Khóa luận tốt nghiệp sư phạm sinh học khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y graphis sp

Luận văn tốt nghiệp giáo dục nghiên cứu tốt nghiệp sư phạm sinh học khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Nguyễn Bảo Châu
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Minh Định
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học
• Đề tài: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y Graphis sp.
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Lí do chọn đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu
• 1.5. Phạm vi nghiên cứu
• 1.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: ĐỊA Y VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG
• 1.1. Địa y
• 1.2. Địa y thuộc Chi Graphis
• 1.3. Hoạt tính sinh học của địa y thuộc chi GrappÌiis
• 1.3.1. Tổng quan về hoạt tính sinh học
• 1.3.2. Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn
• 1.3.3. Tổng quan vi khuẩn Staplycoccus đir€WS
• 1.3.4. Tổng quan về môi trường MHA
• 1.3.5. Tổng quan về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 1.3.6. Tổng quan về enzyme α-glucOSiđaS
• 1.3.7. Tổng quan về các chất ức chế enzyme a-glucosidase
• 1.3.8. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh địa y
• 1.3.9. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị và hoá chất
• 2.2. Phương pháp tách chiết DNA
• 2.3. Phương pháp PCR
• 2.4. Phương pháp điện di, giải trình tự
• 2.5. Phương pháp nuôi nấm cộng sinh địa y Graphs Sp
• 2.6. Phương pháp tạo cao thô ethyl acetate
• 2.7. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học
• 2.8. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
• 2.9. Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 2.10. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả định danh nấm cộng sinh địa y Graphis sp. bằng sinh học phân tử
• 3.2. Kết quả nuôi nấm cộng sinh địa y Graphis Sp
• 3.2.1. Nấm nuôi trên môi trường Mix
• 3.2.2. Nấm nuôi trên môi trường Sabouraud
• 3.3. Kết quả tạo cao thé ethyl acetate từ nấm cộng sinh địa y Graphis sp
• 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học
• 3.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với S
• 3.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1. Hình chụp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase ở 8 loại cao
• Phụ lục 2. Xử lý số liệu trên phần mềm GrapPad Prism §

Tóm tắt

I. Khám phá nấm cộng sinh địa y và hoạt tính sinh học ẩn giấu

Địa y là một dạng sống phức hợp, không phải một cá thể đơn lẻ mà là một hệ sinh thái thu nhỏ. Cấu trúc này hình thành từ mối quan hệ cộng sinh bền chặt giữa một loài nấm (gọi là mycobiont) và một hoặc nhiều đối tác có khả năng quang hợp (gọi là photobiont), thường là tảo lục hoặc vi khuẩn lam. Trong mối liên kết này, nấm cung cấp cấu trúc, nơi trú ẩn, nước và khoáng chất, đồng thời bảo vệ đối tác quang hợp khỏi bức xạ UV và các tác nhân gây hại. Ngược lại, tảo hoặc vi khuẩn lam thực hiện quá trình quang hợp, tạo ra carbohydrate để cung cấp dinh dưỡng cho cả hai. Sự hợp tác độc đáo này cho phép địa y tồn tại và phát triển ở những môi trường khắc nghiệt nhất, từ vùng cực băng giá đến sa mạc khô cằn, nơi mà mỗi thành phần riêng lẻ không thể sống sót. Chính trong điều kiện sống đầy thách thức đó, nấm cộng sinh địa y đã tiến hóa để tổng hợp nên một kho tàng các hợp chất thứ cấp đa dạng, điển hình là axit địa y. Các hợp chất này không chỉ giúp chúng thích nghi và cạnh tranh sinh học mà còn mang lại những hoạt tính sinh học quý giá, mở ra tiềm năng lớn trong các lĩnh vực y dược và công nghệ sinh học. Các nghiên cứu về ảnh hưởng môi trường đến hoạt tính của chúng đang ngày càng được quan tâm, vì việc hiểu rõ cơ chế này sẽ giúp khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên độc đáo này.

1.1. Giải mã mối quan hệ cộng sinh giữa mycobiont và photobiont

Mối quan hệ cộng sinh trong địa y là một trong những ví dụ điển hình và thành công nhất về sự hợp tác giữa các giới sinh vật khác nhau. Thành phần nấm, hay mycobiont, chiếm phần lớn sinh khối và quyết định hình thái bên ngoài của địa y. Sợi nấm bao bọc chặt chẽ các tế bào của đối tác quang hợp, hay photobiont, tạo thành một cấu trúc bền vững. Photobiont có thể là tảo lục (ví dụ: chi Trebouxia) hoặc vi khuẩn lam (ví dụ: chi Nostoc). Thông qua quang hợp của tảo, các chất hữu cơ như carbohydrate được tạo ra và chuyển giao cho nấm, cung cấp nguồn năng lượng chính cho toàn bộ cơ thể địa y. Đổi lại, mycobiont bảo vệ photobiont khỏi sự mất nước, cường độ ánh sáng cao và các loài ăn thực vật. Mối liên kết này chặt chẽ đến mức nhiều loài nấm và tảo tham gia không thể tồn tại độc lập trong tự nhiên. Sự tương tác phức tạp này là nền tảng cho sự tồn tại và sinh trưởng địa y trong các hệ sinh thái đa dạng.

1.2. Hợp chất thứ cấp Vũ khí sinh học của nấm cộng sinh địa y

Để tồn tại trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt và cạnh tranh với các sinh vật khác, nấm cộng sinh địa y tổng hợp một loạt các hợp chất thứ cấp độc đáo, không có ở các nhóm sinh vật khác. Các hợp chất này, thường được gọi chung là axit địa y, bao gồm các nhóm hóa học đa dạng như depside, depsidone, dibenzofuran, và xanthone. Chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế thích nghi của địa y, chẳng hạn như chống lại tia cực tím, ngăn cản sự tấn công của vi sinh vật và động vật ăn cỏ. Đặc biệt, nhiều hợp chất này đã được chứng minh là có hoạt tính sinh học mạnh mẽ như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống oxy hóa, và cả khả năng ức chế enzyme. Nghiên cứu của Makhija et al. (2010) trên chi Graphis đã cho thấy các hợp chất như norstictic và stictic có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, mở ra tiềm năng ứng dụng trong mỹ phẩm và y học.

II. Thách thức từ môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính nấm địa y

Mặc dù có khả năng thích nghi phi thường, địa y lại cực kỳ nhạy cảm với những thay đổi của môi trường, đặc biệt là ô nhiễm không khí. Cấu trúc sinh học không có lớp biểu bì bảo vệ và khả năng hấp thụ trực tiếp các chất từ khí quyển khiến chúng tích tụ các chất ô nhiễm một cách dễ dàng. Các chất như lưu huỳnh đioxit (SO2), oxit nitơ (NOx) và kim loại nặng có thể gây tổn hại nghiêm trọng đến photobiont, làm gián đoạn quá trình quang hợp và ảnh hưởng trực tiếp đến sự sống còn của địa y. Do đó, sự suy giảm hoặc biến mất của các quần thể địa y thường là dấu hiệu cảnh báo sớm về suy thoái môi trường. Chính vì vậy, chúng được xem là chỉ thị sinh học môi trường hiệu quả. Ngoài ra, biến đổi khí hậu, với sự thay đổi về nhiệt độ môi trường và độ ẩm không khí, cũng đang đặt ra những thách thức lớn đối với sự phân bố địa y và đa dạng sinh học. Sự nhạy cảm này không chỉ ảnh hưởng đến sự tồn tại của chúng mà còn tác động trực tiếp đến việc sản sinh các hợp chất có hoạt tính, đặt ra bài toán về việc làm sao để khai thác bền vững nguồn tài nguyên này.

2.1. Ô nhiễm không khí Kẻ thù vô hình của đa dạng sinh học địa y

Địa y được mệnh danh là "lá phổi của Trái Đất" không chỉ vì vai trò trong hệ sinh thái mà còn vì chúng là một chỉ thị sinh học môi trường đáng tin cậy cho chất lượng không khí. Do không có hệ thống rễ và lớp cutin bảo vệ, chúng hấp thụ toàn bộ nước và dinh dưỡng từ khí quyển, bao gồm cả các chất ô nhiễm. Các chất độc hại như lưu huỳnh đioxit (SO2) và kim loại nặng (chì, thủy ngân, kẽm) khi tích tụ sẽ phá hủy chất diệp lục trong tế bào tảo, ức chế quá trình quang hợp và cuối cùng giết chết địa y. Sự vắng mặt của các loài địa y nhạy cảm ở các khu vực đô thị và công nghiệp là một minh chứng rõ ràng cho mức độ ô nhiễm không khí tại đó. Việc theo dõi sự thay đổi trong quần thể và phân bố địa y là một phương pháp chi phí thấp và hiệu quả để đánh giá tác động môi trường.

2.2. Yếu tố vô sinh và sự biến động trong hoạt tính sinh học

Các yếu tố vô sinh như cường độ ánh sáng, nhiệt độ môi trường, và độ ẩm không khí đóng vai trò quyết định đến quá trình sinh lý và sinh hóa của địa y. Những thay đổi dù nhỏ trong các yếu tố này cũng có thể ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học. Ví dụ, cường độ ánh sáng cao có thể kích thích địa y sản sinh các sắc tố và hợp chất chống tia UV, trong khi nhiệt độ và độ ẩm tối ưu sẽ thúc đẩy tốc độ sinh trưởng địa y và quá trình quang hợp. Tuy nhiên, khi các yếu tố này vượt ra ngoài ngưỡng chịu đựng, chúng sẽ gây ra stress oxy hóa, làm suy giảm hoạt tính sinh học và thậm chí dẫn đến cái chết của địa y. Biến đổi khí hậu đang làm trầm trọng thêm những biến động này, gây khó khăn cho việc thu hái và nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ địa y.

III. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng môi trường đến hoạt tính địa y

Để hiểu rõ ảnh hưởng môi trường đến hoạt tính của nấm cộng sinh địa y, các nhà khoa học không chỉ dựa vào quan sát ngoài tự nhiên mà còn áp dụng các phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Một trong những phương pháp hiệu quả nhất là nuôi cấy riêng lẻ thành phần nấm (mycobiont) trên các môi trường nhân tạo có kiểm soát. Bằng cách thay đổi các thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, pH và các điều kiện khác, các nhà khoa học có thể mô phỏng những tác động khác nhau của môi trường và đánh giá sự thay đổi trong sinh trưởng địa y cũng như khả năng sản sinh hợp chất thứ cấp. Khóa luận tốt nghiệp của Nguyễn Bảo Châu (2024) về Graphis sp. là một ví dụ điển hình, trong đó nấm được nuôi trên hai môi trường khác nhau (Mix và Sabouraud) và thu hoạch ở các thời điểm khác nhau để khảo sát hoạt tính sinh học. Các cao chiết từ sinh khối nấm sau đó được sử dụng để thử nghiệm các hoạt tính như kháng khuẩn hoặc ức chế enzyme, từ đó xác định được điều kiện tối ưu để nấm tạo ra các hợp chất mong muốn.

3.1. Kỹ thuật nuôi cấy nấm cộng sinh trong phòng thí nghiệm

Việc nuôi cấy thành công mycobiont bên ngoài cơ thể địa y là một bước tiến quan trọng. Kỹ thuật này cho phép sản xuất sinh khối nấm một cách ổn định và chủ động, không phụ thuộc vào việc thu hái ngoài tự nhiên vốn chậm chạp và không bền vững. Trong nghiên cứu về Graphis sp., nấm cộng sinh được nuôi trên hai môi trường phổ biến là Mix và Sabouraud, với các thành phần dinh dưỡng khác nhau về nguồn carbon và nitơ. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện vô trùng, nhiệt độ ổn định (18-23°C) trong thời gian dài (từ 6 đến 12 tuần). Việc theo dõi sự thay đổi về hình thái, kích thước khuẩn lạc và lượng chất tiết ra môi trường cung cấp những dữ liệu ban đầu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự phát triển của nấm. Đây là tiền đề để tạo ra các mẫu cao chiết phục vụ cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học tiếp theo.

3.2. Phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính sinh học

Sau khi thu được sinh khối nấm từ các điều kiện nuôi cấy khác nhau, bước tiếp theo là chiết tách các hợp chất và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Trong nghiên cứu của Nguyễn Bảo Châu (2024), dung môi ethyl acetate được sử dụng để tạo cao thô. Cao chiết này sau đó được sàng lọc hai hoạt tính chính: hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, một enzyme mục tiêu trong điều trị đái tháo đường tuýp 2. Việc đo lường mức độ ức chế enzyme hoặc đường kính vòng kháng khuẩn cho phép so sánh hiệu quả của các mẫu cao chiết khác nhau. Từ đó, có thể kết luận môi trường và thời gian nuôi cấy nào đã kích thích nấm sản sinh ra các hợp chất thứ cấp có hoạt tính mạnh nhất.

IV. Cách môi trường nuôi cấy tối ưu hóa hoạt tính sinh học nấm

Kết quả từ nghiên cứu thực nghiệm trên nấm cộng sinh địa y Graphis sp. đã chứng minh một cách rõ ràng rằng môi trường nuôi cấy có tác động sâu sắc và quyết định đến hoạt tính sinh học. Mặc dù cả hai môi trường Mix và Sabouraud đều hỗ trợ sự phát triển của nấm, nhưng loại và nồng độ các hợp chất thứ cấp được tạo ra lại hoàn toàn khác biệt. Điều thú vị là hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase không tăng tuyến tính theo thời gian nuôi cấy, mà đạt đỉnh ở những thời điểm nhất định và trên những môi trường cụ thể. Cụ thể, môi trường Sabouraud ở tuần thứ 6 đã cho thấy hoạt tính ức chế enzyme mạnh nhất, vượt trội hơn hẳn so với tất cả các nghiệm thức khác, kể cả so với chính nó ở các tuần sau đó. Điều này cho thấy có một "cửa sổ thời gian" tối ưu cho việc sản sinh hoạt chất. Ngược lại, hoạt tính kháng khuẩn đối với S. aureus lại không được ghi nhận ở bất kỳ mẫu nào, cho thấy các điều kiện nuôi cấy này không kích thích nấm tạo ra các chất kháng khuẩn hiệu quả với chủng vi khuẩn này. Những phát hiện này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để hướng nấm sản xuất các hợp chất mong muốn.

4.1. Phân tích hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase vượt trội

Điểm sáng nổi bật nhất trong nghiên cứu về nấm cộng sinh địa y Graphis sp. là khả năng ức chế enzyme α-glucosidase. Kết quả cho thấy cao chiết từ nấm nuôi trên môi trường Sabouraud trong 6 tuần thể hiện hoạt tính cao nhất, với tỷ lệ ức chế lên đến 74,14%. Khi tiến hành xác định nồng độ ức chế một nửa (IC50), giá trị thu được là 180,27 µg/mL. Đáng chú ý, kết quả này mạnh hơn gần 3 lần so với acarbose (IC50 = 593,33 µg/mL), một loại thuốc chuẩn đang được sử dụng trong điều trị đái tháo đường tuýp 2. Phát hiện này khẳng định tiềm năng to lớn của nấm cộng sinh địa y trong việc phát triển các liệu pháp tự nhiên, hiệu quả và có thể ít tác dụng phụ hơn so với thuốc tổng hợp.

4.2. Môi trường và thời gian Hai yếu tố quyết định hoạt tính

Nghiên cứu đã chỉ ra sự tương tác phức tạp giữa môi trường dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính sinh học. Ví dụ, ở tuần thứ 8, nấm nuôi trên môi trường Mix cho hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase (51,04%) cao hơn gấp 6,7 lần so với môi trường Sabouraud (7,55%). Tuy nhiên, ở tuần thứ 6, xu hướng lại hoàn toàn ngược lại. Sự biến động này cho thấy con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong nấm rất linh hoạt và nhạy cảm với các tín hiệu từ môi trường. Việc nấm không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn S. aureus trong nghiên cứu này cũng là một dữ liệu quan trọng, cho thấy tính đặc hiệu của các hoạt chất được tạo ra. Để khai thác hiệu quả, cần có những nghiên cứu sâu hơn để xác định chính xác thành phần hóa học và tối ưu hóa quy trình sản xuất cho từng hoạt tính cụ thể.

V. Top ứng dụng của nấm cộng sinh địa y trong y dược tương lai

Những phát hiện về hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y không chỉ mang ý nghĩa học thuật mà còn mở ra nhiều hướng ứng dụng thực tiễn đầy hứa hẹn. Tiềm năng lớn nhất nằm trong lĩnh vực y dược, đặc biệt là phát triển các loại thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên. Khả năng ức chế mạnh mẽ enzyme α-glucosidase của chiết xuất Graphis sp. cho thấy chúng có thể trở thành một nguồn nguyên liệu quý giá để bào chế các sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường tuýp 2. Ngoài ra, các tài liệu khoa học trên thế giới đã ghi nhận nhiều axit địa y có hoạt tính kháng ung thư, chống viêm, kháng virus và chống oxy hóa mạnh. Việc nuôi cấy thành công mycobiont trong phòng thí nghiệm sẽ khắc phục được nhược điểm về tốc độ sinh trưởng chậm và sản lượng thấp khi thu hái tự nhiên, từ đó cho phép sản xuất các hoạt chất này ở quy mô công nghiệp. Trong tương lai, nấm cộng sinh địa y có thể trở thành một "nhà máy sinh học" thu nhỏ, cung cấp các hợp chất nền tảng cho ngành dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.

5.1. Tiềm năng phát triển thuốc điều trị đái tháo đường tự nhiên

Bệnh đái tháo đường tuýp 2 là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Việc tìm kiếm các chất ức chế enzyme α-glucosidase từ thiên nhiên, có hiệu quả cao và ít tác dụng phụ là một hướng đi cấp thiết. Kết quả nghiên cứu trên Graphis sp. với hoạt tính ức chế mạnh hơn cả thuốc acarbose là một minh chứng thuyết phục cho tiềm năng này. Các hợp chất thứ cấp từ nấm cộng sinh địa y có thể được phát triển thành các loại thuốc mới hoặc thực phẩm chức năng giúp kiểm soát đường huyết sau ăn. Ưu điểm của các hợp chất tự nhiên là cấu trúc đa dạng và cơ chế tác động phức tạp, có thể mang lại hiệu quả hiệp đồng và giảm thiểu các tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa thường gặp ở các loại thuốc tổng hợp.

5.2. Khai thác hoạt tính kháng ung thư và chống oxy hóa

Ngoài khả năng điều trị đái tháo đường, nhiều nghiên cứu khác đã chứng minh các loài địa y thuộc chi Parmelia, Usnea và cả Graphis chứa các hợp chất có khả năng gây độc chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư. Ví dụ, nghiên cứu của Stanojkovic et al. (2014) cho thấy chiết xuất từ Parmelia sulcata có hoạt tính ức chế ung thư cao. Đồng thời, các axit địa y cũng là những chất chống oxy hóa mạnh, có khả năng trung hòa các gốc tự do, làm chậm quá trình lão hóa và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương. Việc kết hợp kỹ thuật nuôi cấy nấm và công nghệ chiết xuất hiện đại sẽ cho phép phân lập và sản xuất các hợp chất này ở quy mô lớn, phục vụ cho việc nghiên cứu và bào chế các liệu pháp phòng và trị bệnh tiên tiến.

VI. Kết luận Tương lai nghiên cứu nấm cộng sinh địa y tại Việt Nam

Nghiên cứu về ảnh hưởng môi trường đến hoạt tính của nấm cộng sinh địa y Graphis sp. đã khẳng định vai trò then chốt của các điều kiện nuôi cấy trong việc định hướng quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Phát hiện về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase vượt trội mở ra một con đường mới đầy tiềm năng trong việc khai thác nguồn tài nguyên sinh vật bản địa của Việt Nam. Kết quả này không chỉ là một đóng góp khoa học quan trọng mà còn là cơ sở để phát triển các ứng dụng thực tiễn trong ngành dược phẩm. Tuy nhiên, đây mới chỉ là bước khởi đầu. Để đi xa hơn, các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc định danh chính xác loài bằng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến hơn, đồng thời phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất chịu trách nhiệm cho hoạt tính đã quan sát được. Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy ở quy mô lớn hơn và khám phá thêm các hoạt tính sinh học khác sẽ là những nhiệm vụ trọng tâm, giúp biến tiềm năng của nấm cộng sinh địa y thành những sản phẩm có giá trị, phục vụ cho sức khỏe cộng đồng.

6.1. Tổng kết vai trò quyết định của môi trường nuôi cấy

Tóm lại, nghiên cứu đã chứng minh một cách thuyết phục rằng không thể xem nhẹ vai trò của môi trường. Các yếu tố như thành phần dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ) và thời gian nuôi cấy có thể bật hoặc tắt các con đường sinh tổng hợp cụ thể trong mycobiont. Điều này có nghĩa là bằng cách kiểm soát môi trường, chúng ta có thể "lập trình" cho nấm để sản xuất một loại hợp chất thứ cấp mong muốn với sản lượng cao nhất. Đây là một nguyên tắc cơ bản và quan trọng trong công nghệ sinh học, mở ra khả năng sản xuất các hoạt chất quý hiếm một cách bền vững mà không cần khai thác cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo Phân lập và xác định hoạt chất

Hướng đi tất yếu tiếp theo là tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về hóa học. Kiến nghị từ khóa luận của Nguyễn Bảo Châu (2024) là hoàn toàn xác đáng: cần thực hiện các kỹ thuật sắc ký để phân tách cao chiết ethyl acetate từ nấm nuôi trên môi trường Sabouraud 6 tuần. Mục tiêu là phân lập các hợp chất tinh khiết và sau đó sử dụng các phương pháp phổ như khối phổ (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định chính xác cấu trúc hóa học của chúng. Việc biết được hoạt chất nào chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học ức chế enzyme α-glucosidase sẽ là bước đột phá, cho phép tổng hợp hóa học, nghiên cứu cơ chế tác động ở cấp độ phân tử và phát triển thành một loại thuốc tiềm năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Địa y và hoạt tính sinh học của chúng. - <6 SH SHn như 4 DODD s::::::. Địa y thuộc Chi Graphis.

nhà nh si, 5 1. Hoạt tinh sinh học của dia y thuộc chi GrappÌiis. Tổng quan về hoạt tính sinh học. Tổng quan về hoạt tinh kháng khuân.

Tông quan vi khuẩn Staplycoccus đir€WS. Tổng quan về môi trường MHA. Tổng quan về hoạt tinh ức chế enzyme ơ-glucosidase. Tông quan về enzyme ứ-glucOSiđaS.

Tông quan về các chat ức chế enzyme a-glucosidase. Anh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh địa y. Tình hình nghiên cứu trong vả ngoài nước.---s-sc xxx se sec II CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết bị và hoá Chat.eeeceecsssssessseecsssssnneeeeccesssnneeseeseessnnnneeeccessanneeeeceete lầ ee 13 2.

Phương pháp tách chiết DNA.IFhơniE PHAP' PCR ii:siiii:i:cic022126162010110141003116343125)68ã30341153868438E4538985564 17 2. Phương pháp điện di, giải trình tự. Phuong phap nudi nam cộng sinh địa y Graphs Sp. Phương pháp tạo cao thô ethyl acetate.

Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuân. Phương pháp khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme o-glucosidase. Phương pháp xử lí số liệu.2- 2© 22522222223 E17 xEZSt72zEEcrrzcrrrc 20 CHƯƠNG 3.

KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả định danh nam cộng sinh địa y Graphis sp. bằng sinh học phân tử. Kết quả nuôi nắm cộng sinh địa y Graphis Sp.

Nam nuôi trên môi trường Mix. Nam nuôi trên môi trường Sabouraud. Kết quả tạo cao thé ethyl acetate từ nắm cộng sinh địa y Graphis sp. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học.- 2-2-2222 SE xc2xtrzzrrzcrrrcsyycs 26 3.

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đỗi với S. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase.----22 56022506 106206525221522161253212032222252-20222022-39922332203222- 207 330212222009233823 32 TAD EDGE UW THAM KHẢỔ ae nniiniieinaeanaerrananaaain-naaranarananadg Pr OU gi ptagitgg1t1211221103101311151103101371111311411051113311551135314311831958615835954955855533134959358383133388350 a Vv DANH MỤC CAC CHỮ VIET TAT Chữ viet tat Chữ viet day đủ ABTS | 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ơ - glucose inhibitors BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tim kiếm các vị trí tương đồng cục bộ giữa các trình tự) Colony Forming Unit CFU - : (Don vị hình thành khuan lạc} DMSO Đimethyl sulfoxide «DPPH 2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazy] Dai tháo đường Half maximal inhibition concentration (Nông độ ức chế tối da một nửa) Internal transcribed spacer (Vùng nội phiên mã ở DNA ribosome) Inhibition of xanthine oxidase (Uc ché enzyme xanthine oxidase) Minimum Inhibitory Concentration (Nông độ ức ché tôi thiểu) National Center for Biotechnology Information National Cooperative Bank Limited (Ngân hang Hợp tác Giới han Quốc gia) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Tris-Borate-EDTA TNHH Trach nhiệm hữu han vì DANH MỤC CÁC BANG Bảng 2. Các thiết bị sử dụng trong đề tài. Các hóa chất sử dụng tạo môi trường nuôi cấy.

Các hóa chất sử dụng định danh nắm bang sinh học phân tử.1 Bảng trình bày sinh khối cao chiết cthyl acetate của của nắm cộng sinh địa y Graphis sp. ở các môi trường và thời gian nuôi cay khác nhau. Tỉ lệ ức chế enzyme œ-glucosidase của cao chiết ethyl acetate từ nắm cộng SUH địa ¥ GHIDHES'SELi2iiciiiiiiiiiiiioiiiit1i4011211135164315535063358351633553336335853803398353635853536555363 28 Bảng 3. Ti lệ ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết từ sinh khối nam được nuôi ở môi trường Sabouraud trong 6 tuần.-- 2:22 ©++2E++z£EEzttEszrrsrzree 30 vũ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1, Cau trúc của hoạt chất acarbose, miglitOÌ.

Phương pháp định danh nam bang sinh học phân tử. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh hQC. Chu trình nhiệt dự kiến sử dung trong phản ứng PCR. Minh họa vị trí các đoạn moi phé thông ITS1 va ITS4 [Š50].

Hình chụp sinh khối nắm tươi. Hình chụp sinh khối nam ngâm trong dung môi ethyl acetate. Hình chụp kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS của nắm. Hình chụp kết quả giải trình tự sản phẩm PCR sử dụng môi ITSI.

Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Mix 6 tuần. Hình chụp nam nuôi trên môi trường Mix 8 tuần. Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Mix 10 tuần. Hình chụp nam nuôi trên môi trường Mix 12 tuần.

Hình chụp nam nuôi trên môi trường Sabouraud 6 tuần. Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Sabouraud § tuẳn. Hình chụp nam nuôi trên môi trường Sabouraud 10 tuần. Hình chụp nam nuôi trên môi trường Sabouraud 12 tuân.

Hình chụp kết qua khảo sat hoạt tính kháng khuân của nam cộng sinh dia ¥ Graphisisp: nuGiitren môiirtng Mi aceeeieeeeeaeaiaoeaoenenoinoanaoỏnna 27 Hình 3. Hình chụp kết qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nam cộng sinh địa y Graphis sp. nuôi trên môi trường Sabouraud.--- «+ <sx+<xeeeeeeeseeeexee 27 Hình 3. Hình chụp đối chứng âm (DMSO).

D6 thị thé hiện sự tương quan giữa tỉ lệ ức chế enzyme a-glucosidase với logarit nồng độ cao từ sinh khôi nam Graphis sp. nuôi trên môi trường Sabouraud 6 Phụ lục 1. Hình chụp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase ở 8 loại cao EHiEIIGHIN]IRGBRREĐL.--sx:c260225156:15224622259251530312531918E1301E380739428134811123158214233603522858112338182134) a vill Phu luc 2. Xử lý số liệu trên phan mềm GrapPad Prism §.

Hình chụp khao sát hoạt tinh ức chế ICso enzyme a-glucosidase của cao chiết ethyl acetate thu từ sinh khối nam Graphis sp. nuôi trên môi trường Sabouraud MỞ ĐÀU I. Lí đo chọn đề tài Hiện nay, các căn bệnh do nhiễm khuan, nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong cho hàng triệu người trên thẻ giới [1]. Các bệnh do nhiễm khuẩn thông thường được điều trị bằng kháng sinh.

Tuy nhiên, điều nảy vô tình gây ra hiện tượng kháng kháng sinh. Đề kháng với kháng sinh ở vi khuẩn ngày càng trở nên phô biến khiến cho tỉ lệ điều trị thành công các bệnh nhiễm khuẩn giám đi đáng kẻ và trở thành mối nguy hại cho sức khỏe va tính mạng con người [2]. Dai tháo đường (DTD) là bệnh rồi loạn chuyển hóa do các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất insulin không đủ cho cơ thé, hoặc co thể có đủ insulin nhưng tế bào không thé sử dụng. Căn bệnh này ngày càng gia tăng không chỉ ở các nước phát triển mà cỏn ở các nước đang phát triền, trong đó có Việt Nam [3].

Ở những bệnh nhân mắc bệnh DTD tuýp 2, sau bữa ăn đường huyết thường có xu hướng tăng vọt, khó kiểm soát do hoạt động của enzyme a-glucosidase. Acarbose thường được dùng trong điều trị bệnh thông qua đường uống, với cơ chế ức chế enzyme ơ-glueosidase. Tuy nhiên, điều trị bệnh bằng acarbose ít nhiều gây ra những tác dụng phụ không mong muốn [3]. Vì vậy, các nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu những hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với mong muốn tôi ưu trong điều trị bệnh DTD tuýp 2.

Địa y - một dang sông cộng sinh giữa tảo hoặc vi khuẩn lam và nam cộng sinh. Các hợp chất được tạo ra bởi địa y gồm các chất chuyên hóa sơ cấp (protein, amino acid, polyol, carotenoid, polysaccharide, vitamin) va thứ cấp (depside, depsidone, dibenzofuran, steroid, terpene,.) được nhận định có nguồn tốc từ nắm cộng sinh địa y. Trong tự nhiên, nam cộng sinh địa y phat trién khá chậm và lượng sinh khối thu nhận được không ôn định do tác động của ô nhiễm môi trường [4]. Người ta nghiên cứu phát hiện nắm cộng sinh địa y có thé sinh trưởng độc lập trên các môi trường nhân tạo.

Đến thời điểm hiện tại. nhiều công trình nghiên cứu công bồ các chất chuyên hóa thứ cấp từ nam cộng sinh địa y có hoạt tính sinh học như ức chế enzyme a- glucosidase, khang khuan, khang nam. Chỉ Graphis với hơn 400 loài - chiếm số lượng lớn nhất họ địa y Graphidaceae [8] [9]. Nhận thay chi nam nảy chưa có nhiều nghiên cứu thực hiện khảo sát hoạt tinh kháng khuân đối với Staphylococcus aureus và hoạt tính ức chế enzyme a- glucosidase.

Tính đến tháng 4 năm 2024 vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cay đến hoạt tinh kháng khuan và ức chế enzyme ơ-glucosidae của nắm cộng sinh địa y Graphis sp. Vi những lý do trên dé tải “Khao sát ảnh hướng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của nam cộng sinh địa y Graphis sp.” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Khao sát ảnh hường của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính kháng khuan đối với Staphylococcus aureus và hoạt tinh ức chế enzyme o-glucosidase của nam cộng sinh địa y Graphis sp. Đối tượng nghiên cứu Nắm cộng sinh địa y Graphis sp.

được phân lập va lưu trữ ở phòng thí nghiệm Sinh hoá — Vi sinh với mã số UE-MY08. Loài nam này được phân lập từ mẫu địa y thu ở tỉnh Tra Vinh vào tháng 3 năm 2023. Mẫu địa y được định danh bởi Tiến sĩ Võ Thị Phi Giao, Khoa Sinh học — Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh và được lưu giữ tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thanh pho Hỗ Chi Minh với mã số UE-L014.

Nhiệm vụ nghiên cứu - Định danh nắm cộng sinh địa y Graphis sp. bằng sinh học phân tử. - Nuôi nam Graphis sp. với số lượng lớn trên môi trường Mix và Sabouraud.

- Thu sinh khối nắm vào các thời điểm 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần và 12 tuần. - Tạo cao thô ethyl acetate từ sinh khối nắm thu được. - Khảo sát hoạt tính sinh học: + Hoạt tính kháng khuan. + Hoạt tinh ức chế enzyme œ-glucosidase.

Pham vi nghiên cứu Đề tai khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cay đến hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính ức chế enzyme ơ-glucosidase của loài nam cộng sinh địa y Graphis sp. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: 6 tháng (10/2023 — 03/2024). - Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa — Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thanh phố Hỗ Chí Minh. Dia y va hoạt tính sinh học của chúng 1.

Địa y Địa y được hình thành từ mối quan hệ cộng sinh giữa 2 thành phần gồm nam (mycobiont) và một số các sinh vật có khả năng quang hợp (photobiont) [10]. Thành phần thứ nhất là nam, một số nhà khoa học cho rằng khoảng 17-30% trong tong số nắm có khả năng cộng sinh với tảo phát triển thành địa y. Nam được ước tính khoảng trên 1. Từ đó nhận thấy, tảo cộng sinh với nắm có thé cho ra tối thiểu 250.

Thanh phan thứ hai là các sinh vật có khả năng quang hop, hiện nay phân loại được khoảng 100 loài trên tong số địa y đã biết [12]. Tảo lục dinh dưỡng bằng cách quang hợp tạo ra carbohydrate và chất hữu cơ. Hình thức dinh dưỡng ở nam là dị dưỡng, nắm sử dụng chất hữu cơ do tảo quang hợp tạo ra. Mặt khác, nắm tông hợp các hợp chất tự nhiên và bảo vệ tảo khỏi các tác nhân gây hại như tia UV, sâu bọ, động vật ăn thực vật,.

Dạng khảm (crustose) bám chặt vào bề mặt của giá thẻ. Giá thể có thé là đá hoặc vách đá, thân cây khác. Dạng phiến (foliose) phát triển nhiều cành. nhánh giống với cau trúc của lá cây.