ĐẶT VẤN ĐỀ Khô đậu tương là loại nguyên liệu rất sẵn và rẻ, công dụng của nó lại hữu ích một cách trái ngược so với giá thành. Trước đây người ta hay sử dụng acid hoặc H2SO4 để thủy phân protein trong khô đậu tương. Nhưng kết quả cho thấy bằng cách này không tạo ra được nhiều sản phẩm mong muốn và không đáp ứng được tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Vì thế hiện nay thủy phân protein trong khô đậu tương bằng enzyme protease đang được nghiên cứu, sử dụng nhiều và hiệu quả tương đối cao.
Mặt khác, protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide trong phân tử protein, được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng. và chiếm khoảng 60% thị trường enzyme. Hiện nay trên thế giới, đa số các chế phẩm enzyme được thu nhận từ vi sinh vật do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ, đời sống và có nhiều ưu điểm vượt trội như chu kỳ phát triển 280 ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển…. Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.
Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng trong công nghiệp được sản xuất ra từ vi sinh vật. Hiện nay, trên thế giới, các chế phẩm protease đã được thương mại hóa và được đưa vào ứng dụng một cách rộng rãi. Tuy vậy, trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các tính chất của chế phẩm sản xuất từ enzyme protease. Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiên chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn còn hạn chế.
Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật, cũng như mong muốn tạo ra chế phẩm sản xuất từ enzyme protease có hoạt tính cao trong thủy phân đậu tương cơ chất tự nhiên sẵn có, tôi đã tiến hành 1 đề tài khóa luận: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương”. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1. Tìm hiểu chung về khô đậu tương Khô đậu tương (có khi gọi là khô đậu) là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp ép dầu đậu nành, là một thành phần quan trọng trong thức ăn chăn nuôi nhằm đáp ứng nhu cầu tăng cao đối với thức ăn protein cho động vật trong nước và xuất khẩu. Theo AAFCO (hiệp hội quản lý thức ăn chăn nuôi Mỹ), thì loại thức ăn này thu được khi đã xay nhuyễn phần đậu đã tách, ép dầu thông qua quá trình tinh chiết hoặc dùng dung môi hòa tan.
Khô đậu tương có hàm lượng protein, lysin tổng số, lysin tiêu hóa, năng lượng cao và hàm lượng chất xơ thấp là nguồn phế phụ phẩm cung cấp protein tốt nhất cho gia súc, gia cầm. Đặc biệt khô đậu tương là loại sản phẩm rất sẵn và rẻ, ở nước ta mỗi năm lượng KĐT thải ra từ các nhà máy là rất lớn phục vụ cho việc sản xuất thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Chế phẩm thức ăn chăn nuôi từ KĐT được xem như là loại thức ăn cung cấp năng lượng và bổ sung đạm cho gia súc, gia cầm, lượng tiêu thụ KĐT ước tính khoảng 3.8 triệu tấn (2013) và 4.05 triệu tấn (2014) và tăng dần đều lên hàng năm …[13] Bảng. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.
Thành phần dinh dưỡng của khô đậu tương Thành phần Hàm lượng (%) Protein 45,4 Lysin 2,42 Chất xơ 5,5 Photpho 0,65 Nguồn: http://vcn. Một số chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đậu tương Các vi sinh vật thường được sử dụng trong lên men đậu tương như: các loại nấm mốc: Aspergillus oryaze, Mucor, Rhizopus, Oligosporus. Nấm men: Saccharomyces cerevisiae. Các loại vi khuẩn như: Streptococcus thermophiles, Bacillus subtilis….
Nấm Nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. saitoi, Penicillium chysogenum…. Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả 3 loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tỏng hợp chủ yếu các loại protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5- 3 [23].
Một số nấm mốc khác như: A. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất forrmat [17]. Trong thực tế A. oryzae có khả năng tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulase, pectinase… khi sống trên môi trường cơ chất khô đậu tương và được ứng dụng rất rộng rãi trong sản xuất chế biến thực phẩm [22] [12].
Vi khuẩn Vi khuẩn (bacteria) là những sinh vật đơn bào, nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy chúng được dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ba dạng chủ yếu ở vi khuẩn: trực khuẩn, cầu khuẩn, xoắn khuẩn [12]. 4 Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân từ protein [9].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu [19].
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease đông vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B.
thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [6]. Protease của bacillus ưa kiềm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân ra từ 20.000, ổn định ở trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 [29]. Giới thiệu chung Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide (-O–NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn.
Nhiều protease còn có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết ester, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau: 5 Hình. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Phản ứng thủy phân dưới xúc tác của enzyme protease 1.
Phân loại Dựa vào cơ chế xúc tác [27] Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm: - Nhóm 1: Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cách đầu mạch. Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase. - Nhóm 2: Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch.
Xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptidase Hình. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Cơ chế xúc tác của enzyme protease Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động [28] 6 Dựa vào cấu trúc nhóm chức ở trung tâm hoạt động, endopeptidase được chia thành 4 nhóm: - Serin – proteinase (EC 3.21): là những protease có nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng. - Cystein – proteinase (EC 3.22): là các protein có nhóm thiol (-SH) của acid amin cysteine ở trung tâm hoạt động.
Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease kí sinh trùng. Các cyteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. - Aspartic protease (EC 3.22): hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
Các aspartic protease có các nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. - Metallo protease (EC 3.23): metallo protease là nhóm protease trong cấu tạo có kim loại được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi, sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt động giảm mạnh dưới tác động của EDTA. Dựa vào pH hoạt động [24] Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease được chia làm 3 loại: - Protease acid: pH ở trong khoảng 2÷5.
Loại protease này thường được thu nhận từ các loại NS đen như: A. - Protease trung tính: có pH trong khoảng hẹp, từ 6÷7,5, không bền với nhiệt độ cao. Thu nhận chủ yếu từ các loại NS vàng như: A. - Protease kiềm tính: có pH ở trong khoảng 8÷11 thường được tổng hợp nhiều bởi nấm men và VK.
Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm gần đây vì có thể sử dụng chúng như chất 7 phụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da, xử lý chất thải môi trường. Dựa vào tính đặc hiệu của chúng với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi β- insulin bị oxy hóa [10] Năm 1975, Morihara đã phân loại các protease được chia ra thành bốn nhóm lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi β – Insulin đã bị oxy hóa. - Nhóm I - Serin proteinase: Tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về phía nhóm –CO2 của liên kết peptide hoặc gọi là carbonxyendopeptidase - Nhóm II - Cystein proteinase: Giống như cách phân loại theo đặc điểm có cấu tạo của trung tâm hoạt động. - Nhóm III - Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc amino acid về phía nhóm –NH– của liên kết peptide, được gọi là aminoendopeptidase.
- Nhóm IV - Aspartic proteinase: Có tính đặc hiệu đối với các nguồn gốc amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide. Cơ chế thủy phân của protease Hình. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide (-O–NH-) trong phân tử protein và các polypeptide.
Sản phẩm của 8 quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn.