CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cells – MSCs) 1. Giới thiệu chung về tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô (MSCs) là tế bào gốc trưởng thành đa năng, được phân lập từ các mô trưởng thành, có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tủy xương, sụn và mỡ. MSCs lần đầu được miêu tả bởi Friedenstein và các cộng sự vào năm 1970 [16], là các tế bào tồn tại trong tủy xương, chiếm tỉ lệ nhỏ so với quần thể tế bào gốc tạo máu.
Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (International Society for Cellular Therapy - ISCT) đã xem xét tiêu chí tối thiểu đối với định nghĩa tế bào gốc đa năng MSCs ở người bao gồm: i. Các tế bào bám dính trên bề mặt nuôi cấy bằng nhựa ii. Các tế bào có hình thái giống nguyên bào sợi khi được duy trì trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn, có thể biệt hóa dưới một kích thích nhất định thành nguyên bào xương, mỡ, sụn hay cơ. Biểu hiện các kháng nguyên bề mặt Positive (> 95%) Negative (< 2%) CD105 CD45 CD73 CD34 CD90 CD14/11b CD79α/CD19 HLA-DR ❖ Khả năng biệt hóa Biệt hóa là quá trình chuyển dạng của tế bào, từ tế bào gốc thành dạng tế bào chuyên hóa hơn.
Những sự biến đổi này khởi nguồn từ sự thay đổi điều hòa biểu hiện gene, bao gồm các quá trình như sự methyl hóa, sự tương tác của các yếu tố điều hòa phiên mã hay hoạt động của các miRNA. Tế bào gốc trung mô là một loại tế bào gốc đa năng, vì vậy chúng đặc trưng bởi khả năng biệt hóa đa dòng. Ngoài tiềm năng biệt hóa thành các dòng tế bào trung mô thông thường như xương, sụn, mỡ [15]…, MSCs còn cho thấy khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào biểu mô và tế bào nội mô như tế bào thần kinh [33], tế bào tim [20]. Chính các tiềm năng biệt hóa rất lớn này đã mở ra những 3 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học hướng nghiên cứu triển vọng khi sử dụng tế bào gốc trung mô trong cấy ghép để điều trị bệnh.
❖ Khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học Sự tiết paracrine của MSCs được xác định đầu tiên bởi Haynesworth và cộng sự [22]. Nhóm tác giả báo cáo rằng MSCs sản xuất và giải phóng một lượng lớn các yếu tố tăng trưởng, chemokine và cytokine có khả năng tác động đến các tế bào lân cận. Trong thực tế, những yếu tố tiết này có khả năng làm tăng sự hình thành mạch, giảm apoptosis và xơ hóa, tăng cường sự sống và biệt hóa tế bào thần kinh, kích thích tái tạo ma trận ngoại bào, hạn chế viêm cục bộ và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch [29]. Theo cách này, MSCs trực tiếp hoặc thông qua bài tiết paracrine kích thích sự tái tạo các tế bào bị thương, giảm tổn thương mô và cuối cùng tăng tốc sửa chữa cơ quan.
Ngoài ra, các phân tử tiết ra bởi MSCs có vai trò như chất trung gian kích hoạt các tế bào đích hoặc kích thích các tế bào lân cận để tiết ra các yếu tố hoạt động [6]. Gần đây, bằng chứng cho thấy MSCs tiết ra nhiều túi ngoại bào (EVs) tham gia tái tạo mô thông qua chuyển thông tin đến tế bào hoặc mô hư hỏng và hoạt động sinh học tương tự như MSCs [47]. Nguồn phân lập và tiềm năng ứng dụng của MSCs Kể từ báo cáo đầu tiên về sự phân lập MSCs từ tủy xương chuột của Friedenstein và cộng sự, nhiều cơ quan và mô đã được báo cáo trở thành nguồn phân lập MSCs như máu cuống rốn, dây rốn, mô mỡ, màng ối, tủy răng [42]… Mặc dù chúng có một số điểm tương đồng về hình thái, tiềm năng biệt hóa và mô hình miễn dịch theo các tiêu chí tối thiểu cho định nghĩa MSCs của ICST 2006, vẫn có sự khác biệt về số lượng tế bào, tốc độ tăng trưởng, tần số tạo cụm, khả năng ức chế miễn dịch và biểu hiện gen. Bảng 1: So sánh tế bào gốc trung mô (MSC) từ các nguồn tủy xương (BM), mô mỡ (AD), dây rốn (UC) tổng hợp từ các tài liệu [28, 38] BM- MSC AD-MSC UC-MSC Đặc điểm Ghi chú (tủy sương) (mô mỡ) (dây rốn) Không xâm Phương pháp phân lập Xâm lấn Xâm lấn lấn * ** *** Sự lão hóa của tế bào (3-4 passage) (7-8 passage) 10 (passage) 1: 25000 - 1: 1:333- Tần số tế bào nhân bản / 100000 1:1609 4 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Khả * ** *** Theo các năng ** * *** tài liệu tăng tham khảo * ** ** sinh khác nhau Thành xương * ** *** (osteogenetic) Khả * *** ** Theo các năng Thành mỡ ** *** * tài liệu biệt (adipogenetic) tham khảo ** / * hóa khác nhau Thành sụn ** / / (chondrogenic) CD73, CD90, CD105 (marker + + + trung mô) CD44 (Matrix + + + marker) CD14, CD133, CD45, CD34 - - - (Marker tế bào dòng tạo máu) CD31 (Marker - - - tế bào nội mô) HLA-DR - - - Miễn CD11b, dịch CD79α, CD19 (Marker các - - - dòng tế bào máu) CD29, CD51 (Integrin / + + marker) Oct-4, Nanog, Sox-2 (Yếu tố + + + phiên mã TBG phôi (ESC)) CD106 ** + * HLA-G * / ** Càng nhiều dấu * biểu hiện mức độ càng cao, “-” biểu diễn sự không biểu hiện, “+” biểu diễn sự có biểu hiện, “/” biểu diễn chưa được báo cáo trước đó.
5 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Nguồn phân lập MSCs có thể ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Ví dụ cấy ghép AD-MSCs cải thiện sự hình thành mạch, tái tạo sợi trục và phục hồi chức năng tốt hơn so với BM-MSCs. Bên cạnh đó, AD-MSCs gây ra các yếu tố thần kinh cao như BDNF, VEGF và HGF [66]. Do sự khác nhau giữa các tế bào gốc trung mô có nguồn gốc mô khác nhau mà thể tiết ngoại bào (exosomes) của nó cũng có những điểm khác nhau, vì vậy có những tác động khác nhau trong điều trị và cần được đánh giá.
MSCs đóng nhiều vai trò khác nhau làm cho chúng có khả năng ứng dụng lâm sàng. Chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng và có thể tham gia vào liệu pháp thay thế tế bào. MSCs sản xuất nhiều cytokine và các yếu tố tăng trưởng ảnh hưởng đến các tế bào khác, làm giảm viêm, tăng sinh tế bào tiền thân, cải thiện mô và cải thiện nhiễm trùng [45]. Với tiềm năng biệt hóa và khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học, MSCs ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong lâm sàng điều trị bệnh.
Bằng chứng mới đây đã cho thấy rằng các liệu pháp tế bào gốc là một chiến lược đầy hứa hẹn để cải thiện sự tái tạo ở các mô bị tổn thương như tim, não, tủy sống, gan [11]. MSCs sở hữu những lợi thế đặc biệt như biệt hóa đa dòng với các hiệu ứng miễn dịch và điều trị miễn dịch làm cho chúng như là một liệu pháp hiệu quả an toàn trong lâm sàng. Ngoài ra, hoạt động paracrine có thể giải thích khả năng tái tạo của MSCs và một thành phần chiếm ưu thế là các túi ngoại bào (EVs) có vai trò quan trọng trong tiềm năng trị liệu của chúng. Liệu pháp EVs có nguồn gốc từ MSCs cho thấy một liệu pháp đầy triển vọng khi không có tế bào phù hợp trong y học tái tạo.
Hình 1: Vai trò của MSCs [45] 6 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học 1. Giới thiệu về exosomes Exosome lần đầu tiên được phát hiện bởi Pan, Johnstone [43] và Harding, Stahl [21] vào năm 1983 khi cả hai nhóm đều đang nghiên cứu về thụ thể transferrin của hồng cầu lưới (tế bào hồng cầu chưa trưởng thành) [tương ứng ở cừu (Pan và Johnstone 1983) và chuột (Harding và Stahl 1983)] trong quá trình trưởng thành in vitro. Thuật ngữ “exosome” được đặt ra vào năm 1987 bởi Johnstone và cộng sự. Tuy nhiên, có nhiều loại túi ngoại bào khác nhau có thành phần, mật độ và kích thước khác nhau.
Do thiếu các markers đặc hiệu cho các loại túi ngoại bào khác nhau, Hiệp hội túi ngoại bào quốc tế (International Society of Extracellular Vesicles – ISEV) đã gợi ý thuật ngữ túi ngoại bào (Extracellular Vesicles - EVs) để mô tả các túi ngoại bào từ dịch cơ thể và tế bào nuôi cấy. EVs là túi ngoại bào được bao bọc bởi màng lipid kép, có hình cầu hoặc hình cốc, giải phóng bởi nhiều loại tế bào vào môi trường vi mô ngoại bào. EVs được tìm thấy trong các chất lỏng cơ thể như nước bọt, huyết tương, sữa mẹ, nước ối, nước tiểu và trong môi trường nuôi cấy tế bào [29]. Theo một số đặc điểm như thành phần, kích thước EVs được phân thành các phân nhóm khác nhau, nhưng phổ biến bao gồm exosomes (đường kính 30 - 250 nm), microvesicles (ectosome) (đường kính 100 - 1000 nm) và apoptotic bodies (đường kính 1000 - 5000 nm).
EXs bắt đầu bằng các endosome sớm, nơi các túi nội tiết kết hợp để tái chế hoặc xuất bào. Các endosome sớm sau đó được chuyển thành endosome muộn hay thể đa bào (multivescicular body - MVB) trong đó các chất được sắp xếp thành các túi có đường kính 30 - 250 nm được gọi là intralumenal vesicles (ILV). Các endosome muộn hoặc hợp nhất với lysosome để phá hủy các chất trong nó hoặc hợp nhất với màng plasma dẫn đến sự bài tiết của các túi ILV vào môi trường ngoại bào khi đó các túi này được gọi là “exosomes” [1]. Thành phần của exsosomes EXs là hạt nano sinh học đóng vai trò quan trọng như tín hiệu cận tiết (paracrine) và nội tiết (endocrine) trong tương tác tế bào.
Các thành phần mà EXs chứa phụ thuộc vào nguồn tế bào. EXs có nguồn gốc từ endosome mang theo protein vận chuyển màng, protein tham gia vào thể đa bào (multivescicular body - MVB) (Alix, TSG101), protein dung hợp bao gồm GTPase, Annexins, flotillin và protein rab, có thể thúc đẩy sự hợp 7 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học nhất của MVB với màng tế bào. EXs cũng được biết là chứa tetraspannin (protein xuyên màng) (CD9, CD63, CD81 và CD82), các phân tử bám dính (CD11b và CD54) và protein sốc nhiệt (Hsp70 và Hsp90; chỉ định phản ứng của tế bào với các căng thẳng môi trường). EXs cũng mang các protein liên quan đến lipid bao gồm cholesterol, sprialomyelin và ganglioside GM3 và biểu hiện phosphatidylserine (một photpholipid là thành phần của màng tế bào).