Khóa luận: Nghiên cứu quy trình làm giàu triterpen từ dịch chiết rau má

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Phạm minh thu nghiên cứu quy trình làm giàu triterpen từ dịch chiết rau má khóa luận tốt nghiệp, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Phạm Minh Thu
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Hiền
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình làm giàu triterpen từ dịch chiết rau má
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Rau Má và Triterpenoid

Rau Má (Centella asiatica) là một loài thực vật dược liệu quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và y học hiện đại. Cây Rau Má chứa nhiều hợp chất hoạt tính, đặc biệt là triterpenoid - một nhóm các thành phần sinh hoạt quan trọng có tác dụng chữa bệnh đáng kể. Triterpenoid trong Rau Má bao gồm asiaticosid, madecasosid và nhiều hợp chất khác, được chứng minh có khả năng giảm viêm, tăng cường miễn dịch và hỗ trợ việc chữa lành vết thương. Việc làm giàu triterpenoid là một quy trình quan trọng để tăng nồng độ các thành phần có giá trị này trong dịch chiết, từ đó nâng cao hiệu quả dược liệu và mở rộng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của Rau Má

Rau Má là cây thảo本thân có thân bò sát đất, lá hình quạt nhỏ, phân bố rộng rãi ở các vùng ẩm ướt của Đông Nam Á. Cây phát triển tốt trong môi trường ẩm, ánh sáng vừa phải và đất giàu chất hữu cơ. Toàn cây, đặc biệt là lá và thân có giá trị dược liệu cao, được sử dụng để điều trị các bệnh về da, tâm thần và tuần hoàn máu.

1.2. Thành phần hoạt tính và tác dụng dược lý

Thành phần chính của Rau Má bao gồm triterpenoid (asiaticosid 40-60%, madecasosid 20-30%), flavonoid, acid phenolic và các chất khác. Các triterpenoid này có tác dụng kháng viêm, tăng cường đục bạch cầu, cải thiện tuần hoàn máu, hỗ trợ chữa lành vết thương và điều trị các bệnh da liễu, rối loạn thần kinh.

II. Quy trình Làm Giàu Triterpenoid Phương pháp và Kỹ thuật

Làm giàu triterpenoid từ Rau Má là một quy trình phức tạp yêu cầu kỹ thuật và hiểu biết sâu sắc về hóa dược. Phương pháp kết tủa bằng ethanol (alcohol precipitation) là một trong những kỹ thuật hiệu quả nhất, được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm dược học. Quy trình này dựa trên nguyên lý khác nhau về độ tan của các hợp chất trong ethanol và nước. Ngoài ra, các phương pháp khác như tinh chế bằng nhựa trao đổi ion, nhựa xốp macroporous, kết tinh phân đoạn và sử dụng than hoạt cũng được áp dụng. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, phụ thuộc vào mục tiêu, quy mô sản xuất và các yếu tố kinh tế.

2.1. Phương pháp kết tủa bằng ethanol

Kết tủa bằng cồn là phương pháp sử dụng ethanol để tách chiết và làm giàu triterpenoid. Quá trình bao gồm: chiết xuất dịch Rau Má, pha loãng hoặc điều chỉnh nồng độ ethanol, để tủa ở điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định, sau đó lọc và tập trung tủa. Phương pháp này đơn giản, chi phí thấp, hiệu suất cao và dễ kiểm soát.

2.2. Các phương pháp tinh chế bổ trợ

Nhựa trao đổi ion và nhựa xốp giúp loại bỏ các tạp chất bằng cách hấp phụ và trao đổi. Kết tinh phân đoạn dựa vào sự khác biệt độ tan để tách các hợp chất. Than hoạt loại bỏ màu sắc, mùi vị và tạp chất. Các phương pháp này thường được kết hợp để đạt độ tinh khiết cao nhất.

III. Nghiên cứu và Thẩm định Phương pháp Làm Giàu

Nghiên cứu làm giàu triterpenoid từ dịch chiết Rau Má bao gồm nhiều khía cạnh quan trọng. Trước tiên, cần xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) để xác định nồng độ asiaticosid và madecasosid. Sau đó, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng như nồng độ dịch chiết, nồng độ ethanol, tỷ lệ thể tích, thời gian để tủa và nhiệt độ để tủa. Mỗi yếu tố được nghiên cứu một cách có hệ thống để xác định điều kiện tối ưu. Kết quả từ các thí nghiệm được phân tích thống kê, từ đó xây dựng quy trình làm giàu hoàn chỉnh ở quy mô phòng thí nghiệm.

3.1. Phương pháp định lượng HPTLC

HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) là kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao dùng để định lượng chính xác triterpenoid. Phương pháp này yêu cầu xây dựng đường chuẩn, xác định điều kiện sắc ký phù hợp, đánh giá độ lặp lại, độ chính xác, tính tuyến tính. Thẩm định đảm bảo phương pháp đáng tin cậy, chính xác theo tiêu chuẩn AOAC.

3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa

Các yếu tố quan trọng được khảo sát bao gồm: nồng độ dịch chiết ban đầu, nồng độ ethanol sử dụng, tỷ lệ thể tích dịch chiết:ethanol, thời gian để tủa (từ vài giờ đến hàng ngày) và nhiệt độ để tủa (thường 2-4°C hoặc nhiệt độ phòng). Mỗi yếu tố được biến đổi một cách có kiểm soát để tìm điều kiện cho hiệu suất và độ tinh khiết tối đa.

IV. Ứng dụng và Triển vọng Phát triển Quy trình Làm Giàu Triterpenoid

Làm giàu triterpenoid từ Rau Má có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Các sản phẩm chứa triterpenoid đã được phê duyệt và sử dụng rộng rãi để điều trị viêm da, cải thiện tuần hoàn, hỗ trợ chữa lành vết thương và các vấn đề sức khỏe khác. Quy trình làm giàu giúp tăng nồng độ hoạt chất, giảm lượng nguyên liệu cần thiết, nâng cao giá trị kinh tế và hiệu quả sản xuất. Triển vọng phát triển bao gồm: cải tiến phương pháp để tăng hiệu suất, giảm chi phí sản xuất, ứng dụng công nghệ mới như chiết xuất siêu âm, vi sóng, hoặc chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn (supercritical CO₂), đồng thời đánh giá độ ổn định và an toàn của sản phẩm cuối cùng.

4.1. Ứng dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm

Triterpenoid từ Rau Má được ứng dụng trong các sản phẩm điều trị viêm da, vết thương, rối loạn tuần hoàn và các vấn đề làm đẹp da. Các hợp chất asiaticosid và madecasosid là những thành phần chính được cô đặc trong các sản phẩm dược phẩm cao cấp, giúp tăng cường tác dụng dược lý và giá trị thương mại.

4.2. Triển vọng công nghệ và phát triển bền vững

Các công nghệ chiết xuất hiện đại như siêu âm, vi sóng, supercritical CO₂ hứa hẹn tăng hiệu suất và giảm tác động môi trường. Phát triển quy trình bền vững, sử dụng dung môi thân thiện với môi trường, tái chế và giảm thiểu chất thải là những hướng đi quan trọng. Nghiên cứu tiếp tục về độ ổn định, độ sinh học khả dụng của sản phẩm sẽ mở rộng ứng dụng lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về cây Rau Má 1. Tên gọi - Tên khoa học: Centella asitica (L. - Tên nước ngoài: Gotu Kola (Anh), Brahmi (Ấn Độ), Phanok (Vientian), Centelle, Besvillacque (Pháp), Trachie Ktranh (Campuchia) [2], Asiatischer Wassernabel (Đức), Luei Gong Gen (Trung Quốc),… - Tên tiếng Việt: Rau Má, Tich tuyết thảo, Liên tiền thảo [7] 1.

Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [8], cây Rau má thuộc chi Centella (L.) Urban, một chi nằm trong họ Hoa tán (Apiaccae). Vị trí phân loại của loài Centella asiatica (L.) Urb trong hệ thống phân loại có thể tóm tắt như sau: Giới: Thực vật Ngành: Ngọc Lan (Magoliopshyta) Lớp: Ngọc Lan (Magoliopsida) Bộ: Nhân sâm (Apiales) Họ: Hoa tán (Apiaccae) Chi: Centella asiatica (L.) Urban Theo Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Bộ [7], chi Centella (L.) Urban ở Việt Nam chỉ có một loài, C. asiatica, trong khi đó chi Centella (L.) Urban trên thế giới có hơn 50 loài theo The plant list đã được công nhận. Đặc điểm thực vật Rau má là một loài cây thân thảo, cao 7–10 cm, tuy nhiên một số cây có thể cao lên tới 25 cm [9].

Thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu. Thân phân nhánh nhiều trên mặt đất, thân gầy, nhẵn Lá mọc so le, nhưng thường tụ họp 2–5 cái ở một đốt thân, phiến lá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo, rộng 2-4 cm; cuống lá mảnh, dài 2-4 cm trong những nhánh mang hoa và dài đến 10-12 cm trong những nhánh thường [10]. Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ ở kẽ lá, mỗi tán mang 1–5 hoa (thường là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ. Hoa giữa không có cuống, tổng bao có 2–3 mảnh hình trái xoan, lõm, dạng màng; cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao 2 phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [11].

Các hoa lưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3mm), với thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị và 2 vòi nhụy. Quả dẹt, rộng 3-5 cm có sống hơi rõ, màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7- 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có vân mạng [11]. Đây là điểm phân biệt nó với các loài trong chi Hydrocotyle có quả với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụn cơm.

Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng đứng. Chúng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ [6]. (2) (3) (4) (1) Chú thích ảnh: 1. Đặc điểm thực vật cây Rau má [12] Toàn cây khi tươi có vị đắng, hăng hơi khó chịu, khi khô thì chỉ còn mùi cỏ khô.

Sinh thái: Cây mọc thành đám trên các bãi hoang, bờ ruộng, ven đường, dọc đường sắt, nơi ẩm mát, mùa ra quả kéo dài từ tháng 4 đến tháng 6. Phân bố và sinh thái Chi Centella (L.) Urban phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, còn loài Centella asiatica (L.) chỉ thấy ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á, các tỉnh Nam Trung Quốc bao gồm cả đảo Hải Nam [11]. Ở Việt Nam, Rau má là loại cây rất quen thuộc. Cây mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi, độ cao dưới 1800 m.

Ở một số nơi thuộc vùng Nam và Đông Nam Á, Rau má phân bố đến độ cao 2500 m. Cây ưa ẩm, hơi chịu bóng; thường mọc thành đám ở vườn, bãi sông suối, nương rẫy, bờ ruộng cao và ven rừng. Rau má sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, đến mùa đông (ở miền Bắc) hay mùa khô (ở miền Nam), cây có hiện tượng bán tàn lụi. Cây ra hoa và quả nhiều vào cuối mùa hè hoặc đầu mùa thu, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt.

Do có khả năng đẻ nhánh khỏe, cây rau má thường mọc thành từng đám dày đặc nên lấn áp các loài cỏ khác [11]. Do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng ở nhiều nước như Madagasca, Sri lanka, Philippin và miền Nam Việt Nam, người ta đã tiến hành trồng rau má để làm thuốc hoặc nước giải khát. Ở Việt Nam, cây rau má chủ yếu mới được khai thác sử dụng tại chỗ [11]. Bộ phận dùng Bộ phận dùng của rau má là toàn cây.

Rau má có thể thu hái quanh năm. Để làm thuốc, rau má thường dùng tươi hoặc sao vàng [6]. Ngoài ra, rau má cũng được sử dụng như loại rau thường ngày. Rau má được dùng xay nhỏ hay giã nát, lọc lấy nước, thêm đường làm nước giải khát, tiêu độc [13].

Thành phần hóa học Rau má chứa nhiều hợp chấp có hoạt tính sinh học như các saponin triterpenoid, các phytosterol, tinh dầu (vallerrin, camphor, cineol), các khoáng chất (Ca, Fe, Mg, Mn, P, Zn…), các loại Vitamin (B1, B2, B3, C và K), amino acid cần thiết (glutamic, serin, threonin, alanin, lysin, histidin), tanin và alkaloid có tên là hydrooctylin [14]. Triterpenoid Đây là thành phần chính và quan trọng nhất của rau má, được dùng làm chất đối chiếu hay “dấu vân tay” của rau má trong lĩnh vực kiểm nghiệm. Các triterpenoid có cấu trúc là dẫn chất pentacyclic nhóm ursan và oleanan, gồm 4 chất chính là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic và acid madecassic, ngoài ra còn có triterpenoid khác như asiaticosid (B, C, D, E, F), brahmosid, brahminosid, thankunisid, isothankunisid,… [11]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), dược liệu rau má phải đảm bảo không chứa dưới 2% tổng lượng triterpenoid ester glycosid (asiaticosid và madecassosid)[15].

4 Trong nghiên cứu của Brinkhaus (2000) cho thấy hàm lượng saponin triterpenoid trong rau má dao động từ 1% đến 8% tùy vào vùng canh tác và thời điểm thu hái. Các hợp chất được phát hiện bao gồm: asiaticosid, centelloside, madecassosid, brahmoside, brahminoside, thankuniside, sceffoleoside, centellose, cùng với các axit triterpenoid như axit asiatic, axit brahmic, axit centellic và axit madecassic. Tuy nhiên, bốn hợp chất chiếm tỷ lệ lớn nhất vẫn là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic và acid madecassic [1]. Flavonoid Bên cạnh nhóm chất chính triterpenoid, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong rau má còn chứa phong phú các hợp chất flavonoid.

Zainol và cộng sự (2003) đã phân lập thành công 5 flavonoid từ rau má, đó là quercetin, kaempferol, catechin, rutin và naringin. Những hợp chất này thuộc nhóm polyphenolic và đóng vai trò quan trọng trong tác dụng chống oxy hóa cũng như khả năng ngăn chặn gốc tự do của dịch chiết rau má [16]. Trong khi đó, Matsuda và cộng sự (2001) đã phân lập được flavonol có tên là petuletin và kaempferol 3-O-β-D-glucuronid từ phần trên mặt đất của rau má. Ngoài các flavonoid kể trên, loài này còn chứa một số hợp chất khác như castilliferol, castillicetin,… [18].

Tinh dầu Theo Quin và cộng sự (1998), thành phần tinh dầu của rau má tương tự như những loài Hydrocotyle sp. của họ Apiaceae. Bằng phương pháp GC-MS, tác giả đã xác định được 45 thành phần từ tinh dầu rau má, trong đó caryophyllen, farnesol và emelen là các thành phần chính [19].Trong khi đó, nghiên cứu của Oyedeji và cộng sự tại Nam Phi (2005) cũng chỉ ra βcaryophyllen là thành phần chủ đạo trong tinh dầu của rau má [20]. Nhóm chất khác Bên cạnh 3 nhóm chất triterpenoid, flavonoid và tinh dầu, thành phần hóa học của cây rau má rất phong phú như alcaloid, tanin, vitamin, chất khoáng, acid amin,… trình bày các nhóm chất khác trong cây rau má [11], [18].

Tác dụng dược lý và công dụng của cây Rau má 1. Tác dụng bảo vệ gan Nghiên cứu của Irmak Ferah Okkay và cộng sự cho thấy rau má có khả năng bảo vệ gan khỏi tổn thương do cisplatin gây ra bằng cách giảm các enzym AST, ALT và ALP, đồng thời hạ nồng độ các chỉ dấu căng thẳng oxy hóa như MDA và ROS và tăng 5 hoạt tính của các chất chống oxy hóa nội sinh như SOD, CAT và GSH. Rau má còn ức chế quá trình viêm gan thông qua giảm sinh TNF-α, IL-1β và NF-κB [21]. Tác dụng bảo vệ gan của rau má đã được kiểm chứng trên nhiều mô hình khác nhau.

Trong các thí nghiệm in vitro, rau má thể hiện hiệu quả chống ung thư gan. Phân đoạn glycosid từ rau má hiệu quả trong việc cải thiện các tổn thương xơ hóa gan do dimethylnitrosamin ở chuột [22]. Ở mô hình gây độc gan bằng cyclophosphamide (CYP), các saponin triterpenoid từ Rau má giúp điều hòa chức năng gan thông qua việc phục hồi sản xuất cytokine, từ đó làm giảm tổn thương gan [23]. Tác dụng bảo vệ da làm, lành vết thương Rau má và acid asiatic được chứng minh có tác dụng làm lành vết thương thông qua nhiều giai đoạn của quá trình làm lành da.

Một trong những cơ chế được kể đến là: tăng tổng hợp collagen I và fibronectin, duy trì kiên kết, tăng sinh nguyên bào sợi; qua đó có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình làm lành vết thương. Năm 1996, Suguna và cộng sự chứng minh rằng việc sử dụng chiết xuất ethanolcủa Rau má bằng đường uống giúp thúc đẩy việc giảm diện tích vết thương và chữa lành nhanh hơn [24], [25]. Tác dụng lên tim mạch Theo một nghiên cứu của Nyuk Jet Chong và Zoriah Aziz và cộng sự, Rau má có thể có lợi cho việc cải thiện các dấu hiệu và triệu chứng của suy giãn tĩnh mạch mạn tính [26]. Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng và mù đôi trên bệnh nhân bị tăng huyết áp tĩnh mạch, rau má và các saponin từ rau má đã được chứng minh giúp giảm phù mắt cá chân, cải thiện vi tuần hoàn và tăng cường hiệu quả lọc ở mao mạch, đồng thời tác dụng này phụ thuộc vào liều lượng sử dụng [27], [28].

Rau má có tác dụng bảo vệ tế bảo cơ tim khỏi tác động của chất gây tổn thương cơ tim (Adriamycin) [29] và cải thiện tình trạng tồn thương tái tưới máu và thiếu máu cục bộ cơ tim (nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim) ở chuột thí nghiệm [30]. Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung thư Phân đoạn tinh chế từ dịch chiết methanol Rau má cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư mà không gây độc đối với tế bào lympho. Ngoài ra, dịch chiết cũng thể hiện tác dụng phòng ngừa ung thư đại tràng [31], hoạt chất acid asiatic có tác dụng chống ung thư da [19]. Các thử nghiệm dược lý cho thấy các sản phẩm thoái giáng của pectin SA3 trong Rau má có tác dụng kích thích miễn dịch [6].

Acid asiatic trong Rau má hoạt động như 6 một một tác nhân trị liệu miễn dịch chống khối u, nhờ tác dụng cảm ứng lên Smad7 kết hợp với naringenin [32]. Trong nghiên cứu của Michał Wiciński và cộng sự năm 2024, acid asiatic trong Rau má tham gia ức chế quá trình phosphoryl hóa, gây chết tế bào và giảm sự phát triển và di căn của khối u bằng cách tác động đến các con đường truyền tín hiệu quan trọng trong tế bào ung thư như PI3K, Akt, mTOR, p70S6K và STAT3 [32].