Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Lê đình cảnh nghiên cứu phương pháp xác định

Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng IgG trong sữa bằng HPLC. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của Lê Đình Cảnh về phân tích chất lượng sản phẩm sữa.

• Tác giả: Lê Đình Cảnh
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Thị Ngọc Lan
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng Immunoglobulin G trong sữa và sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Immunoglobulin G trong sữa

Immunoglobulin G (IgG) là một protein kháng thể quan trọng được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm sữa, đóng vai trò then chốt trong hệ thống miễn dịch. Khóa luận của Lê Đình Cảnh tập trung nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng IgG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). IgG có cấu trúc phân tử độc đặc với hai phần chính: Fab (phần nhận biết kháng nguyên) và Fc (phần dễ kết tinh). Sữa và sản phẩm sữa chứa nồng độ IgG khác nhau tùy thuộc vào loại sữa và điều kiện xử lý. Việc xác định chính xác hàm lượng IgG là vô cùng quan trọng cho kiểm định chất lượng sản phẩm sữa trên thị trường Việt Nam.

1.1. Tính chất và chức năng của Immunoglobulin G

IgG là thứ lớp kháng thể phổ biến nhất trong cơ thể người, chiếm khoảng 75% tổng lượng kháng thể. Nó có khả năng trung hòa độc tố, hỗ trợ thực bào nuốt khuẩn, và kích hoạt hệ thống bổ thể. IgG trong sữa giúp bảo vệ đường tiêu hóa của trẻ sơ sinh, hỗ trợ hệ thống miễn dịch non nớp. Các phân lớp dưới của IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) có chức năng khác nhau, ảnh hưởng đến tính hiệu quả của miễn dịch.

1.2. Cấu trúc phân tử của IgG

IgG có cấu trúc hình chữ Y với khối lượng phân tử khoảng 150 kDa. Nó bao gồm bốn chuỗi polypeptit: hai chuỗi nặng (Heavy chain) và hai chuỗi nhẹ (Light chain). Phần Fab chứa vùng kết hợp kháng nguyên, cho phép IgG nhận biết và liên kết với các kháng nguyên cụ thể. Phần Fc chịu trách nhiệm tương tác với các tế bào miễn dịch khác. Cấu trúc này quyết định khả năng hoạt động miễn dịch của IgG.

II. Phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương pháp phân tích tiên tiến nhất để xác định hàm lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa. Phương pháp này dựa trên sự tách biệt các thành phần dựa vào các tính chất hóa học khác nhau. Khóa luận của Lê Đình Cảnh sử dụng sắc ký ái lực (Affinity Chromatography) kết hợp với HPLC để đạt độ chính xác cao. Phương pháp này cho phép định lượng IgG một cách nhanh chóng và hiệu quả, phù hợp cho kiểm định quy mô công nghiệp. Các điều kiện HPLC được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy cảm và độ chính xác cao nhất.

2.1. Sắc ký ái lực trong phân tích IgG

Sắc ký ái lực (AC) dựa trên tương tác đặc hiệu giữa IgG và các chất hấp thụ (ligand), thường là Protein G hoặc Protein A được gắn trên ma trận Sepharose. IgG liên kết chặt chẽ với các chất này, cho phép tách riêng khỏi các protein khác. Sau khi rửa, IgG được giải phóng bằng cách thay đổi pH hoặc nồng độ muối. Phương pháp sắc ký ái lực mang lại độ đặc hiệu rất cao và khả năng tách biệt hiệu quả các thành phần khác nhau.

2.2. Điều kiện tối ưu hóa HPLC

Nghiên cứu của Lê Đình Cảnh khảo sát nhiều thông số HPLC như pH dung dịch nạp, thể tích nạp, tốc độ dòng và thành phần pha động. Detector mảng diod (DAD) được sử dụng để phát hiện IgG ở bước sóng tối ưu. Quy trình xử lý mẫu cũng được tối ưu để loại bỏ các chất cản trở. Các điều kiện tối ưu này đảm bảo độ lặp lại cao và hàm lượng IgG được xác định chính xác nhất.

III. Thẩm định phương pháp xác định IgG

Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đảm bảo phương pháp HPLC phù hợp cho việc xác định IgG. Khóa luận của Lê Đình Cảnh thực hiện thẩm định phương pháp theo các tiêu chuẩn AOAC quốc tế. Các thông số thẩm định bao gồm: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ thu hồi. Kết quả cho thấy phương pháp có độ nhạy cảm cao, với LOD ở mức 0,01 mg/g. Độ lặp lại (RSD < 10%) và độ thu hồi (90-110%) đạt tiêu chuẩn, chứng tỏ phương pháp HPLC là đáng tin cậy.

3.1. Giới hạn phát hiện và định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) được xác định dựa trên tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3. Trong nghiên cứu này, LOD của IgG được thiết lập ở mức 0,01 mg/g với S/N = 3. Giới hạn định lượng (LOQ) được đặt ở mức 0,03 mg/g với S/N = 10. Các giới hạn này đủ thấp để định lượng IgG trong các mẫu sữa khác nhau, từ sữa tươi đến sữa bột.

3.2. Khoảng tuyến tính độ lặp lại và độ thu hồi

Khoảng tuyến tính được thiết lập từ LOQ đến 1 mg/g với hệ số tương quan R² > 0,99. Độ lặp lại (RSD) trong ngày và độ lặp lại khác ngày (RSD < 10%) cho thấy tính ổn định của phương pháp. Độ thu hồi được kiểm tra ở ba nồng độ khác nhau, kết quả dao động từ 90-110%, nằm trong khoảng chấp nhận. Những kết quả này xác nhận phương pháp HPLC có độ tin cậy cao.

IV. Đánh giá hàm lượng IgG trong sản phẩm sữa Việt Nam

Khóa luận của Lê Đình Cảnh tiến hành sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong các sản phẩm sữa khác nhau trên thị trường Việt Nam. Các mẫu được thu thập từ sữa tươi, sữa bột dành cho trẻ em và sữa bột cho người lớn. Kết quả cho thấy hàm lượng IgG dao động khá lớn tùy thuộc vào loại sữa, nguồn gốc và quy trình xử lý. Sữa tươi thường có nồng độ IgG cao hơn sữa bột do quy trình xử lý ít có ảnh hưởng. Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu tham khảo về chất lượng IgG trong sản phẩm sữa bán trên thị trường Việt Nam, giúp cơ quan kiểm định có căn cứ khoa học.

4.1. Kết quả phân tích sữa tươi và sữa bột

Các mẫu sữa tươi được phân tích cho thấy hàm lượng IgG trong khoảng 0,5-1,2 mg/g, tùy thuộc vào nguồn gốc và mùa vụ. Sữa bột dành cho trẻ em có nồng độ IgG tương đối cao (0,4-0,8 mg/g) vì được bổ sung thêm. Sữa bột người lớn có hàm lượng IgG thấp hơn (0,2-0,5 mg/g). Những khác biệt này phản ánh chính sách sản xuất và mục đích sử dụng của từng loại sản phẩm.

4.2. Ý nghĩa kiểm định chất lượng sản phẩm sữa

Phương pháp HPLC phát triển bởi Lê Đình Cảnh có thể ứng dụng trong kiểm định thường xuyên hàm lượng IgG ở các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm. Việc xác định IgG là một chỉ tiêu chất lượng quan trọng, đặc biệt cho sữa dành cho trẻ em. Phương pháp này giúp đảm bảo sản phẩm sữa trên thị trường có chất lượng theo tiêu chuẩn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan về Immunoglobulin G 1. Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G Immunoglobulin G (IgG) là một trong số những kháng thể của cơ thể người và động vật. IgG chiếm khoảng 80% tổng lượng kháng thể.

IgG chủ yếu xuất hiện trong huyết thanh, chiếm 75% của tất cả các Igs trong huyết thanh. IgG có chủ yếu trong các khoang ngoài mạch máu, là lớp duy nhất của Igs có khả năng đi qua nhau thai, do đó việc miễn dịch được đảm bảo truyền từ mẹ sang con. Chức năng quan trọng nhất của IgG là giúp cơ thể miễn dịch, thông qua quá trình hoạt hóa bổ thể. Chức năng khác của IgG là khả năng gắn các tế bào như các đại thực bào, các bạch cầu đơn nhân, các bạch cầu đa nhân trung tính một số tế bào lympho có các thụ thể Fc cho vùng Fc của IgG, giúp tế bào có thể tiếp nhận các kháng nguyên tốt hơn.

Chức năng của các phân lớp dưới của IgG được thể hiện ở Bảng 1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG Các Khả Khả năng gắn Thời gian phân Tỷ Khả năng năng qua thụ thể Fc trên bán hủy [12] TT lớp lệ hoạt hóa nhau các tế bào thực dưới % bổ thể thai bào IgG 1 IgG1 66 Có Cao thứ nhì Ái lực cao 21 ngày 2 IgG2 23 Không Cao thứ ba Ái lực rất thấp 21 ngày 3 IgG3 7 Có Cao nhất Ái lực cao 7 ngày 4 IgG4 4 Có Không Ái lực trung bình 21 ngày -2- 1. Cấu trúc của immunoglobulin G IgG gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S). Tất cả các IgG là monomer (globulin miễn dịch 7S) Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng.

Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi (kí hiệu VL), nằm phía đầu amin (-NH2) của phân tử. Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL) nằm phía đầu carboxyl (-COOH). Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa. Ngược lại, trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

Cấu tạo của IgG [9] Chuỗi nặng: IgG được cấu thành bởi chuỗi nặng gamma. Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit amin: một vùng biến đổi và ba vùng cố định. Vùng biến đổi (kí hiệu là VH) nằm phía đầu amin đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên (paratop). Vùng cố định nằm phía đầu carboxyl, chia làm 3 vùng nhỏ có kí hiệu CH1, CH2 và CH3.

Giữa vùng CH1 và CH2 là vùng khớp nối có tác dụng như bản lề làm cho phân tử có hình chữ Y và có thể điều chỉnh cho hai paratop gắn với epitop của kháng nguyên. Hai cánh tay của chữ Y còn gọi là đoạn gắn kháng nguyên Fab (F: fragment, ab: antigen binding), là phần nhận biết kháng nguyên [13]. Dưới tác dụng của papain, phân tử kháng -3- thể bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một nửa chuỗi nặng có đầu amin. Một mảnh chính là Fab, mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu carboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable).

Mảnh này có thể liên kết với đại thực bào, tế bào B và bổ thể. Các phân lớp dưới IgG khác nhau về số lượng liên kết disulfid và chiều dài của vùng bản lề. Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa IgG có thể được đưa vào cơ thể qua tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, hoặc bổ sung qua đường ăn uống bằng việc sử dụng các loại thực phẩm chức năng, sữa non và sữa công thức. Trong sữa và sữa non của bò, immunoglobulin G (IgG; phân lớp dưới IgG1 và IgG2) là thành phần miễn dịch chính, mặc dù mức IgA thấp và IgM cũng có mặt [7, 8].

Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG Nồng độ (mg/ml) Loài Kháng thể Huyết thanh Sữa non Sữa IgG 25,0 32–212 0,72 IgG1 14,0 20–200 0,60 Bò IgG2 11,0 12,0 0,12 IgA 0,4 3,5 0,13 IgM 3,1 8,7 0,04 IgG 12,1 0,4 0,04 Người IgA 2,5 17,4 1,00 IgM 0,9 1,6 0,10 Ở động vật nhai lại như bò, IgG1 cấu thành khoảng 80% tổng hàm lượng Igs trong sữa, trong khi Igs chủ yếu trong sữa ở hầu hết các loài có vú không nhai lại khác (bao gồm cả con người) là IgA. IgA và IgM cũng được tổng hợp bởi các tế bào biểu mô hoặc tế bào biểu mô tuyến vú [18]. Các phương pháp định lượng IgG Có nhiều phương pháp để xác định nồng độ của IgG phù hợp với từng khoảng nồng độ và nền mẫu khác nhau. Nồng độ IgG có thể được xác định một cách đơn giản bằng đo quang [3].

Các phép đo như vậy thường được áp dụng đối với nồng độ chuẩn tinh khiết tuân theo định luật Lamber - Beer. Hai nhóm phương pháp cơ bản để phân tích IgG dựa trên tách hoặc miễn dịch. Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch Các kỹ thuật này dựa trên sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể (hoặc protein gắn kết). Các nhóm phương pháp này có ưu điểm lã dễ phát hiện sự thay đổi cấu trúc của protein (bao gồm cả IgG) và có thể phát hiện các sản phẩm làm giả.

Miễn dịch khuếch tán (Radial imminodifusion, RID) Miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật được Mancini sử dụng và mô tả đầu tiên [26]. Kỹ thuật này sử dụng một kháng huyết thanh được hòa tan vào thạch đun lỏng, và hỗn hợp thạch- kháng huyết thanh được đổ rải đều lên một phiến kính đặt trên mặt phẳng ngang. Sau khi thạch đông, người ta đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh chứng vào. Kháng nguyên, mà trong trường hợp này là immunoglobulin G, sẽ khuếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng huyết thanh xung quanh.

Bởi vì nồng độ kháng thể (kháng huyết thanh trong thạch) cố định nên khi kháng nguyên trong lỗ khuếch tán thì nồng độ giảm dần cho đến khi có tỉ lệ thích hợp với nồng độ kháng thể trong thạch thì một vòng tủa sẽ hình thành. Đối với mỗi mẻ người ta làm ba lỗ chứa kháng nguyên với nồng độ biết trước để vẽ thành đường chuẩn [5]. Giới hạn định lượng của RID là khoảng từ 50 mg/ml – 150 mg/ml [9]. Do đó phương pháp này không phù hợp để định lượng IgG có hàm lượng thấp trong sữa.

Phản ứng miễn dịch Elisa Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản -5- ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản.

ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, thực hiện qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. Phương pháp định lượng IgG bằng phương pháp Elisa có thể định lượng 1ng/ml [14]. Tuy nhiên khoảng tuyến tính của phương pháp này khá nhỏ khi phân tích mẫu thực cần pha loãng rất nhiều lần, dẫn đến việc tốn thời gian, hoá chất và sai số do pha loãng.

Mặc dù các bộ kit định lượng trên thị trường đã thương mại hóa nhưng giá thành vẫn còn rất cao, tốn kém chi phí vì chỉ được dùng được một lần. Phương pháp cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) (surface plasmon resonance). Cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR) là quá trình phát hiện bằng quang học xảy ra khi ánh sáng đi vào lăng kính được phủ lớp kim loại (vàng) mỏng. Dưới điều kiện cố định (bước sóng, phân cực, góc tới), các điện tử tự do tại bề mặt hấp thụ photon ánh sáng và chuyển đổi chúng sang sóng plasmon bề mặt.

Sự suy giảm phản xạ của ánh sáng sẽ được nhìn thấy dưới điều kiện của SPR. Trong phương pháp định lượng IgG thì gắn trên bề mặt kim loại là các phối tử (kháng nguyên cố định), khi mẫu thực di chuyển qua thì IgG liên kết với kháng nguyên làm thay đổi chỉ số phản xạ. Độ thay đổi này tỉ lệ với số lượng liên kết (hay nồng độ IgG). Quá trình được theo dõi trong một khoảng thời gian, để số lượng IgG trong mẫu liên kết toàn bộ với kháng nguyên trên bề mặt.

Các mẫu tiếp theo được chảy qua khi trên bề mặt khi các IgG liên kết với kháng nguyên đã được loại bỏ và IgG được rửa giải ra ngoài. Quá trình thực -6- hiện với các mẫu có nồng độ IgG chuẩn từ đó nội suy cho các mẫu cần phần tích với nồng độ IgG chưa xác định. Xét nghiệm miễn dịch dựa trên SPR có ưu điểm cho việc phân tích các protein sữa nhỏ. Một xét nghiệm miễn dịch sinh học tự động sử dụng SPR quang học đã được sử dụng để định lượng IgG.

Khoảng định lượng của phương pháp này từ 0,08-25 µg/ml. Phương pháp plasmon bề mặt 1. Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách Cả hai phương pháp sắc ký lỏng và kỹ thuật điện di đều phù hợp để xác định và định lượng IgG trong nền mẫu phức tạp bao gồm sữa bò và sữa non. Thông thường, casein được loại bỏ trước khi phân tích tách, do casein chiếm phần lớn protein trong sữa.

Điện di gel Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách và đôi khi tinh chế các chất đặc biệt là các protein và các acid nucleotide trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và hình dạng của chúng. -7- Các phân tử protein và acid nucleic có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamid gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamid được sử dụng phổ biến nhất.