm bảo tuổi thọ và sự an toàn cho thực phẩm [30]. Phải đến những năm 1850 - 1860, Louis Pasteur trở thành nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về quá trình lên men. Khi đó, ông đã chỉ ra rằng đây là quá trình được thực hiện nhờ các tế bào sống [20]. Tuy nhiên trên thực tế, quá trình lên men đã được sử dụng hàng nghìn năm trước bởi người dân ở nhiều khu vực trên thế giới để sản xuất thực phẩm, đồ uống và thậm chí là thuốc [23].

Nói một cách chính xác, lên men là quá trình phân hủy hoặc biến đổi kị khí các hợp chất hữu cơ nhờ vào sự trao đổi chất của các vi sinh vật. Tuy nhiên, xét một cách tổng quát hơn thì quá trình lên men có thể được coi là liên quan đến sự thay đổi hóa học của cơ chất, được thực hiện bởi các vi sinh vật hoặc các sản phẩm chiết tách từ vi sinh vật để tạo ra các sản phẩm hữu ích. Với định nghĩa này thì quá trình lên men có thể thực hiện trong điều kiện kị khí, hoặc hiếu khí, hoặc nhờ vào emzym chiết tách từ vi sinh vật [12]. Các sản phẩm lên men có thể xuất phát ban đầu từ những phát hiện tình cờ, như nước ép nho lên men trong quá trình bảo quản.

Những khám phá tình cờ này đã mở ra những thử nghiệm để tạo ra những thay đổi tương tự về đặc tính trên các thực phẩm khác nhau một cách chủ ý. Hệ VSV được sử dụng để lên men thực phẩm cũng rất đa dạng nhờ vào đặc tính hô hấp và quá trình tạo sản phẩm chuyển hóa của chúng. Nấm men được sử dụng trong lên men rượu, bia nhờ tạo ra Ethanol. Hay nhờ vào khả năng 5 tạo khí CO2 mà nhiều loại nấm men còn được sử dụng để lên men trong sản xuất bánh mì.

Nhiều loại vi khuẩn được sử dụng để tạo ra nhiều loại pho-mát, dưa chua và sữa chua. Một số loại nấm mốc được sử dụng để tạo ra một số loại pho-mát khác [12]. Lên men đã góp phần tạo nên sự đa dạng và những hương vị mới mẻ trong thực phẩm. Mỗi quá trình lên men, phụ thuộc vào cơ chất sử dụng, hệ VSV và điều kiện lên men sẽ cho ra các sản phẩm khác nhau với hương vị khác nhau.

Trước đó, các sản phẩm lên men chủ yếu chỉ là thực phẩm, nhưng ngày nay, nhiều ngành công nghiệp đã xuất hiện dựa trên quá trình lên men để tạo ra các nguyên vật liệu thiết yếu cho cuộc sống con người. Các ngành công nghiệp lên men hiện nay được áp dụng để sản xuất thực phẩm (sữa chua, pho-mát…) và thực phẩm chức năng (vitamin), sản phẩm dùng trong nông nghiệp (thuốc trừ sâu vi sinh), sản phẩm dùng trong ngành dược (vaccine, enzyme, kháng sinh,…), hóa chất công nghiệp (acetone, buthanol, acid citric,…), nhiên liệu sinh học… [23].2 Ứng dụng phương pháp lên men trong việc nâng cao giá trị của dược liệu 1.1 Nguyên tắc cơ bản Các loại thảo dược, dược liệu đã được sử dụng như những phương thuốc cổ truyền từ hàng nghìn năm. Dược liệu thô hoặc các sản phẩm chế biến, tách chiết từ dược liệu chứa đựng những thành phần có hoạt tính, mang lại giá trị chữa bệnh cho con người [13]. Theo ước tính, WHO đã đưa ra rằng ¾ dân số của các quốc gia đang phát triển sử dụng thuốc thảo dược như một biện pháp để chăm sóc sức khỏe ban đầu của họ [19].

Năm 2014, Luqman và cộng sự đã đưa ra rằng các bằng chứng quan trọng đã cho thấy sự hữu ích trong sử dụng thảo dược để điều trị và giảm nhẹ những rối loạn và bệnh tật [19]. Tuy nhiên, nhiều loại thảo dược cần có sự biến đổi sinh học của VSV trong hệ tiêu hóa để trở nên có hoạt tính, điều này đã cho thấy vai trò của quá trình lên men trong ứng dụng điều trị của thuốc thảo dược [13], [18]. Các nguyên tắc cơ bản của quá trình lên men vi sinh vật và biến đổi của thuốc thảo dược truyền thống có thể được tóm tắt thành các đặc điểm như sau [32]: 6 - VSV trong giai đoạn phát triển có thể tạo ra nhiều phân tử có hoạt tính sinh học như các loại enzyme: protease, amylase, cellulase, esterase và amidase. Chúng có vai trò trong tổng hợp và phân hủy các hợp chất.

Trong các phản ứng hóa học liên quan đến quá trình lên men thảo dược và dược liệu, các enzyme này giúp phân hủy và chuyển đổi chúng thành các thành phần mới. - Nhiều VSV có thể sử dụng các thành phần có hoạt tính trong thảo dược làm cơ chất để tạo ra các hợp chất mới, đồng thời các chất chuyển hóa của các VSV này và thuốc thảo dược cũng có thể tương tác với nhau để tạo thành các hợp chất mới cũng như có thể làm giảm độc tính của thuốc thảo dược.