Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Từ xa xưa, các loài thực vật tự nhiên đã được sử dụng phổ biến làm thực phẩm và nguồn dược liệu trị bệnh. Trong xu thế phát triển của y học hiện đại, việc nghiên cứu các hợp tính hóa học và dược tính sinh học từ thảo mộc ngày càng được chú trọng nhằm tạo ra các dược phẩm thiên nhiên an toàn, hiệu quả cho sức khỏe con người. Cây Cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là loài thảo mộc mọc hoang phổ biến tại nhiều vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong y học cổ truyền Việt Nam cũng như nhiều quốc gia, Cỏ sữa lá lớn được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh lỵ, viêm đường ruột, tiêu chảy, ho, hen phế quản, tắc tia sữa hoặc thiếu sữa ở phụ nữ sau sinh, hạ sốt, trị mụn cóc và hỗ trợ điều trị đái tháo đường. Mặc dù sở hữu nhiều giá trị dược tính dân gian, nguồn tài nguyên Cỏ sữa lá lớn tại Việt Nam thời điểm năm 2015 vẫn chưa được khảo sát chuyên sâu và toàn diện về thành phần hóa học tinh khiết.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:
- Thu hái, xử lý nguyên liệu và điều chế các phân đoạn cao chiết từ cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại tỉnh Đồng Nai.
- Ứng dụng các phương pháp sắc ký cột (silica gel pha thường) và sắc ký bản mỏng để phân tách, tinh chế và cô lập các hợp chất hữu cơ từ phân đoạn cao ethyl acetate.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hiện đại (1D-NMR, 2D-NMR) kết hợp đối chiếu với các tài liệu khoa học chuyên ngành đã công bố.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Toàn bộ mẫu cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
- Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái thực tế tại địa bàn tỉnh Đồng Nai.
- Phạm vi thời gian: Mẫu nguyên liệu thu hái vào năm 2013; các thực nghiệm hóa học, đo đạc phổ nghiệm và biện luận cấu trúc được tiến hành trong niên khóa 2011 - 2015 (hoàn thành tháng 5 năm 2015).
- Phạm vi nội dung chuyên môn: Tập trung phân lập và giải cấu trúc các hợp chất thứ cấp trong phân đoạn dịch chiết ethyl acetate (phân đoạn có độ phân cực trung bình đến cao).
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận vận dụng hệ thống cơ sở lý thuyết hóa học hợp chất tự nhiên, bao gồm các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp phổ biến trong thực vật như flavonoid, megastigmane glycoside, polyphenol (dẫn xuất acid ellagic), terpenoid, steroid và các hợp chất đường tự nhiên. Để xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất cô lập, đề tài áp dụng lý thuyết phân tích cấu trúc hóa học thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR: $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR: HSQC, HMBC). Kỹ thuật HSQC cho biết tương quan trực tiếp giữa proton và carbon qua một liên kết hóa học, trong khi kỹ thuật HMBC cung cấp thông tin về các tương tác dị hạt nhân tầm xa giữa proton và carbon qua 2 hoặc 3 liên kết hóa học, giúp liên kết các mảnh cấu trúc aglycone và gốc đường.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tuần tự:
- Phương pháp chiết xuất: Chiết ngâm mẫu bột khô với ethanol $96^\circ$, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không Heidolph để tạo cao tổng thô. Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa và ethyl acetate.
- Phương pháp sắc ký cột cổ điển (CC): Sử dụng pha tĩnh là hạt silica gel kích thước $230 - 400\text{ Mesh}$ (hãng Himedia - Ấn Độ). Quá trình giải ly sử dụng các hệ dung môi hỗn hợp có độ phân cực biến thiên: ete dầu hỏa : ethyl acetate (ED:EA), ethyl acetate : methanol (EA:M), chloroform : methanol (C:M), n-hexane : ethyl acetate : acetone (He:EA:Ax), ethyl acetate : methanol : nước (EA:M:W), n-hexane : chloroform : methanol (He:C:M).
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel $60\text{ F}_{254}$ kích thước $20 \times 20\text{ cm}$ (hãng Merck). Phát hiện vết chất trên bản mỏng bằng đèn soi tử ngoại ở bước sóng UV $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$, kết hợp phun thuốc thử hiện hình dung dịch acid sulfuric $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }20%$ trong cồn rồi hơ nóng.
- Phương pháp phổ nghiệm: Ghi phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}$), $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\text{ MHz}$) và các phổ 2D-NMR trên máy Bruker Avance 500 tại Phòng Phân tích Cấu trúc - Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Cầu Giấy, Hà Nội) và Phòng Phân tích Trung tâm - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. Dung môi hòa tan mẫu đo phổ là dimethyl sulfoxide deuterated ($\text{DMSO-d}_6$).
Nguồn dữ liệu thực nghiệm bao gồm: $12\text{ kg}$ cây khô; $635\text{ g}$ cao ethanol thô; $60,4\text{ g}$ cao phân đoạn ete dầu hỏa; $335,27\text{ g}$ cao phân đoạn ethyl acetate; các thông số giải ly, giá trị $R_f$, khối lượng phân đoạn, giá trị độ chuyển dịch hóa học ($\delta$, ppm) và hằng số ghép spin ($J$, Hz) của các hợp chất cô lập. Các dữ liệu này được đối chiếu trực tiếp với các số liệu công bố quốc tế về hợp chất tự nhiên của các tác giả Gupta (1966), Blanc (1972), Mallavadhani (2009), Nomoto (2013) cùng nhiều công trình khác trong danh mục tài liệu tham khảo.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 cung cấp tổng quan toàn diện về đối tượng thực vật Euphorbia hirta L. trên các phương diện hình thái thực vật học, sinh thái phân bố, hoạt tính sinh học theo y học cổ truyền và dược lý hiện đại, cùng lịch sử khảo sát hóa thực vật học:
- Đặc điểm thực vật và sinh thái: Cây thân thảo nhỏ, mọc bò hoặc đứng, chiều cao từ $15 - 40\text{ cm}$, rễ phụ màu đỏ tím, toàn thân có lông vàng và chứa nhựa mủ trắng. Lá mọc đối, phiến lá hình mũi mác dài $1 - 4\text{ cm}$, rộng $1 - 1,5\text{ cm}$, mép khía răng cưa nhỏ, gốc cuống lá có 2 lá kèm nhỏ dạng lông cứng. Hoa tự hình chén nhỏ mọc ở nách lá, màu trắng đỏ nhạt. Quả nang 3 mảnh vỏ đường kính $1,5\text{ mm}$, chứa 3 hạt nhỏ màu nâu khi già. Loài cây này mọc hoang khắp các vùng đất sỏi đá, ven đường từ Bắc chí Nam tại Việt Nam, đồng thời phân bố rộng rãi tại Trung Quốc, Malaysia, Ấn Độ, Úc, châu Phi và châu Mỹ.
- Tác dụng dược lý và kinh nghiệm dân gian: Nhiều nghiên cứu thực nghiệm được tổng hợp chứng minh dịch chiết Cỏ sữa lá lớn có hoạt tính chống oxy hóa cao (chứa nhiều phenolic và flavonoid theo nghiên cứu của Abu Arra Basma, 2011); hoạt tính hỗ trợ điều trị đái tháo đường type 2 thông qua liên kết phân tử giữa protein mục tiêu với quercitrin, rutin, myricitrin (Quy Trinh, Ly Le, 2014); hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gây bệnh đường ruột Shigella spp. (Vero, K. Ananthan, 1995), cũng như hạt nano vàng (Au NPs) tổng hợp từ dịch chiết lá có khả năng ức chế Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae (A. Christina, 2013); hoạt tính chống viêm, giảm đau, hạ sốt và giải lo âu từ chiết xuất n-hexane và chiết xuất nước đông khô (M. Lanhaers, 1991); khả năng gây độc chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư vòm họng và ung thư biểu mô vảy (K. Ananthan, 1995). Văn bản cũng hệ thống các bài thuốc dân gian sử dụng Cỏ sữa lá lớn phối hợp hoàng đằng chữa lỵ; nấu cháo cùng hạt gạo chữa thiếu sữa sau sinh; nghiền lá tươi cầm tiêu chảy; đắp mủ trị mụn cóc, nứt nẻ môi và bài thuốc phối hợp bồng bồng, lá dâu chữa ho hen.
- Lịch sử nghiên cứu hóa thực vật: Điểm cứu các hợp chất đã được phân lập trên thế giới từ loài này, bao gồm:
- Nhóm flavonoid: euphorbianin, quercitol, leucocyanidol, quercitrin, myricitrin, isorhamnetin, pinocembrin, kaempferol, luteolin, quercetin, afzelin, isovitexin.
- Nhóm phenolic và acid hữu cơ: acid ellagic, acid gallic, acid shikimic, acid 3,4-di-O-galloylquinic, các dẫn xuất galloyl-D-glucose, scopoletin, scoparone, isoscopoletin, syringin.
- Nhóm steroid và terpenoid: taraxerol, friedelin, $\beta$-sitosterol, stigmasterol, cycloartenol, euphorbol, 24-methylenecycloartenol, $\beta$-amyrin, TPA, các dẫn xuất ent-kaurane.
- Nhóm alkane và alcohol: hexacosan-1-ol, hentriacontane, n-heptacosane, n-nonacosane, các n-butyl rhamnopyranoside và một số dẫn xuất glucoside chuỗi thẳng.
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình xử lý thực vật, điều chế các dịch chiết và các bước phân tách sắc ký cột đa cấp:
- Xử lý mẫu và chiết tách phân đoạn: $12\text{ kg}$ mẫu cây khô thu hái tại Đồng Nai được rửa sạch, phơi bóng râm, sấy ở $50 - 55^\circ\text{C}$, xay thành bột thô rồi ngâm chiết với ethanol $96^\circ$. Dịch chiết gom lại đem cô quay thu được $635\text{ g}$ cao ethanol thô. Cao thô được chiết lỏng - lỏng lần lượt với ete dầu hỏa và ethyl acetate, thu được $60,4\text{ g}$ cao ete dầu hỏa và $335,27\text{ g}$ cao ethyl acetate.
- Sắc ký cột phân đoạn cao ethyl acetate: Toàn bộ $335,27\text{ g}$ cao ethyl acetate được nạp lên cột sắc ký silica gel ($230 - 400\text{ Mesh}$), giải ly bằng hệ dung môi ED:EA và EA:M với độ phân cực tăng dần, thu được 5 phân đoạn lớn ký hiệu từ EA.1 đến EA.5:
| Phân đoạn |
Khối lượng (g) |
Hệ dung môi giải ly |
Đặc điểm sắc ký lớp mỏng (TLC) |
Hướng khảo sát tiếp |
| EA.1 |
2,305 |
ED:EA (7:3) |
Một vết tròn rõ màu vàng, có vết dơ |
Chưa khảo sát |
| EA.2 |
35,464 |
ED:EA (3:7) |
Nhiều vết, có hai vết chính, có vết dơ |
Chưa khảo sát |
| EA.3 |
50,811 |
EA 100% |
Nhiều vết, có ba vết chính, có vết dơ |
Khảo sát phân lập (thu EH7, EH8, EH10) |
| EA.4 |
103,401 |
EA:M (10:1) |
Nhiều vết, kéo dài |
Chưa khảo sát |
| EA.5 |
20,011 |
EA:M (5:5) |
Nhiều vết |
Chưa khảo sát |
- Quy trình phân lập chi tiết phân đoạn EA.3:
- Phân đoạn EA.3 ($50,811\text{ g}$) được tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung môi C:M (10:1), thu được 6 phân đoạn nhỏ: EA.3.1 ($0,456\text{ g}$), EA.3.2 ($1,452\text{ g}$), EA.3.3 ($2,004\text{ g}$), EA.3.4 ($3,567\text{ g}$), EA.3.5 ($1,789\text{ g}$) và EA.3.6 ($5,987\text{ g}$). Phân đoạn EA.3.4 có hai vết đen rõ trên TLC được chọn để tiếp tục phân tách.
- Sắc ký cột phân đoạn EA.3.4 ($3,567\text{ g}$) bằng hệ C:M (12:1) thu được 3 phân đoạn: EA.3.4.1 ($0,490\text{ g}$), EA.3.4.2 ($0,210\text{ g}$) và EA.3.4.3 ($0,154\text{ g}$).
- Cô lập hợp chất EH7: Phân đoạn EA.3.4.1 được sắc ký qua hệ He:EA:Ax (1:5:4 giọt) thu phân đoạn phụ ($0,167\text{ g}$). Tiếp tục giải ly phân đoạn này trên cột sắc ký silica gel với hệ EA:M:W (25:1:1), cô quay thu được $7\text{ mg}$ hợp chất EH7 ở dạng bột không màu. Kiểm tra bản mỏng trong hệ EA:M:W (16:1:1) cho một vết đơn có giá trị $R_f = 0,33$.
- Cô lập hợp chất EH8: Phân đoạn EA.3.4.2 được sắc ký cột với hệ He:EA:Ax (1:5:4 giọt) thu phân đoạn phụ ($0,132\text{ g}$). Phân đoạn này tiếp tục được giải ly trên cột silica gel với hệ He:C:M (2:2:0,5), cô quay thu được $5\text{ mg}$ hợp chất EH8 ở dạng nhựa kết dính không màu. Bản mỏng trong hệ He:EA:Ac (2:1:2) cho một vết đơn có giá trị $R_f = 0,35$.
- Cô lập hợp chất EH10: Phân đoạn EA.3.4.3 tiếp tục được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel, thu được $5\text{ mg}$ hợp chất EH10 ở dạng chất rắn màu trắng. Kiểm tra TLC trong hệ He:EA:Ax (3:4:1,2) cho một vết đơn có giá trị $R_f = 0,38$.
Chương 3: Kết quả - Thảo luận
Chương 3 trình bày các lập luận hóa học và dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chi tiết để chứng minh cấu trúc hóa học của 3 hợp chất tinh sạch đã cô lập:
- Hợp chất EH7 (methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside, công thức phân tử $\text{C}7\text{H}{14}\text{O}_5$, khối lượng $7\text{ mg}$):
- Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}$, $\text{DMSO-d}6$) ghi nhận một proton anomer của đường rhamnose tại $\delta{\text{H}} 4,24\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, br s, H-1); tín hiệu của ba proton nhóm methyl tại $\delta_{\text{H}} 1,17\text{ ppm}$ ($3\text{H}$, d, $J = 5,5\text{ Hz}$, H-6); tín hiệu ba proton gắn dị tố methoxy tại $\delta_{\text{H}} 3,34\text{ ppm}$ ($3\text{H}$, s, $\text{OCH}3$); các proton còn lại của khung đường rhamnopyranose xuất hiện ở vùng $\delta{\text{H}} 3,05 - 3,63\text{ ppm}$ gồm H-2 ($\delta_{\text{H}} 3,46$, dd, $J = 1,5; 3,5\text{ Hz}$), H-3 ($\delta_{\text{H}} 3,38$, dd, $J = 3,5; 9,5\text{ Hz}$), H-4 ($\delta_{\text{H}} 3,09$, t, $J = 9,5\text{ Hz}$) và H-5 ($\delta_{\text{H}} 3,32$, m).
- Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\text{ MHz}$) phối hợp DEPT xác định sự hiện diện của 7 nguyên tử carbon: 2 carbon nhóm $\text{CH}3$ tại $\delta{\text{C}} 17,9\text{ ppm}$ (C-6) và $55,7\text{ ppm}$ ($\text{OCH}3$); 5 carbon nhóm $\text{CH}$ gồm carbon anomer C-1 tại $\delta{\text{C}} 101,3\text{ ppm}$, carbon C-2 tại $\delta_{\text{C}} 70,4\text{ ppm}$, C-3 tại $\delta_{\text{C}} 72,0\text{ ppm}$, C-4 tại $\delta_{\text{C}} 72,5\text{ ppm}$ và C-5 tại $\delta_{\text{C}} 68,9\text{ ppm}$.
- Phổ 2D-NMR: Phổ HSQC xác định tương quan trực tiếp giữa H-1 với C-1 ($101,3\text{ ppm}$) và H-6 với C-6 ($17,9\text{ ppm}$). Phổ HMBC ghi nhận tương quan giữa proton H-1 ($\delta_{\text{H}} 4,24$) với carbon $\text{OCH}3$ ($\delta{\text{C}} 55,7$), chứng minh nhóm methoxy liên kết trực tiếp vào vị trí C-1 của vòng đường $\alpha$-L-rhamnopyranoside.
- Hợp chất EH8 (Blumenol C glucoside, công thức phân tử $\text{C}{19}\text{H}{34}\text{O}_8$, khối lượng $5\text{ mg}$):
- Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ cho thấy sự tồn tại của một phân tử đường $\beta$-D-glucopyranoside với tín hiệu proton anomer tại $\delta_{\text{H}} 4,15\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, d, $J = 8,0\text{ Hz}$, H-1') và 6 tín hiệu carbon đường tại $\delta_{\text{C}} 61,0\text{ ppm}$ (C-6'), $70,2\text{ ppm}$, $73,5\text{ ppm}$, $76,7\text{ ppm}$, $76,9\text{ ppm}$ và $102,3\text{ ppm}$ (C-1'). Tương quan HSQC chỉ ra hai proton ở $\delta_{\text{H}} 3,65\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, br d, $13,0\text{ Hz}$) và $\delta_{\text{H}} 3,41\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, dd, $12,5; 5,5\text{ Hz}$) cùng tương quan với carbon C-6' tại $\delta_{\text{C}} 61,0\text{ ppm}$.
- Khung aglycone chứa 13 nguyên tử carbon thuộc nhóm megastigmane, gồm: 3 carbon bậc bốn gồm một nhóm carbonyl liên hợp tại $\delta_{\text{C}} 198,1\text{ ppm}$ (C-3), hai carbon olefin tại $\delta_{\text{C}} 167,4\text{ ppm}$ (C-5) và một carbon bậc bốn C-1 tại $\delta_{\text{C}} 36,1\text{ ppm}$; 3 carbon nhóm $\text{CH}$ gồm carbon olefin C-4 tại $\delta_{\text{C}} 124,1\text{ ppm}$ ($\delta_{\text{H}} 5,71$, s), carbon C-6 tại $\delta_{\text{C}} 50,2\text{ ppm}$ ($\delta_{\text{H}} 1,87$, m) và carbon mang oxy C-9 tại $\delta_{\text{C}} 74,7\text{ ppm}$ ($\delta_{\text{H}} 3,72$, m); 3 nhóm $\text{CH}2$ gồm C-2 tại $\delta{\text{C}} 47,1\text{ ppm}$, C-7 tại $\delta_{\text{C}} 27,2\text{ ppm}$ và C-8 tại $\delta_{\text{C}} 35,5\text{ ppm}$; 4 nhóm methyl gồm H-11 ($\delta_{\text{H}} 1,00$, s), H-12 ($\delta_{\text{H}} 0,94$, s), H-13 ($\delta_{\text{H}} 1,88$, s) và H-10 ($\delta_{\text{H}} 1,15$, d, $J = 6,2\text{ Hz}$).
- Tương quan HMBC thể hiện rõ liên kết giữa proton anomer của đường H-1' ($\delta_{\text{H}} 4,15$) với carbon C-9 ($\delta_{\text{C}} 74,7$) của phần aglycone, chứng minh phần đường $\beta$-D-glucopyranoside được liên kết glycoside qua cầu oxy tại vị trí C-9 của khung megastigmane.
- Hợp chất EH10 (acid 4,4'-O-bisellagic, khối lượng $5\text{ mg}$):
- Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ xuất hiện hai tín hiệu proton thơm dạng mũi đơn tại $\delta_{\text{H}} 7,29\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, s, H-5) và $\delta_{\text{H}} 7,45\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, s, H-5').
- Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ phối hợp HSQC xác định phân tử có 14 carbon, gồm 12 carbon bậc bốn và 2 carbon nhóm $\text{CH}$ thơm tại $\delta_{\text{C}} 110,6\text{ ppm}$ và $111,8\text{ ppm}$. Trong đó, xuất hiện hai tín hiệu đặc trưng của carbon carbonyl nhóm chức este vòng (lactone) tại $\delta_{\text{C}} 160,5\text{ ppm}$ (C-7) và $\delta_{\text{C}} 159,0\text{ ppm}$ (C-7').
- Phổ HMBC xác nhận tương quan giữa proton H-5 ($\delta_{\text{H}} 7,29$) với các carbon C-1, C-3, C-4, C-7 và proton H-5' ($\delta_{\text{H}} 7,45$) tương quan với các carbon C-1', C-3', C-4', C-6', C-7'.
- Do số tín hiệu carbon trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$ nhiều gấp đôi số tín hiệu cơ bản của khung monomer acid ellagic, tác giả xác định cấu trúc EH10 là một phân tử dimer tạo thành từ hai đơn vị acid ellagic liên kết qua cầu nối ete tại vị trí 4,4' (acid 4,4'-O-bisellagic).
Tổng hợp thông số nhận diện 3 hợp chất tinh khiết cô lập từ cao ethyl acetate:
| Ký hiệu |
Tên hợp chất |
Dạng tồn tại |
Khối lượng (mg) |
Giá trị $R_f$ (Hệ dung môi) |
Công thức phân tử |
Nhóm cấu trúc |
| EH7 |
Methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
Bột không màu |
7 |
0,33 (EA:M:W 16:1:1) |
$\text{C}7\text{H}{14}\text{O}_5$ |
Đường monoglycoside |
| EH8 |
Blumenol C glucoside |
Nhựa kết dính không màu |
5 |
0,35 (He:EA:Ac 2:1:2) |
$\text{C}{19}\text{H}{34}\text{O}_8$ |
Megastigmane glucoside |
| EH10 |
Acid 4,4'-O-bisellagic |
Chất rắn màu trắng |
5 |
0,38 (He:EA:Ax 3:4:1,2) |
Dimer acid ellagic |
Dimeric ellagitannin / Polyphenol |
Chương 4: Kết luận - Đề xuất
- Kết luận: Khóa luận đã xử lý thành công $12\text{ kg}$ nguyên liệu cây Cỏ sữa lá lớn khô thu hái tại Đồng Nai; điều chế dịch chiết ethanol thô ($635\text{ g}$) và phân đoạn ethyl acetate ($335,27\text{ g}$). Bằng các kỹ thuật sắc ký cột silica gel đa cấp, đề tài đã phân lập được 3 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn EA.3. Dựa trên phân tích phổ nghiệm 1D-NMR, 2D-NMR và so sánh dữ liệu với các tài liệu đã xuất bản, tác giả đã làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của: methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside (EH7, $7\text{ mg}$), Blumenol C glucoside (EH8, $5\text{ mg}$) và acid 4,4'-O-bisellagic (EH10, $5\text{ mg}$).
- Đề xuất: Do giới hạn về thời gian nghiên cứu thực nghiệm khóa luận cử nhân, nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc khảo sát một số phân đoạn nhỏ thuộc phân đoạn EA.3. Tác giả kiến nghị trong thời gian tới cần tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của các phân đoạn còn lại thuộc cao ethyl acetate (EA.1, EA.2, EA.4, EA.5) để bổ sung đầy đủ hơn dữ liệu thành phần hóa học của loài Cỏ sữa lá lớn Euphorbia hirta L. tại Việt Nam.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm định lượng rõ ràng:
- Tinh chế và xác định cấu trúc 3 hợp chất tinh khiết có độ tinh khiết cao trên sắc ký lớp mỏng từ phân đoạn cao ethyl acetate của loài Cỏ sữa lá lớn: $7\text{ mg}$ methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside (EH7), $5\text{ mg}$ Blumenol C glucoside (EH8) và $5\text{ mg}$ acid 4,4'-O-bisellagic (EH10).
- Thiết lập chi tiết quy trình chiết phân đoạn và các hệ dung môi giải ly sắc ký cột silica gel hiệu quả cho từng nhóm chất có độ phân cực khác nhau, đặc biệt là hệ He:EA:Ax, EA:M:W và He:C:M.
- Đóng góp so với các nghiên cứu trước: Đây là công trình thực nghiệm hóa thực vật chi tiết đối với mẫu Cỏ sữa lá lớn thu hái tại khu vực Đồng Nai, bổ sung dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao ($500\text{ MHz}$) và quy kết đầy đủ các tín hiệu carbon - proton của dẫn xuất dimer acid ellagic (acid 4,4'-O-bisellagic) và megastigmane glucoside (Blumenol C glucoside) từ nguồn dược liệu Việt Nam.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Khóa luận chỉ khảo sát sâu trên một phân đoạn nhỏ (EA.3.4) của phân đoạn trung gian EA.3 ($50,811\text{ g}$), trong khi các phân đoạn lớn khác của cao ethyl acetate như EA.1 ($2,305\text{ g}$), EA.2 ($35,464\text{ g}$), EA.4 ($103,401\text{ g}$) và EA.5 ($20,011\text{ g}$) vẫn chưa được khảo sát do giới hạn về mặt thời gian thực hiện. Nghiên cứu cũng chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (kháng khuẩn, ức chế enzyme hoặc gây độc tế bào) trên các hợp chất tinh khiết thu được để kiểm chứng lại các hoạt tính dân gian.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Tác giả đề xuất tiếp tục triển khai sắc ký cột phân lập thành phần hóa học trên các phân đoạn cao ethyl acetate còn lại; kết hợp kiểm tra hoạt tính sinh học của các chất phân lập được để định hướng ứng dụng thực tế.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận này hữu ích cho các nhóm đối tượng học thuật sau:
- Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Hóa học Hữu cơ, Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Dược học và Công nghệ Hóa học làm việc trong lĩnh vực chiết xuất, phân lập hợp chất tự nhiên.
- Người nghiên cứu về họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) nói chung và loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) nói riêng có thể tham khảo quy trình phân tách cột silica gel, các tỷ lệ pha động giải ly phân cực cao và số liệu đối chiếu phổ NMR thực nghiệm ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC) của các khung cấu trúc rhamnopyranoside, megastigmane và ellagitannin.
Câu hỏi thường gặp
-
Khối lượng mẫu thực vật ban đầu và lượng cao ethyl acetate thu được trong khóa luận là bao nhiêu?
Nghiên cứu sử dụng $12\text{ kg}$ mẫu cây Cỏ sữa lá lớn phơi khô thu hái tại tỉnh Đồng Nai năm 2013. Sau khi ngâm chiết với ethanol $96^\circ$ và cô quay chân không, thu được $635\text{ g}$ cao thô. Quá trình chiết lỏng - lỏng phân bố cao thô bằng dung môi hữu cơ thu được $60,4\text{ g}$ cao ete dầu hỏa và $335,27\text{ g}$ cao ethyl acetate.
-
Khóa luận đã phân lập và xác định thành công cấu trúc hóa học của những hợp chất nào?
Đề tài đã phân lập và xác định được cấu trúc của 3 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn EA.3 của cao ethyl acetate:
- Hợp chất EH7 ($7\text{ mg}$): methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside (dạng bột không màu).
- Hợp chất EH8 ($5\text{ mg}$): Blumenol C glucoside (dạng nhựa dính không màu).
- Hợp chất EH10 ($5\text{ mg}$): acid 4,4'-O-bisellagic (chất rắn màu trắng).
-
Cấu trúc của hợp chất EH7 được quy kết dựa trên những tín hiệu phổ NMR then chốt nào?
EH7 được xác định là methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside nhờ tín hiệu proton anomer tại $\delta_{\text{H}} 4,24\text{ ppm}$ ($1\text{H}$, br s, H-1), tín hiệu methyl tại $\delta_{\text{H}} 1,17\text{ ppm}$ ($3\text{H}$, d, $J = 5,5\text{ Hz}$, H-6), nhóm methoxy tại $\delta_{\text{H}} 3,34\text{ ppm}$ ($3\text{H}$, s, $\text{OCH}3$) và carbon tương ứng tại $\delta{\text{C}} 55,7\text{ ppm}$. Tương quan trên phổ HMBC giữa proton anomer H-1 ($\delta_{\text{H}} 4,24$) với carbon $\text{OCH}3$ ($\delta{\text{C}} 55,7$) chứng minh nhóm methoxy gắn trực tiếp vào carbon C-1 ($\delta_{\text{C}} 101,3$) của vòng rhamnopyranose.
-
Dữ liệu nào trên phổ 2D-NMR khẳng định vị trí liên kết giữa phần aglycone và phần đường của hợp chất EH8?
Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ của EH8 xác định một aglycone 13 carbon khung megastigmane và một phân tử đường $\beta$-D-glucopyranoside (proton anomer tại $\delta_{\text{H}} 4,15\text{ ppm}$, d, $J = 8,0\text{ Hz}$, H-1'). Tương quan trên phổ HMBC giữa proton anomer H-1' ($\delta_{\text{H}} 4,15$) của gốc đường với carbon C-9 ($\delta_{\text{C}} 74,7\text{ ppm}$) của khung megastigmane khẳng định mạch đường liên kết glycoside qua nguyên tử oxy tại vị trí C-9.
-
Tại sao tác giả kết luận hợp chất EH10 là acid 4,4'-O-bisellagic thay vì acid ellagic dạng đơn phân tử?
Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ phối hợp HSQC của EH10 cho thấy sự hiện diện của 14 tín hiệu carbon (gồm 12 carbon bậc bốn và 2 carbon nhóm $\text{CH}$ thơm tại $\delta_{\text{C}} 110,6$ và $111,8\text{ ppm}$), gấp đôi số tín hiệu carbon thông thường của khung monomer acid ellagic. Đồng thời, sự xuất hiện của hai tín hiệu carbonyl lactone khác nhau tại $\delta_{\text{C}} 160,5\text{ ppm}$ và $159,0\text{ ppm}$ cùng các tương quan trên phổ HMBC cho phép xác định EH10 là phân tử dimer liên kết qua cầu nối ete 4,4' giữa hai khung acid ellagic.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Vũ Hải My đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học phân đoạn cao ethyl acetate của cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại tỉnh Đồng Nai. Thông qua kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp sắc ký lớp mỏng, tác giả đã cô lập thành công 3 hợp chất tinh khiết là methyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside ($7\text{ mg}$), Blumenol C glucoside ($5\text{ mg}$) và acid 4,4'-O-bisellagic ($5\text{ mg}$). Toàn bộ cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ và quy kết đầy đủ dựa trên hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR và 2D-NMR hiện đại. Dữ liệu thực nghiệm thu được đóng góp dẫn liệu khoa học tin cậy cho công tác nghiên cứu hóa thực vật và định hướng khai thác nguồn dược liệu thiên nhiên tại Việt Nam.
