Khóa luận tốt nghiệp sư phạm sinh học khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase của nấm cộng sinh địa y nigrovothelium inspersotropicum

Khóa luận: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của nấm cộng sinh địa y Nigrovothelium inspersotropicum. Tìm hiểu tiềm năng ứng dụng.

• Tác giả: Lê Nguyễn Cao Dương
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Minh Định
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học
• Đề tài: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase của nấm cộng sinh địa y Nigrovothelium inspersotropicum
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. Lí do chọn đề tài
• 2. Mục tiêu nghiên cứu
• 3. Đối tượng nghiên cứu
• 4. Nhiệm vụ nghiên cứu
• 5. Phạm vi nghiên cứu
• 6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
• 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường
• 1.2. Tổng quan về enzyme α – glucosidase
• 1.3. Tổng quan về địa y và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị và hóa chất
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp tạo môi trường và nuôi nấm
• 2.3.2. Phương pháp tạo cao ethyl acetate
• 2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α – glucosidase
• 2.3.4. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nuôi nấm và tạo cao ethyl acetate
• 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 3.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 3.4. Giá trị IC50 của cao chiết nấm sáng 8 tuần và D-glucose 8 tuần
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan ức chế α glucosidase từ nấm dược liệu

Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) type 2 đang trở thành một thách thức sức khỏe toàn cầu. Nguyên tắc điều trị cốt lõi là duy trì đường huyết ở mức ổn định, đặc biệt là sau bữa ăn. Một trong những enzyme then chốt trong quá trình này là enzyme α-glucosidase. Enzyme này có vai trò thủy phân carbohydrate phức tạp thành glucose, làm tăng nồng độ đường trong máu. Do đó, việc tìm kiếm các chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase là một chiến lược hiệu quả để kiểm soát đường huyết sau ăn. Hiện nay, các loại thuốc tổng hợp như Acarbose được sử dụng rộng rãi nhưng thường đi kèm tác dụng phụ không mong muốn trên hệ tiêu hóa. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm giải pháp thay thế từ thiên nhiên, an toàn và hiệu quả hơn. Trong số đó, nấm dược liệu và nấm nội sinh nổi lên như một nguồn tài nguyên quý giá, chứa đựng vô số hoạt chất sinh học có tiềm năng. Các nghiên cứu đã chỉ ra nhiều loài nấm, đặc biệt là nấm cộng sinh từ địa y, có khả năng sản sinh ra các hợp chất thứ cấp với hoạt tính kháng tiểu đường mạnh mẽ. Việc khai thác nguồn dược liệu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong điều trị tiểu đường type 2 mà còn giảm sự phụ thuộc vào thuốc hóa dược, hướng tới một giải pháp bền vững và thân thiện hơn với cơ thể người bệnh. Tiềm năng này phụ thuộc rất lớn vào việc khám phá và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để tối đa hóa hiệu suất sản sinh hoạt chất.

1.1. Vai trò của enzyme α glucosidase trong cơ thể

Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20) là một enzyme ngoại bào, xúc tác cho bước cuối cùng của quá trình tiêu hóa carbohydrate. Cụ thể, nó thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside của oligosaccharide và disaccharide thành các phân tử glucose đơn giản. Quá trình này diễn ra chủ yếu tại vi nhung mao ruột non. Glucose sau khi được giải phóng sẽ nhanh chóng được hấp thu vào máu, gây ra hiện tượng tăng đường huyết đột ngột sau bữa ăn [11]. Ở người bệnh ĐTĐ type 2, cơ chế điều hòa insulin bị suy giảm, khiến cơ thể không thể xử lý hiệu quả lượng glucose này. Do đó, ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase sẽ làm chậm quá trình phân giải carbohydrate, từ đó giảm tốc độ hấp thu glucose, giúp hạ đường huyết sau ăn và duy trì mức đường huyết ổn định hơn.

1.2. Nấm dược liệu Nguồn thay thế thuốc trị tiểu đường

Việc sử dụng các thuốc trị tiểu đường tổng hợp như Acarbose, voglibose, và miglitol có hiệu quả cao nhưng tiềm ẩn rủi ro về tác dụng phụ như viêm gan, suy thận [13, 14]. Do đó, xu hướng tìm kiếm các chất ức chế có nguồn gốc tự nhiên đang rất được quan tâm. Nấm dược liệu, bao gồm cả đông trùng hạ thảo và nấm linh chi, cùng các loài nấm cộng sinh địa y, là một nguồn dược liệu khổng lồ. Chúng có khả năng tổng hợp một loạt các hợp chất thứ cấp đa dạng như methylorsellinate, zeorin, và usnic acid, vốn đã được chứng minh có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh mẽ, thậm chí vượt trội hơn cả Acarbose trong một số nghiên cứu [61, 63]. Khả năng này mở ra một kỷ nguyên mới cho việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị ĐTĐ an toàn và hiệu quả hơn.

II. Thách thức trong tối ưu hóa hoạt chất sinh học từ nấm

Mặc dù tiềm năng của nấm trong việc sản xuất các chất ức chế α-glucosidase là rất lớn, quá trình khai thác và sản xuất ở quy mô lớn đối mặt với nhiều thách thức. Vấn đề chính nằm ở đặc tính sinh học của các loài nấm, đặc biệt là nấm cộng sinh địa y (mycobiont). Chúng thường có tốc độ sinh trưởng rất chậm trong điều kiện phòng thí nghiệm [44]. Để thu được một lượng sinh khối nấm đủ lớn cho việc chiết xuất và sàng lọc hoạt tính sinh học đòi hỏi thời gian dài và quy trình phức tạp. Thêm vào đó, việc sản sinh các hợp chất thứ cấp có hoạt tính không phải là một quá trình ổn định. Nó phụ thuộc chặt chẽ vào các yếu tố của môi trường nuôi cấy. Sự thay đổi nhỏ về thành phần dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, hay ánh sáng đều có thể ảnh hưởng đến con đường sinh tổng hợp, dẫn đến sản lượng và hoạt tính của các chất mong muốn bị thay đổi đáng kể [20]. Do đó, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy trở thành nhiệm vụ tiên quyết. Nếu không có một quy trình chuẩn hóa và tối ưu, việc khai thác tiềm năng của nấm dược liệu sẽ bị hạn chế, không thể đáp ứng nhu cầu sản xuất công nghiệp và ứng dụng lâm sàng.

2.1. Tốc độ sinh trưởng chậm của nấm cộng sinh địa y

Nấm cộng sinh địa y, trong môi trường tự nhiên, phát triển trong một mối quan hệ cộng sinh phức tạp và có tốc độ tăng trưởng cực kỳ chậm [40]. Khi được phân lập và đưa vào môi trường nuôi cấy bề mặt hoặc nuôi cấy chìm nhân tạo, chúng thường mất đi sự hỗ trợ từ tảo cộng sinh và phải thích nghi với điều kiện mới. Quá trình này làm cho việc thu được sinh khối nấm trở nên khó khăn và tốn thời gian. Một chu kỳ nuôi cấy có thể kéo dài từ vài tuần đến vài tháng chỉ để thu được một lượng sinh khối khiêm tốn. Đây là rào cản lớn nhất đối với việc nghiên cứu và sản xuất trên quy mô lớn.

2.2. Sự phụ thuộc của hợp chất thứ cấp vào môi trường

Các hợp chất thứ cấp không phải là sản phẩm thiết yếu cho sự sống cơ bản của nấm, mà thường được tạo ra như một cơ chế phản ứng với môi trường. Do đó, thành phần và sản lượng của chúng rất nhạy cảm với các điều kiện bên ngoài. Các yếu tố như nguồn carbon, nguồn nitơ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng đều đóng vai trò như những "công tắc" điều khiển quá trình sinh tổng hợp này [53]. Một điều kiện nuôi cấy tối ưu cho việc tăng sinh khối chưa chắc đã là tối ưu cho việc sản sinh hoạt chất. Điều này đòi hỏi các nghiên cứu phải khảo sát tỉ mỉ từng yếu tố để tìm ra sự cân bằng hoàn hảo, một thách thức lớn trong công nghệ sinh học.

III. Bí quyết chọn nguồn carbon để tăng hoạt tính ức chế

Trong các yếu tố môi trường, nguồn carbon được xem là thành phần dinh dưỡng quan trọng bậc nhất, không chỉ cung cấp năng lượng cho sự phát triển mà còn là tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu trên nấm Nigrovothelium inspersotropicum đã cung cấp những bằng chứng rõ ràng về tầm quan trọng của việc lựa chọn nguồn carbon. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách thay thế đường sucrose trong môi trường MYA cơ bản bằng các loại đường khác nhau như D-glucose, sorbitol và mannitol. Kết quả thu được từ các chiết xuất nấm sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau (6, 8, 10, 12 tuần) đã cho thấy sự khác biệt đáng kể về hoạt tính ức chế α-glucosidase. Đáng chú ý nhất, tất cả các mẫu cao chiết từ môi trường chứa D-glucose đều thể hiện hoạt tính ức chế rất mạnh, đạt trên 90%. Trong khi đó, môi trường sử dụng mannitol lại cho hoạt tính yếu hơn hẳn. Điều này cho thấy nấm N. inspersotropicum có khả năng chuyển hóa D-glucose một cách hiệu quả để tạo ra các hoạt chất sinh học mong muốn. Phát hiện này là một bí quyết then chốt, giúp định hướng việc thiết kế môi trường nuôi cấy để tối đa hóa hiệu suất sản xuất chất ức chế α-glucosidase từ loài nấm này.

3.1. Đánh giá hoạt tính từ D glucose sorbitol mannitol

Kết quả thực nghiệm cho thấy sự khác biệt rõ rệt. Cao chiết từ môi trường D-glucose thể hiện hoạt tính mạnh và ổn định qua các mốc thời gian, với tỷ lệ ức chế lần lượt là 95,3% (6 tuần), 97,6% (8 tuần), 97,9% (10 tuần) và 96,3% (12 tuần). Môi trường sorbitol cũng cho kết quả tốt ở tuần thứ 8 và 10 (đều trên 99%), nhưng hoạt tính giảm ở các thời điểm khác. Ngược lại, môi trường mannitol cho thấy hoạt tính yếu nhất, đặc biệt ở tuần 12 chỉ còn dưới 50%. Sự chênh lệch này chứng tỏ cấu trúc và loại đường carbon ảnh hưởng trực tiếp đến con đường trao đổi chất và sinh tổng hợp của nấm.

3.2. D glucose Nguồn carbon tối ưu cho hoạt tính cao nhất

D-glucose, một loại đường đơn, dường như là nguồn carbon dễ hấp thu và chuyển hóa nhất đối với nấm N. inspersotropicum để tạo ra các chất ức chế α-glucosidase. Việc duy trì hoạt tính cao ổn định trong suốt 12 tuần nuôi cấy cho thấy D-glucose không chỉ thúc đẩy sản xuất hoạt chất sinh học mà còn giúp duy trì quá trình này một cách bền vững. Đây là một kết luận quan trọng, cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc lựa chọn D-glucose làm thành phần chính trong quy trình tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm này ở quy mô lớn hơn.

IV. Cách ánh sáng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng tiểu đường

Bên cạnh yếu tố dinh dưỡng, các yếu tố vật lý như ánh sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh trưởng và sản xuất chất chuyển hóa ở nấm. Ánh sáng không chỉ là nguồn năng lượng cho các sinh vật quang hợp mà còn hoạt động như một tín hiệu môi trường, kích hoạt hoặc ức chế các gen liên quan đến quá trình trao đổi chất. Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã so sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase của chiết xuất nấm N. inspersotropicum được nuôi trong hai điều kiện: chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày và trong bóng tối hoàn toàn. Kết quả đã khẳng định mạnh mẽ ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng tạo ra hoạt chất sinh học của nấm. Cụ thể, các mẫu nấm được nuôi trong điều kiện có ánh sáng cho thấy hoạt tính ức chế cao và ổn định hơn đáng kể. Chẳng hạn, ở các tuần 6, 8 và 12, tỷ lệ ức chế đều đạt trên 90%. Ngược lại, nấm nuôi trong tối mặc dù vẫn có hoạt tính nhưng lại không ổn định, với mức ức chế giảm mạnh xuống còn khoảng 52% ở tuần thứ 8. Điều này cho thấy ánh sáng có thể đã kích thích các con đường sinh tổng hợp cụ thể, dẫn đến việc tạo ra nhiều hơn các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng tiểu đường.

4.1. Tác động của chu kỳ sáng tối đến quá trình trao đổi chất

Ánh sáng được biết đến là một yếu tố điều tiết quan trọng trong sinh học nấm. Nó có thể ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan sinh sản, sản xuất sắc tố và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp [54]. Đối với N. inspersotropicum, chu kỳ sáng/tối có thể đã tác động đến biểu hiện của các enzyme chủ chốt trong con đường tổng hợp các hợp chất có khả năng ức chế α-glucosidase. Điều kiện chiếu sáng có thể đã tạo ra một môi trường "stress" nhẹ, kích thích nấm sản sinh các hợp chất bảo vệ, mà những chất này lại tình cờ có hoạt tính sinh học mong muốn.

4.2. Kết quả nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 12h ngày

Thực nghiệm cho thấy nấm nuôi cấy với chu kỳ chiếu sáng 12h/ngày thể hiện hoạt tính ức chế rất mạnh. Cụ thể, cao chiết ở tuần thứ 8 (Sáng 8 tuần) đã được lựa chọn để phân tích sâu hơn về chỉ số IC50. Sự ổn định và hiệu quả cao của phương pháp nuôi cấy có ánh sáng cho thấy đây là một điều kiện quan trọng cần được duy trì trong quy trình sản xuất, giúp đảm bảo chất lượng và hoạt tính của sản phẩm cuối cùng. Đây là một minh chứng rõ ràng rằng việc kiểm soát các yếu tố vật lý là không thể thiếu trong nỗ lực tối ưu hóa quy trình nuôi cấy.

V. So sánh hiệu quả ức chế α glucosidase Nấm vs

Để đánh giá một cách định lượng và khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn, việc so sánh hiệu quả của chiết xuất nấm với một loại thuốc chuẩn là bước đi cần thiết. Trong nghiên cứu này, hai mẫu cao chiết có hoạt tính cao nhất là "Sáng 8 tuần" (nuôi trong điều kiện sáng) và "D-glucose 8 tuần" (nuôi với nguồn carbon là D-glucose) đã được lựa chọn để xác định giá trị IC50. IC50 là nồng độ của một chất cần thiết để ức chế 50% hoạt động của enzyme, và giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính ức chế càng mạnh. Kết quả phân tích đã mang lại một kết quả vô cùng ấn tượng. Cao chiết "Sáng 8 tuần" có giá trị IC50 là 89,92 µg/mL và cao chiết "D-glucose 8 tuần" thậm chí còn mạnh hơn với IC50 chỉ 53,05 µg/mL. Khi so sánh với chất đối chứng dương là Acarbose, một loại thuốc trị tiểu đường phổ biến, có giá trị IC50 lên tới 593,33 µg/mL, có thể thấy hiệu quả của hai loại cao chiết nấm này vượt trội hơn hẳn, mạnh hơn từ 6,6 đến 11,2 lần. Đây là một phát hiện đột phá, không chỉ chứng minh hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh mẽ của nấm N. inspersotropicum mà còn khẳng định tiềm năng to lớn của nó trong việc phát triển các liệu pháp mới, hiệu quả hơn cho điều trị tiểu đường type 2.

5.1. Phân tích chỉ số IC50 của các cao chiết nấm tối ưu

Việc xác định IC50 được thực hiện bằng cách pha loãng cao chiết ở nhiều nồng độ khác nhau và đo lường tỷ lệ ức chế tương ứng. Dữ liệu sau đó được phân tích bằng phương pháp hồi quy phi tuyến tính để xác định chính xác giá trị IC50. Kết quả cho thấy cao chiết từ môi trường D-glucose 8 tuần (IC50 = 53,05 ± 4,88 µg/mL) có hoạt tính mạnh nhất. Cao chiết từ môi trường có chiếu sáng 8 tuần (IC50 = 89,92 ± 5,55 µg/mL) cũng cho thấy hoạt tính rất cao. Những con số này cung cấp bằng chứng định lượng mạnh mẽ về hiệu quả của việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

5.2. Hiệu quả vượt trội so với chất đối chứng Acarbose

So sánh trực tiếp cho thấy giá trị IC50 của cả hai mẫu cao chiết đều thấp hơn đáng kể so với Acarbose (IC50 = 593,33 ± 13,06 µg/mL). Điều này có nghĩa là cần một nồng độ chiết xuất nấm thấp hơn rất nhiều để đạt được cùng một mức độ ức chế enzyme. Sự vượt trội này không chỉ hứa hẹn về mặt hiệu quả điều trị mà còn có thể giúp giảm liều lượng cần dùng, từ đó hạn chế các tác dụng phụ tiềm tàng. Đây là cơ sở vững chắc để tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn về phân lập hoạt chất và thử nghiệm lâm sàng.

VI. Hướng đi mới trong điều trị tiểu đường type 2 từ nấm

Kết quả từ nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế α-glucosidase của nấm Nigrovothelium inspersotropicum đã mở ra một hướng đi đầy hứa hẹn. Việc xác định được các điều kiện tối ưu như sử dụng nguồn carbon là D-glucose và áp dụng chu kỳ chiếu sáng đã tối đa hóa việc sản sinh các hoạt chất sinh học có giá trị. Hiệu quả ức chế vượt trội so với Acarbose cho thấy tiềm năng to lớn của các hợp chất thứ cấp từ loài nấm này. Tương lai của hướng nghiên cứu này sẽ tập trung vào hai nhiệm vụ chính. Thứ nhất là đi sâu vào việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính quan sát được. Việc này sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác động ở cấp độ phân tử và cho phép tổng hợp hoặc bán tổng hợp chúng. Thứ hai là phát triển các ứng dụng thực tiễn từ chiết xuất nấm. Các chiết xuất thô, sau khi được tiêu chuẩn hóa, hoàn toàn có thể được phát triển thành các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc trà dược liệu hỗ trợ kiểm soát đường huyết. Đây là một con đường tiềm năng để đưa thành tựu khoa học đến gần hơn với cộng đồng, cung cấp một giải pháp tự nhiên, an toàn và hiệu quả cho bệnh nhân đái tháo đường type 2.

6.1. Tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

Với hoạt tính mạnh mẽ và nguồn gốc tự nhiên, các chiết xuất nấm N. inspersotropicum là ứng cử viên sáng giá cho ngành công nghiệp thực phẩm chức năng. Các sản phẩm dưới dạng viên nang, trà túi lọc hoặc bột hòa tan có thể được phát triển để hỗ trợ người bệnh ĐTĐ type 2 trong việc hạ đường huyết sau ăn. Ưu điểm của hướng đi này là quy trình sản xuất đơn giản hơn so với việc phát triển một loại thuốc mới, giúp sản phẩm nhanh chóng tiếp cận thị trường và người tiêu dùng.

6.2. Yêu cầu phân lập và xác định cấu trúc hoạt chất

Để tiến xa hơn trên con đường phát triển dược phẩm, nhiệm vụ cấp thiết tiếp theo là tiến hành phân lập các hợp chất có hoạt tính từ cao chiết ethyl acetate. Bằng các kỹ thuật sắc ký hiện đại, các nhà khoa học có thể tách riêng từng hợp chất và kiểm tra hoạt tính của chúng. Sau khi tìm ra hoạt chất chính, việc xác định cấu trúc phân tử của nó sẽ là chìa khóa để hiểu rõ cơ chế tác động và mở đường cho các nghiên cứu tổng hợp hóa học trong tương lai, hướng tới việc tạo ra một thế hệ thuốc trị tiểu đường mới từ nấm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường .-- 2: 2©z££SSz£cSEe2EEZ22xzcEEzecrvcrre = 1. Tong quan về enzyme 0 — #Ïu€OSiđi§€. Tông quan về dia y và ảnh hướng của điều kiện nuôi cay đến hoạt tính sinh học Dị COng hai iẢ3ÖÕẢ.

Tông quan về nam N. Tình hình nghiên cứu trong và ngoải nước .-- --- se ssieseieeieieerree 10 Chương 2. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.-- 12 2:Ï, Wat Tie MTGE CON án inoeieiiiiiiiiiieiiinbitioitieidii151110611045816310853383008361853 12 2. Thiết bị và hóa Chat.

2c si coi nrioUiereorrraiitrEorticeroigrnercrritec 12 2:3; PUGH PNAO Me ICH CUE cscscsecssssussascsssazaassasascassoaseverseatseesansassesusnesseatasaaseatseeaises 13 2. Phuong pháp tạo môi trường và nuôi MAM. Phuong pháp tao cao ethyl aCetafe. Phương pháp xác định hoạt tinh ức chế enzyme a — glucosidase.

Phương pháp xử lí số liệu.-- 2-22 22222E22EEE2EE2EE222E2222E22117 1722 2xcrree l6 218. OGRA EIS ODN 2. ssi26146226111101630163)50535053)13511550355353513853193503559565358533593153303142353153 ló Chương 3. KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN.

Kết quả nuôi nắm và tạo cao ethyl aCetaf€. Anh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase. Ảnh hưởng của điều kiện chiều sáng đến hoạt tính ức chế enzyme a- IEIUCDSIUNB qiatisiiiigigi211151013611510133118411843136159555185318515833184165231881855858555588593613943536118865823883 25 3. Giá trị ICso của cao chiết nam sáng 8 tuần và D-glucose 8 tuần.

26 REET UA VARIN INGI sscisssasscsescssssssvevvsssssoususssesasosaussevnssvoseasssanvsstonasistsnsoseos 32 IIKSPHIN,. co cốc cốc.221022022542122:21212222200120112605232212222712200110212101221721212311221132011200321102i56222122 38 PHÚ LỰC 2::::-s:::‹::-:::-:-:cc-:::-ccccicctpccpiin0DS102A5171061261305380351258384615483886586535638886886555856 39 PFHU|UU ibisicciiiioiiiiiiiiiiiiiiiiisiiiaiit210120113101201052119234331394513655346383583043654918241036858558350 40 iv DANH MUC CAC CHU VIET TAT DTD Dai tháo đường GH Glycoside hydrolase MYA/MY 10 Malt yeast agar pNPG p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside AGIs a-glucosidase inhibitors ICBN International Code of Botanical Nomenclature HIV Human Immunodeficiency Virus AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrom DMSO Dimethyl sulfoxide Cao chiết nam được nuôi 6 tuần trên môi trường Sor 6 tuan MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường Sor 8 tuan MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol Cao chiết nam được nuôi 10 tuần trên môi trường Sor 10 tuan MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol Cao chiết nắm được nuôi 12 tuần trên môi trường Sor 12 tuan MYA thay đường sucrose băng đường sorbitol Man 6 tuan Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường Man 8 tuần MYA thay đường sucrose băng đường mannitol Cao chiết nam được nuôi 10 tuần trên môi trường Man 10 tuân MYA thay đường sucrose băng đường mannitol V Man 12 tuần Cao chiết nam được nuôi 6 tuần trên môi trường D-glu 6 tuan MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường D-glu 8 tuan MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose Cao chiết nam được nuôi 10 tuần trên môi trường D-glu 10 tuan MYA thay đường sucrose bằng đường D-glucose Cao chiết nắm được nuôi 12 tuần trên môi trường D-glu 12 tuần MYA thay đường sucrose băng đường D-glucose Cao chiết nắm được nuôi 6 tuần trên môi trường Sáng 6 tuần MYA với thời gian chiếu sáng 12 tiếng/ngày Cao chiết nắm được nuôi 8 tuần trên môi trường Sáng § tuần MYA với thời gian chiều sáng 12 tiéng/ngay Cao chiết nắm được nuôi 10 tuần trên môi trường Sáng 10 tuần MYA với thời gian chiếu sáng 12 tiếng/ngày Cao chiết nam được nuôi 12 tuần trên môi trưởng Sáng 12 tuần MYA với thời gian chiều sáng 12 tiếng/ngày Cao chiết nắm được nuôi 6 tuần trên môi trường Tối 6 tuần MYA hoàn toàn trong bóng toi Cao chiết nắm được nuôi § tuần trên môi trường Tối 8 tuần MYA hoàn toản trong bóng tôi Cao chiết nắm được nuôi 10 tuần trên môi trường Tối 10 tuần MYA hoàn toàn trong bóng tôi Tôi 12 tuần vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hinh 1. Địa y Nigrovothelium inspersotropicum [Š7T]. Quy trình thực hiện fh.

Khuan lạc nắm được nuôi ở các môi trường trong 6 tuân. Khuân lạc nắm được nuôi ở các môi trường trong 8 tuần. Khuan lạc nam được nuôi ở các môi trường trong 10 tuần. Khuan lạc nắm được nuôi ở các môi trường trong 12 tuần.

Đồ thị tương quan giữa log10 nông độ cao sáng 8 tuần với tỉ lệ phan trăm dic: Chế enzyme G-gÏlE0811Ì356. Dé thị tương quan giữa log10 nông độ cao D-glucose 8 tuần với tỉ lệ phan trăm ức chế enzyme œ-glueosidase.-22-22©2z+2Ez22ZztE2EE222Zxecrxecrreee 29 Hình 3. Đồ thị tương quan giữa log10 nông độ acarbose với tỉ lệ phan tram ức chế ENZYME G:BÏIEOSIẢRSỂ ::ccosoiioiiiooioniiizsi20416135115155861525312581831958886585833885858555659585188358838855.31 vũ DANH MỤC CAC BANG Bảng 2. Các thiết bị sử đụng trong đề tài.

Các hóa chất được sử dung dé tạo môi trường nuôi nắm. Các hóa chất được sử dụng tao cao chiết và thir hoạt tinh ức chế enzyme GEPIUGDSIGHSG1. Thể tích cao nam pha loãng ở nồng độ 200 ug/mL. Khối lượng sinh khối khô và cao chiết nam thu được.

Khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết nắm N, inspersotropicum nuôi cây trên môi trường MYA khác nhau về nguồn carbon. Tỉ lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết nắm N. inspersotropicum nuôi cây trên môi trường MYA khác nhau về thời gian chiều sáng S3038538558123iS583156g38339953136388523758516838E8815833858181883856918513883853038ã81568183855615gg02975618883058575815988 25 Bảng 3. Ti lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết từ sinh khối nắm được nuôi ở điều kiện có ánh sáng trong 8 tuần.-- 222 222 2zz2xzz2xsecxzec.5, Tỉ lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của cao chiết D-glucose 8 tuần.

Ti lệ (%) ức chế enzyme a-glucosidase của acarbose. Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme a- glucosidase với nồng độ cao chiết nam 8 tuân và thởi gian chiếu sáng 12 h/ngay. Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme ơ- glucosidase với nông độ cao chiết nam 8 tuần trên môi trường chứ đường D-glucose Bang 3. Kết qua phân tích tương quan phi tuyến tính giữa tỷ lệ ức chế enzyme ơ- glucosidase với nông độ acarÐose.

Lí do chọn đề tài Bệnh đái tháo đường (DTD) là một căn bệnh man tinh, xảy ra khi tụy không san xuất đủ insulin hay cơ thé sử đụng không hiệu quả insulin do tụy sản xuất làm cho nông độ glucose trong máu tăng cao [1]. DTD được phân thành ba loại phô biến la DTD tuýp 1, DTD tuýp 2 và DTD thai kì [2]. Trong đó, DTD tuýp 2 được xem như một cuộc khủng hoáng đối với sức khỏe toàn cầu do có tỉ lệ người mắc cao nhất và ngày cảng có nhiều thanh thiếu niên mắc phải [3]. Các biến chứng gặp phải khi mắc bệnh DTD bao gồm bệnh tim mạch, bệnh thận, rồi loạn chức năng va suy yếu các cơ quan khác nhau, đặc biệt là mắt, thần kinh, tim và mạch máu [4], [5].

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), DTD tuýp 2 có tỉ lệ người mắc cao nhất chiếm 90% đến 95% tông số người mắc bệnh DTP trên toàn thé giới. Độ tuôi mắc PTD tuýp 2 phô biến nhất là những người trên 45 tuôi, nhưng hiện nay, ngày càng có nhiều trẻ em và thanh thiểu niên mắc bệnh nay [6], nguyên nhân gây bệnh có thé 1a do yêu tô di truyền, béo phì, chế độ an uống không hợp lí hoặc it vận động thé chất [7]. Các nguyên nhân đặc trưng như béo phì, giảm sự hoạt động của insulin hay những bat thường ở tế bao j tuyến tụy trong tiết insulin lam gia tăng lượng glucose trong máu gây DTD tuýp 2 [8]. Vì vậy, nguyên tắc điều trị chung cho các bệnh nhân mắc PTD tuýp 2 bên cạnh chế độ ăn uống hợp lí kết hợp với tập luyện thé dục thé thao thường xuyên [9] là duy trì lượng đường trong máu lúc trước và sau khi ăn gần như ở mức sinh lý bình thường [10].

Enzyme a-glucosidase là một enzyme quan trọng tham gia vào bước cuỗi cùng trong quá trình tiêu hóa carbohydrate. ơ-Glucosidase thủy phân polysaccharides và oligosaccharides thành glucose; do đó. dé kiểm soát lượng đường huyết sau khi ăn cần phải ức chế enzyme a-glucosidase nhằm làm chậm quá trình thủy phan carbohydrate giải phóng glucose, giảm hấp thu glucose trong máu [11]. Hiện nay, một số loại thuốc được sử dụng rộng rãi trong điều trị DTD tuýp 2 có tác dụng ức chế enzyme ơ-glucosidase như acarbose, voglibose, miglitol [12], [13].

Việc sử dụng các loại thuốc này tuy có hiệu quả cao trong điều tri DTD nhưng vẫn luôn tiềm ân một số tác dụng phụ có thê xảy ra như viêm gan, suy thận hay các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa [13], [14]. Do đó, việc tìm kiểm các hợp chat ức chế enzyme a-glucosidase, các loại thuốc thay thế có nguồn gốc từ thảo được, địa y nhằm thay thế các loại thuốc điều tri DTD thông thường đang rat được quan tâm và nghiên cứu [15]. Địa y được tạo thành từ mỗi quan hệ cộng sinh giữa nắm (mycobiont) - thường là nam túi hoặc nam đảm - với một hoặc nhiều loại tảo (photobiont) - thường là tảo lam hoặc tảo lục đơn bào, dé tạo thành cơ thé thống nhất với các đặc tinh sinh lý và sinh thái riêng [16]. Các hợp chất chuyên hóa thứ cấp của địa y chủ yếu được tạo ra từ nắm cộng sinh (mycobiont) của chúng [17], [18].

Trên thế giới có hơn 13,500 loại nắm cộng sinh địa y [16] vậy nên tiềm năng khai thác các hợp chất chuyên hóa thứ cấp phụ vụ cho y học là rất lớn. Nắm cộng sinh địa y với các hợp chất chuyển hóa thứ cap của chúng được xem là một nguồn thay thé có tiềm năng trong điều trị DTD tuýp 2 [19]. Trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau các nam cộng sinh có thé tạo ra những hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau [20]. Mycobiont với đa dạng thành phần loài, tạo nên sự đa đạng các sản phâm chuyên hóa thứ cấp có thê ứng dụng trong y học, nhưng hiện vẫn còn hạn chế về các nghiên cứu đặc biệt là các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nam chỉ Migrovofheliưm:; bên cạnh đó kha năng mycobiont tạo được sản phẩm thứ cấp nhiều hay ít, hoạt tính mạnh hay yếu còn phụ thuộc lớn vào điều kiện môi trường nuôi cay chúng.

Vi vậy, cần thiết phải cỏ các nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của mycobiont chỉ Nigrovothelium. Nhận thấy được tinh cấp thiết, dé tài “Khao sát ảnh hướng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính ức chế enzyme ơ-glucosidase của Nam cộng sinh địa y Nigrovothelium inspersotropicum được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của điều kiên nuôi cây đến hoạt tính ức chế enzyme a- glucosidase của nắm cộng sinh dia y N. Đối tượng nghiên cứu Nắm cộng sinh địa y N.

inspersotropicum đã được phan lập từ trước và được lưu trữ tại phỏng Sinh hóa — Vi sinh với mã số UE — MY06, Loài nam này được phân lập từ mẫu địa y được thu từ Thị xã Kiến Tường Tinh Long An (10.940441) vào tháng 5 năm 2022. Mẫu nắm cộng sinh này thuộc bộ sưu tập nắm cộng sinh địa y của TS. Tran Thị Minh Định tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Nhiệm vụ nghiên cứu ~ Nuôi cay nam N.

~ Tao cao ethyl acetate từ sinh khối nắm. — Khảo sát hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase của cao ethyl acetate.