Khóa Luận Tốt Nghiệp Về Phân Lập Vi Khuẩn và Nghiên Cứu Môi Trường Thích Hợp

Khóa luận tốt nghiệp về phân lập vi khuẩn là một trong những đề tài quan trọng trong lĩnh vực công nghệ… 126 trang · Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2011.

• Tác giả: Huỳnh Thị Hồng Hoa
• Người hướng dẫn: Tô Minh Châu
• Trường học: Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Vi Sinh – Sinh Học Phân Tử
• Đề tài: Phân Lập Vi Khuẩn L. Khảo Sát Môi Trường Thích Hợp
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH TM – SX THUỐC THÚ Y Gaáu Vaøng
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC
• 1.2. Lịch sử probiotic
• 1.3. Định nghĩa probiotic
• 1.4. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic
• 1.5. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
• 1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam
• 1.7. TÌM HIỂU VỀ SẢN PHẨM CỐM VI SINH BIOBABY
• 1.7.1. Giới thiệu sản phẩm cốm vi sinh Biobaby
• 1.7.2. Chống chỉ định
• 1.7.3. Sử dụng cho phụ nữ có thai và cho con bú
• 1.7.4. Nhà sản xuất
• 1.8. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC
• 1.8.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lên men lactic
• 1.9. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN BACILLUS
• 1.9.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus
• 1.10. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN L.
• 1.10.1. Lịch sử phát hiện
• 1.10.2. Đặc điểm phân loại
• 1.10.3. Đặc điểm phân bố
• 1.10.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
• 1.10.5. Những đặc điểm chức năng sinh học tương đồng giữa L.sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác
• 1.10.6. Các đặc tính giúp L.sporogenes vượt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic
• 1.11. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG L.
• 1.12. KHÁI QUÁT VỀ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG SẢN XUẤT CHO VI KHUẨN L.SPOROGENES VÀ CƠ CHẤT TRỘN ĐƯỜNG LACTOSE TRONG SẢN XUẤT BÁN THÀNH PHẨM
• 1.12.1. Môi trường sản xuất
• 1.12.2. Cơ chất trộn đường lactose
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN
• 2.2. VẬT LIỆU - HÓA CHẤT- THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƯỜNG
• 2.2.1. Môi trường
• 2.2.2. Dụng cụ - thiết bị
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
• 2.3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn L.
• 2.3.2. Khảo sát quá trình nhân giống thu sinh khối L.
• 2.3.3. Quá trình phối trộn và khảo sát các phương pháp sấy tạo bán sản phẩm khô
• 2.3.4. Kiểm tra bán sản phẩm khô sau thời gian bảo quản
• 2.3.5. Phương pháp đếm số lượng tế bào trên môi trường thạch MRS
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP L.SPOROGENES TỪ CHẾ PHẨM CỐM VI SINH BIOBABY
• 3.1.1. Quan sát khuẩn lạc đặc trưng
• 3.1.2. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn
• 3.1.3. Khảo sát cáchản ứng sinh hóa
• 3.1.4. Định danh vi khuẩn phân lập được và giữ giống
• 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG THU SINH KHỐI VI KHUẨN L.
• 3.2.1. Tăng sinh vi khuẩn L.sporogenes và chọn môi trường tăng sinh thích hợp
• 3.2.2. Nhân giống và khảo sát chọn môi trường sản xuất thích hợp
• 3.2.3. Quá trình ly tâm thu sinh khối
• 3.3. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHỐI TRỘN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẤY TẠO BÁN SẢN PHẨM
• 3.3.1. Quá trình phối trộn
• 3.3.2. Các phương pháp sấy tạo bán sản phẩm khô
• 3.4. KIỂM TRA BÁN THÀNH PHẨM KHÔ SAU THỜI GIAN BẢO QUẢN
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Khóa Luận Tốt Nghiệp Phân Lập Vi Khuẩn

Khóa luận tốt nghiệp về phân lập vi khuẩn là một trong những đề tài quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Đề tài này không chỉ giúp sinh viên nắm vững kiến thức lý thuyết mà còn thực hành các kỹ thuật phân lập vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn L.sporogenes. Việc nghiên cứu môi trường thích hợp cho vi khuẩn này có thể mở ra nhiều ứng dụng trong ngành chăn nuôi và thủy sản.

1.1. Tổng quan về vi khuẩn và vai trò của chúng

Vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái và sức khỏe động vật. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa và bảo vệ đường ruột khỏi các vi khuẩn gây bệnh.

1.2. Tầm quan trọng của việc phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn giúp xác định các chủng vi sinh vật có lợi, từ đó phát triển các chế phẩm sinh học phục vụ cho ngành nông nghiệp và y tế.

II. Vấn đề và Thách thức trong Nghiên Cứu Vi Khuẩn

Nghiên cứu vi khuẩn gặp nhiều thách thức, từ việc xác định môi trường nuôi cấy thích hợp đến việc duy trì sự sống của vi khuẩn trong điều kiện khác nhau. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng đều ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy cần được tối ưu hóa để đảm bảo vi khuẩn phát triển tốt nhất. Các yếu tố như độ pH, nhiệt độ và nồng độ dinh dưỡng cần được kiểm soát chặt chẽ.

2.2. Thách thức trong việc ứng dụng vi khuẩn trong thực tiễn

Việc ứng dụng vi khuẩn trong thực tiễn gặp khó khăn do sự thay đổi điều kiện môi trường sống và khả năng tương tác với các vi sinh vật khác.

III. Phương Pháp Phân Lập Vi Khuẩn Hiệu Quả

Để phân lập vi khuẩn L.sporogenes, cần áp dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Các kỹ thuật như nuôi cấy trên môi trường đặc biệt và phân tích sinh hóa sẽ giúp xác định chính xác chủng vi khuẩn.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn L.sporogenes

Quy trình phân lập bao gồm các bước như nuôi cấy, thu hoạch và xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn.

3.2. Các phương pháp phân tích sinh hóa

Sử dụng các phương pháp sinh hóa để xác định tính chất và khả năng sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó khẳng định chủng loại.

IV. Khảo Sát Môi Trường Thích Hợp cho Vi Khuẩn

Khảo sát môi trường nuôi cấy là bước quan trọng trong nghiên cứu vi khuẩn. Môi trường thích hợp sẽ giúp vi khuẩn phát triển mạnh mẽ và sản xuất ra các chế phẩm sinh học có giá trị.

4.1. Môi trường nuôi cấy L.sporogenes

Môi trường nuôi cấy cần có các thành phần dinh dưỡng phù hợp để hỗ trợ sự phát triển của vi khuẩn L.sporogenes.

4.2. Tác động của môi trường đến vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển mà còn quyết định đến khả năng sản xuất các chất có lợi từ vi khuẩn.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu về phân lập vi khuẩn L.sporogenes có thể được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học cho ngành chăn nuôi và thủy sản. Các sản phẩm này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe vật nuôi mà còn nâng cao năng suất.

5.1. Ứng dụng trong ngành chăn nuôi

Chế phẩm sinh học từ vi khuẩn L.sporogenes có thể được sử dụng để cải thiện sức khỏe đường ruột của gia súc và gia cầm.

5.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn L.sporogenes có khả năng sản xuất acid lactic, giúp ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

VI. Kết Luận và Tương Lai của Nghiên Cứu Vi Khuẩn

Nghiên cứu về phân lập vi khuẩn L.sporogenes mở ra nhiều triển vọng cho ngành công nghệ sinh học. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn này sẽ góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm trong ngành chăn nuôi và thủy sản.

6.1. Tương lai của nghiên cứu vi khuẩn

Nghiên cứu vi khuẩn sẽ tiếp tục phát triển, mở ra nhiều cơ hội mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất thực phẩm và thuốc.

6.2. Định hướng phát triển sản phẩm sinh học

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm sinh học từ vi khuẩn để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò thiết yếu đối với sức khỏe và hoạt động tiêu hóa của động vật. Trong đường ruột (đặc biệt là đại tràng, nơi chứa khoảng 400–500 loài vi khuẩn khác nhau và lượng vi khuẩn chiếm khoảng 40% trọng lượng khô của phân), sự mất cân bằng giữa các quần thể vi sinh vật có ích và có hại là nguyên nhân chính dẫn đến các rối loạn tiêu hóa và kém hấp thu dưỡng chất. Trước đây, việc bổ sung kháng sinh liều thấp vào thức ăn chăn nuôi được sử dụng phổ biến nhằm kiểm soát vi khuẩn gây bệnh và kích thích tăng trưởng. Tuy nhiên, từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, Liên minh Châu Âu (EU) đã ban hành lệnh cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các giải pháp sinh học thay thế an toàn và bền vững.

Sử dụng chế phẩm probiotic là giải pháp thay thế kháng sinh được quan tâm hàng đầu. Tuy vậy, các sản phẩm probiotic nhập khẩu trên thị trường Việt Nam thường bộc lộ hạn chế do các chủng vi sinh vật ngoại lai khó thích ứng tối ưu với điều kiện môi trường sống và đường ruột của vật nuôi bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu và quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học probiotic phục vụ chăn nuôi trong nước còn hạn chế, chủ yếu phụ thuộc vào nguồn ngoại nhập.

Vi khuẩn Lactobacillus sporogenes (còn được phân loại là Bacillus coagulans) là vi khuẩn lên men lactic có khả năng tạo nội bào tử, sở hữu khả năng chịu nhiệt độ cao, đề kháng môi trường acid dạ dày và muối mật tốt hơn so với các loài Lactobacillus thông thường, đồng thời tạo ra đồng phân L(+) acid lactic an toàn cho cơ thể. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của ngành sản xuất thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản, tác giả Huỳnh Thị Hồng Hoa đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp nhằm phân lập chủng vi khuẩn hữu ích này từ chế phẩm thương mại, khảo sát điều kiện dinh dưỡng và công nghệ sấy tạo bột bán thành phẩm.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài bao gồm 5 nội dung chính:

1. Phân lập để tìm ra vi khuẩn L. sporogenes có trong chế phẩm sinh học Biobaby.
2. Tiến hành thử test sinh hóa để khẳng định lại vi khuẩn đã được định danh.
3. Khảo sát các môi trường tăng sinh của vi khuẩn L. sporogenes: NB (Nutrient Broth) và NB + 1% glucose.
4. Khảo sát môi trường sản xuất của vi khuẩn L. sporogenes: môi trường đậu nành và môi trường sữa (sữa bột nguyên kem, sữa đặc có đường).
5. Tìm hiểu phương pháp sấy khô chế phẩm với môi trường thích hợp đã chọn và kiểm tra số lượng vi khuẩn sau khi sấy khô.

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Lactobacillus sporogenes phân lập từ chế phẩm cốm vi sinh Biobaby; các loại môi trường nuôi cấy tăng sinh và sản xuất sinh khối; cơ chất phối trộn đường lactose; các phương pháp sấy khô (sấy chân không và sấy tầng sôi).
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 02/2010 đến tháng 07/2010.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Công ty TNHH Thương mại – Sản xuất Thuốc Thú-y Gấu Vàng (458 Cách Mạng Tháng 8, Phường 04, Quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân loại

Nghiên cứu dựa trên hệ thống cơ sở lý thuyết về vi sinh vật probiotic và vi khuẩn sinh acid lactic:

• Định nghĩa probiotic: Theo Fuller (1989), probiotic là chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ; theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2001), probiotic là các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật chủ.
• Cơ chế tác động: Gồm 3 cơ chế chính: (1) Cạnh tranh loại trừ vị trí bám dính trên niêm mạc ruột và cạnh tranh dưỡng chất; (2) Đối kháng vi khuẩn thông qua việc sản sinh acid lactic làm hạ pH đường ruột (xuống mức 4–5), tiết bacteriocin, hydrogen peroxide và các acid hữu cơ; (3) Điều hòa và kích thích hệ miễn dịch thông qua thành phần peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn.
• Vị trí phân loại và đặc tính của Lactobacillus sporogenes: Phân lập lần đầu năm 1933 bởi Horowitz-Wlassowa và Nowotelnow, xếp vào chi Lactobacillus, sau đó trong Bergey (1974) được định danh lại là Bacillus coagulans. Tế bào hình que (0,3–0,8 µm × 3,0–5,0 µm), Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng tạo nội bào tử hình ellip (0,9–1,2 µm × 1,0–1,7 µm). Bào tử có cấu tạo gồm phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic - calcium, có khả năng tồn tại ở 100°C trong 20 phút và bền vững trong môi trường dịch vị dạ dày (pH 2–3), muối mật ≥ 2%.

Bảng dưới đây tổng hợp các đặc điểm dinh dưỡng của ba nguồn nguyên liệu được sử dụng làm môi trường sản xuất trong nghiên cứu:

Thành phần chính (trong 100 g)	Chất đạm (g)	Chất béo (g)	Hydratcacbon (g)	Khoáng chất (g)	Vitamin (g)
Sữa bột nguyên kem	18,5	24,0	45,5	4,5	3,0
Sữa đặc có đường	2,8	10,7	57,3	1,1	0,2
Hạt đậu nành	34,0	18,0	25,0	5,0	0,2

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng hoàn toàn các phương pháp thực nghiệm vi sinh học tiêu chuẩn:

• Phương pháp phân lập và thuần khiết: Sử dụng môi trường chọn lọc MRS agar (De Man, Rogosa, Sharpe) từ mẫu cốm vi sinh Biobaby (chứa L. sporogenes với mật độ danh định $5,0 \times 10^7$ vi khuẩn sống/g).
• Phương pháp quan sát hình thái và thử nghiệm sinh hóa: Nhuộm Gram, soi kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X, quan sát bào tử, thử nghiệm tính di động trên môi trường thạch bán lỏng. Khảo sát khả năng lên men các loại đường (lactose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, maltose, sucrose, trehalose) sử dụng chỉ thị màu phenol red. Thử nghiệm phản ứng catalase, oxidase, khử nitrate, khả năng sinh $H_2S$ và sinh gas.
• Phương pháp nhân giống và khảo sát môi trường: Nuôi cấy tăng sinh trên môi trường dịch thể NB và NB bổ sung 1% glucose; lên men trên 3 môi trường sản xuất (sữa bột nguyên kem, sữa đặc có đường, môi trường đậu nành) ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ và 48 giờ.
• Phương pháp hóa lý và định lượng: Đo biến thiên pH môi trường; xác định hàm lượng acid lactic tạo thành thông qua phương pháp chuẩn độ đo độ chua Thörner (°T) bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein.
• Phương pháp thu nhận và làm khô sinh khối: Ly tâm thu sinh khối tế bào, phối trộn với tá dược đường lactose làm chất bảo vệ và chất mang; thử nghiệm sấy khô bằng hai công nghệ: sấy chân không và sấy tầng sôi.
• Phương pháp đếm khuẩn lạc và theo dõi bảo quản: Đếm mật độ vi khuẩn sống (CFU/g, CFU/ml) bằng kỹ thuật cấy gạt đĩa thạch MRS; kiểm tra định kỳ mật độ vi khuẩn trong bán thành phẩm khô sau 60 ngày bảo quản ở điều kiện lạnh (4–10°C) và nhiệt độ phòng.

Nội dung chính theo từng chương

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương này tập hợp các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về:

• Lịch sử phát triển và bản chất của probiotic, phân tích tiêu chuẩn tuyển chọn chủng vi sinh vật an toàn theo khuyến cáo của FAO và SCAN.
• Thông tin chi tiết về sản phẩm cốm vi sinh Biobaby của Công ty IL-DONG Pharmaceutical Co., Ltd (Hàn Quốc), bao gồm thành phần hoạt chất (Lactobacillus sporogenes, Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, nấm men bia khô và các vitamin nhóm B, vitamin C).
• So sánh phân loại học, hình thái, đặc tính sinh trưởng, sinh hóa giữa L. sporogenes với các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và chi Bacillus.
• Phân tích ưu thế vượt trội của L. sporogenes so với L. acidophilus: bào tử L. sporogenes chịu nhiệt (sống ở 100°C/20 phút), không bắt buộc phải bổ sung vitamin để sinh trưởng, lên men đồng hình sinh L(+) acid lactic không gây toan chuyển hóa, khả năng bảo quản ở nhiệt độ phòng lên đến 3 năm.
• Khái quát giá trị dinh dưỡng của các nguồn cơ chất lên men (sữa, đậu nành) và vai trò của đường lactose làm chất độn trong công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh.

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIÊN CỨU

Chương này trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất, môi trường dinh dưỡng và các sơ đồ bố trí thí nghiệm:

• Bố trí thí nghiệm phân lập L. sporogenes từ cốm Biobaby trên môi trường thạch MRS.
• Quy trình tiến hành chuỗi thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn và quy trình kích thích, khảo sát sự hình thành bào tử.
• Quy trình tăng sinh giống trên môi trường NB và NB + 1% glucose; quy trình nhân giống và khảo sát 3 môi trường sản xuất (sữa bột, sữa đặc có đường, đậu nành).
• Quy trình ly tâm thu sinh khối tế bào, tỷ lệ phối trộn sinh khối ướt với cơ chất lactose.
• Quy trình vận hành và thông số kỹ thuật của hai phương pháp làm khô: sấy chân không và sấy tầng sôi để tạo bán thành phẩm dạng bột.
• Quy trình kiểm tra mật độ vi khuẩn sống trên môi trường MRS theo định kỳ bảo quản.

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Chương này công bố và thảo luận các số liệu thực nghiệm thu được:

• Kết quả phân lập và định danh: Chủng vi khuẩn thu được hình thành khuẩn lạc tròn lồi, trơn lấp lánh, đường kính khoảng 2,5 mm trên thạch MRS; tế bào hình que Gram dương kích thước 0,3–0,8 µm × 3,0–5,0 µm; có khả năng sinh nội bào tử dạng oval; di động trên môi trường thạch bán lỏng; lên men sinh acid từ các loại đường lactose, glucose, fructose, galactose, maltose, sucrose, trehalose, arabinose, xylose, mannose; phản ứng oxidase âm tính, nitrate âm tính, không sinh $H_2S$, không sinh gas, khẳng định đúng chủng L. sporogenes.
• Kết quả tăng sinh và lên men sản xuất:
  • Môi trường NB + 1% glucose giúp mật độ tế bào tăng sinh cao hơn rõ rệt so với môi trường NB không bổ sung đường.
  • Sau 24 giờ và 48 giờ lên men ở 37°C, pH ở cả 3 môi trường sản xuất đều giảm mạnh, tương ứng với sự gia tăng độ chua Thörner (°T) và hàm lượng acid lactic sinh ra.
  • So sánh mật độ tế bào ($CFU/ml$) và khối lượng sinh khối thu được sau ly tâm (tính trên 100 ml môi trường) giữa môi trường sữa bột nguyên kem, sữa đặc có đường và đậu nành.
• Kết quả phối trộn và sấy tạo bán sản phẩm:
  • Kiểm tra mật độ vi khuẩn trong hỗn hợp sau khi phối trộn đều với đường lactose.
  • Đánh giá sự biến đổi mật độ tế bào sống trước và sau khi sấy chân không và sấy tầng sôi. Cả hai phương pháp đều giữ được tỷ lệ sống cao của vi khuẩn nhờ đặc tính chịu nhiệt của nội bào tử.
• Kết quả theo dõi bảo quản bán thành phẩm trong 60 ngày: Đánh giá động thái suy giảm mật độ tế bào vi khuẩn trong bán sản phẩm bột khô theo các mốc thời gian bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng và điều kiện lạnh (4–10°C).

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

• Tổng kết các kết quả đạt được về phân lập, định danh, lựa chọn môi trường nuôi cấy và kỹ thuật sấy khô tạo bột chứa vi khuẩn L. sporogenes.
• Đề xuất các kiến nghị nhằm tiếp tục hoàn thiện công nghệ ở quy mô pilot và nghiên cứu sâu hơn về thời gian bảo quản thực tế của chế phẩm.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

Bảng dưới đây tổng hợp các đặc tính sinh học và phản ứng sinh hóa của chủng Lactobacillus sporogenes phân lập được so với các nhóm vi khuẩn đối chứng:

Tiêu chí khảo sát	Lactobacillus sporogenes	Lactobacillus thông thường	Bacillus thông thường
Bắt màu Gram	Gram dương (+)	Gram dương (+)	Đa số Gram dương (+)
Hình dạng tế bào	Trực khuẩn que thon, có dạng thẳng hoặc hơi uốn cong	Trực khuẩn que thon	Trực khuẩn thẳng
Khả năng tạo bào tử	Có nội bào tử hình ellip chịu nhiệt	Không sinh bào tử	Có sinh bào tử
Tính di động	Di động	Không di động	Đa số di động
Phản ứng Oxidase / Nitrate	Âm tính (-) / Âm tính (-)	Âm tính (-) / Âm tính (-)	Dương tính (+) / Dương tính (+)
Lên men đường Lactose	Có lên men sinh acid	Có lên men	Không lên men
Loại acid lactic tạo thành	L(+) Acid lactic	L(+) hoặc D(-) Acid lactic	Tùy loài
Khả năng chịu nhiệt	Sống ở 100°C trong 20 phút	Bị tiêu diệt khi thanh trùng	Chịu nhiệt

Các kết quả thực nghiệm nổi bật bao gồm:

• Phân lập thành công chủng vi khuẩn thuần khiết từ cốm Biobaby mang đầy đủ đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa đặc trưng của L. sporogenes.
• Xác định môi trường NB bổ sung 1% glucose là môi trường tăng sinh thích hợp cho mật độ vi khuẩn cao.
• Chứng minh cả 3 loại môi trường sản xuất (sữa bột nguyên kem, sữa đặc có đường, đậu nành) đều đáp ứng tốt cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp acid lactic của vi khuẩn; trong đó môi trường đậu nành là nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có, giá thành rẻ, cho hiệu quả thu nhận sinh khối cao.
• Thử nghiệm thành công hai phương pháp sấy chân không và sấy tầng sôi khi phối trộn sinh khối với tá dược đường lactose, tạo ra bán thành phẩm dạng bột khô có mật độ tế bào sống đạt tiêu chuẩn probiotic và duy trì độ ổn định qua 60 ngày theo dõi bảo quản.

Đóng góp và đề xuất ứng dụng

• Đóng góp học thuật và thực tiễn: Khóa luận đã hệ thống hóa và làm rõ các đặc tính phân loại, sinh hóa của chủng Lactobacillus sporogenes (loài trung gian mang đặc tính của cả Lactobacillus và Bacillus). Đồng thời, đề tài đưa ra giải pháp công nghệ tận dụng nguồn nguyên liệu nông sản trong nước (đậu nành, sữa) để sản xuất sinh khối vi sinh vật probiotic.
• Giải pháp và kiến nghị: Tác giả đề xuất quy trình sản xuất bán thành phẩm probiotic chịu nhiệt dạng bột ứng dụng trong chăn nuôi và thủy sản, giúp các đơn vị sản xuất thuốc thú y trong nước chủ động công nghệ, giảm thiểu chi phí nhập khẩu nguyên liệu và tạo ra sản phẩm an toàn thay thế kháng sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu: Đề tài được thực hiện trong thời gian giới hạn 6 tháng (02/2010 – 07/2010) ở quy mô phòng thí nghiệm tại Công ty Gấu Vàng. Thời gian theo dõi độ ổn định của bán thành phẩm bột khô mới dừng lại ở mốc 60 ngày. Nghiên cứu chưa tiến hành các thử nghiệm in vivo trên vật nuôi thực tế để đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh đường ruột và tăng trọng.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Nâng quy mô nuôi cấy lên hệ thống lên men pilot và quy mô sản xuất công nghiệp.
  • Khảo sát tối ưu hóa tỷ lệ phối trộn giữa sinh khối vi khuẩn và các loại tá dược bảo vệ khác ngoài lactose.
  • Kéo dài thời gian theo dõi độ sống sót của bào tử trong bán thành phẩm khô từ 1 đến 3 năm ở các điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khác nhau.
  • Thử nghiệm lâm sàng bổ sung chế phẩm vào khẩu phần ăn của gia súc, gia cầm và môi trường nuôi tôm cá để đánh giá hiệu quả thực tế.

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng tài liệu: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, giảng viên và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Vi sinh, Chăn nuôi – Thú y, Công nghệ Thực phẩm và Dược học.
• Các nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình phân lập, hệ thống khóa phân loại và bảng thử nghiệm sinh hóa chi tiết để định danh các vi khuẩn sinh acid lactic có tạo bào tử.
  • Phương pháp chuẩn độ độ chua Thörner (°T) để định lượng acid lactic trong quá trình lên men.
  • Dữ liệu so sánh thành phần dinh dưỡng và quy trình nuôi cấy sinh khối trên các môi trường thực phẩm tự nhiên (đậu nành, sữa).
  • Quy trình kỹ thuật và thông số sấy khô (sấy chân không, sấy tầng sôi) tạo bán sản phẩm vi sinh dạng bột.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nguyên liệu ban đầu được tác giả sử dụng để phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes là gì?

Tác giả sử dụng sản phẩm cốm vi sinh Biobaby (do Công ty IL-DONG PHARMACEUTICAL CO., LTD - Hàn Quốc sản xuất, phân phối bởi MERAP GROUP). Mỗi gam cốm Biobaby chứa 25,0 mg Lactobacillus sporogenes (tương đương $5,0 \times 10^7$ vi khuẩn sống), kết hợp cùng Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, nấm men bia khô và các vitamin nhóm B, vitamin C.

2. Vi khuẩn Lactobacillus sporogenes có những ưu điểm vượt trội nào so với Lactobacillus acidophilus trong ứng dụng probiotic?

L. sporogenes có khả năng sinh nội bào tử giúp sống sót qua xử lý nhiệt 100°C trong 20 phút, chịu được acid dạ dày và muối mật, bảo quản ổn định ở nhiệt độ phòng tới 3 năm. Ngoài ra, vi khuẩn này không yêu cầu bổ sung vitamin phức tạp khi nuôi cấy và lên men tạo đồng phân L(+) acid lactic dễ chuyển hóa hoàn toàn trong cơ thể, không gây nguy cơ nhiễm acid chuyển hóa như đồng phân D(-) acid lactic do L. acidophilus tạo ra.

3. Những môi trường dinh dưỡng nào đã được khảo sát để nuôi cấy tăng sinh và lên men sản xuất sinh khối?

Ở giai đoạn nuôi tăng sinh, tác giả khảo sát môi trường dịch thể NB (Nutrient Broth) và NB có bổ sung 1% glucose. Ở giai đoạn lên men sản xuất thu sinh khối, tác giả khảo sát 3 loại môi trường dinh dưỡng gồm: môi trường sữa bột nguyên kem, môi trường sữa đặc có đường và môi trường dịch chiết hạt đậu nành.

4. Tá dược nào được sử dụng để phối trộn với sinh khối vi khuẩn trước khi sấy khô và có vai trò gì?

Tác giả sử dụng đường lactose làm cơ chất phối trộn với sinh khối ướt sau khi ly tâm. Lactose đóng vai trò là chất mang, chất độn tạo cấu trúc bột và là tác nhân bảo vệ tế bào vi khuẩn, đồng thời cung cấp nguồn năng lượng cho vi khuẩn khi tái hoạt hóa.

5. Hai công nghệ làm khô nào đã được thử nghiệm để tạo bán thành phẩm bột vi sinh?

Tác giả đã thử nghiệm và so sánh hai phương pháp làm khô là sấy chân không và sấy tầng sôi. Cả hai phương pháp đều cho phép thu nhận bán thành phẩm dạng bột khô tơi xốp, giữ được mật độ tế bào sống cao và duy trì khả năng sống của bào tử vi khuẩn qua 60 ngày bảo quản.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Huỳnh Thị Hồng Hoa đã hoàn thành toàn diện quy trình thực nghiệm từ phân lập, định danh sinh hóa chủng vi khuẩn hữu ích Lactobacillus sporogenes từ chế phẩm Biobaby đến tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tăng sinh và lên men sản xuất sinh khối. Nghiên cứu đã chứng minh tính khả thi của việc sử dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước như đậu nành và sữa kết hợp kỹ thuật sấy khô (sấy chân không, sấy tầng sôi) cùng tá dược lactose để tạo bán thành phẩm probiotic bền nhiệt dạng bột. Đây là công trình thực nghiệm có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao, đóng góp cơ sở kỹ thuật quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm sinh học thú y thay thế kháng sinh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ vi sinh vật đóng một vai trò rất quan trọng ở đường tiêu hóa, đặc biệt là ở đại tràng. Đại tràng có khoảng 400-500 loài vi khuẩn khác nhau. Các nhà khoa học khẳng định vi khuẩn chiếm 40% trọng lượng khô, trong 1 gam phân có 30- 40 tỷ vi khuẩn. Trong một ngày đêm, mỗi người thải ra 17 ngàn tỷ vi khuẩn.

Các loại vi khuẩn ngoài việc tham gia vào khâu cuối cùng của quá trình tiêu hóa còn đảm nhiệm chức năng bào vệ đại tràng.[9] Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khỏe hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu. Nên việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm.

Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi -Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở thành cấp bách. Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là dùng các chế phẩm probiotic. Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ.

Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ Sv: Huỳnh Thị Hồng Hoa Trang 1 Created with novaPDF Printer (www. Please register to remove this message. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TÔ MINH CHÂU ràng. Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó do có sự thay đổi điều kiện môi trường sống nên đã không có tác dụng tốt nhất cho hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa.

Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. Cốm vi sinh Biobaby là sản phẩm sinh học có chứa vi khuẩn L.sporogenes là một trong các vi sinh vật sản xuất ra acid lactic, acid hoá đường ruột và ngăn ngừa được sự phát triển của các vi khuẩn gây thối rữa. Tính chất dược lý quan trọng của sản phẩm Biobaby, chính là thành phần vi sinh có trong sản phẩm.sporogenes được quan tâm có trong chế phẩm Biobaby là một loại vi khuẩn có lợi, có tác dụng ngăn chặn các vi khuẩn gây thối, gây bệnh đường tiêu hóa cho người và động vật. Vấn đề được đặt ra là phân lập vi khuẩn L.sporogenes và tiến hành khảo sát môi trường tăng sinh, môi trường sản xuất nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong ngành chăn nuôi – thủy sản? Được sự chấp thuận của quý công ty TNHH thương mại –sản xuất thuốc thú-y Gaáu Vaøng, với sự giúp đỡ hướng dẫn của cô Tô Minh Châu, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn L.

Khảo sát môi trường thích hợp. Tìm hiểu phương pháp sấy khô chế phẩm chứa vi khuẩn”. Với định hướng đưa ra được các giải pháp công nghệ để sản xuất các chế phẩm sinh học bằng các nguyên liệu trong nước. Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi theo hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu.

Sv: Huỳnh Thị Hồng Hoa Trang 2 Created with novaPDF Printer (www. Please register to remove this message. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TÔ MINH CHÂU Đề tài thực hiện nhằm những mục tiêu như sau: - Phân lập để tìm ra vi khuẩn L.sporogenes có trong chế phẩm sinh học Biobaby. - Tiến hành thử test sinh hóa để khẳng định lại vi khuẩn đã được định danh.

- Khảo sát các môi trường tăng sinh của vi khuẩn L.sporogenes: NB+1% glucose, NB. - Khảo sát môi trường sản xuất của vi khuẩn L.sporogenes: môi trường đậu nành và môi trường sữa. - Tìm hiểu phương pháp sấy khô chế phẩm với môi trường thích đã chọn và kiểm tra số lượng vi khuẩn sau khi sấy khô. • Thời gian và địa điểm thí nghiệm: 1.

Thời gian: từ tháng 02/2010 đến tháng 07/2010. Địa điểm thí nghiệm: - Phòng thí nghiệm vi sinh của công ty TNHH thương mại –sản xuất thuốc thú-y Gaáu Vaøng. Sv: Huỳnh Thị Hồng Hoa Trang 3 Created with novaPDF Printer (www. Please register to remove this message.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TÔ MINH CHÂU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sv: Huỳnh Thị Hồng Hoa Trang 4 Created with novaPDF Printer (www. Please register to remove this message. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TÔ MINH CHÂU 1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC [3].

Lịch sử probiotic. Vào thế kỷ 20, những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh. Năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic.

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột được sản xuất.

Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80. Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những Sv: Huỳnh Thị Hồng Hoa Trang 5 Created with novaPDF Printer (www.

Please register to remove this message. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TÔ MINH CHÂU vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất.

Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (1) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (2) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic. Vai trò của probiotic. Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt.

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau: - Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ. - Tăng cường khả năng miễn dịch. - Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. - Tăng sản xuất các axit béo bay hơi.

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B. - Làm giảm cholesterol huyết thanh. - Làm tăng năng suất vật nuôi. - Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.

Sv: Huỳnh Thị Hồng Hoa Trang 6 Created with novaPDF Printer (www. Please register to remove this message. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TÔ MINH CHÂU Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường. Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng.

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (1) cạnh tranh loại trừ; (2) đối kháng vi khuẩn và (3) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006). Minh họa cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1. Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí bám dính.