Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn ET20 của cao methanol điều chế từ rễ cây dương đầu (Olax imbrica Roxb.)

Khóa luận khảo sát thành phần hoá học phân đoạn Et20 từ rễ cây dương đầu tại Trường ĐH SPKT TP.HCM

• Tác giả: Trịnh Thị Thuỷ
• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Ngà
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
• Đề tài: Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn ET20 của cao methanol điều chế từ rễ cây dương đầu (Olax imbrica Roxb.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan phân đoạn Et20 cao methanol rễ cây dương đầu Phú Yên

Rễ cây dương đầu (Olax imbricata Roxb.) tại vùng đất cát Phú Yên là nguồn dược liệu tự nhiên phong phú. Chiết xuất rễ cây mang lại nguồn hợp chất thứ cấp đa dạng. Quá trình chiết hồi lưu với ethanol tạo ra lượng lớn cao thô ban đầu. Cao thô tiếp tục được phân tách thành các phân đoạn n-hexane và methanol. Trong đó, cao methanol chứa các hợp chất phân cực cao. Nhóm nghiên cứu sử dụng sắc ký cột Diaion HP-20 để phân chia cao methanol thành nhiều phân đoạn nhỏ. Phân đoạn rửa giải bằng ethanol 20% trong nước được ký hiệu là Et20. Phân đoạn Et20 đóng vai trò bản lề trong khảo sát hóa thực vật rễ cây dương đầu. Hợp phần này tập trung nhiều glycoside và dẫn xuất có hoạt tính sinh học đặc thù. Khảo sát phân đoạn Et20 mở ra hướng tiếp cận mới trong việc định danh các hợp chất hữu cơ tự nhiên. Dược liệu Phú Yên cung cấp mẫu thực vật đạt độ chuẩn xác sinh học cao. Việc tìm hiểu thành phần hóa học phân đoạn Et20 giúp làm sáng tỏ giá trị dân gian của loài cây này. Đây là tiền đề khoa học vững chắc cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo.

1.1. Đặc điểm dược liệu rễ cây dương đầu Olax imbricata

Cây dương đầu có tên khoa học là Olax imbricata Roxb., thuộc họ Olacaceae. Loài thực vật thân gỗ leo này phân bố phổ biến tại các vùng rừng thứ sinh và đồi cát duyên hải miền Trung, đặc biệt là tỉnh Phú Yên. Bộ phận rễ cây thường tích lũy các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đa dạng. Trong y học cổ truyền, rễ dương đầu được dùng làm thuốc chữa đau nhức, giải độc và kháng viêm. Mẫu nghiên cứu được thu hái trực tiếp tại Phú Yên nhằm đảm bảo độ tươi và hàm lượng hoạt chất tối ưu. Rễ sau khi thu hái được rửa sạch, thái nhỏ và sấy khô trước khi chiết xuất. Nguồn nguyên liệu chuẩn hóa giúp đảm bảo tính lặp lại cho các thử nghiệm hóa học phân tích.

1.2. Nguồn gốc hình thành phân đoạn Et20 từ cao methanol

Quá trình điều chế phân đoạn Et20 bắt đầu từ bột rễ cây khô được chiết hồi lưu với dung môi ethanol. Sau khi cô quay đuổi dung môi, nghiên cứu thu được cao thô ethanol toàn phần. Cao thô tiếp tục phân bố lỏng - lỏng với n-hexane nhằm loại bỏ tạp béo và chất kém phân cực. Phần cắn không tan được chiết tiếp bằng methanol để tạo thành cao methanol giàu glycoside. Lượng cao methanol này được nạp vào cột sắc ký hạt nhựa Diaion HP-20. Cột được rửa giải bằng các tỷ lệ ethanol trong nước tăng dần từ 0% đến 100%. Phân đoạn rửa giải tại nồng độ ethanol 20% trong nước được ký hiệu là Et20. Mẫu phân đoạn này tập trung các hợp chất tự nhiên phân cực cao giàu tiềm năng ứng dụng.

II. Phân tích phân đoạn Et20 cao methanol rễ cây dương đầu Phú Yên

Phân đoạn Et20 chứa hỗn hợp phức tạp của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp. Việc phân tích thành phần đối diện với nhiều rào cản kỹ thuật. Độ phân cực cao của các chất dẫn đến hiện tượng lưu giữ chặt trên pha tĩnh silica gel thông thường. Các vết sắc ký bản mỏng thường bị kéo vệt dài và khó tách rời hoàn toàn. Ngoài ra, sự chồng chập tín hiệu phổ gây khó khăn lớn cho việc xác định cấu trúc đơn chất. Mẫu phân đoạn Et20 tiếp tục được phân tách qua sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi methanol - nước. Tại nồng độ methanol 40%, một phân đoạn con quan trọng xuất hiện và được ký hiệu là OM-Et20-Me40-P1 với khối lượng 13,2 mg. Phân đoạn này thể hiện một mũi hấp thu chính kèm hai mũi tạp nhỏ liền kề trên sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hiện tượng đồng rửa giải giữa các thành phần tương đồng cấu trúc đòi hỏi phải thiết lập điều kiện tinh chế chuyên biệt. Khảo sát sắc ký đồ UV-PDA chứng minh sự tồn tại của hợp chất mục tiêu mang khung phân tử đặc biệt. Việc phân tích chi tiết phân đoạn này là bước đi cốt lõi để khám phá hoạt chất mới.

2.1. Thách thức phân tách các hợp chất phân cực cao

Các hợp chất tự nhiên trong phân đoạn Et20 chủ yếu là glycoside phân cực mạnh. Khi chạy sắc ký pha thuận silica gel cổ điển, các chất này liên kết rất chặt với nhóm silanol tự do. Hiện tượng này dẫn tới đuôi peak kéo dài và hiệu suất tách chiết kém. Thêm vào đó, dịch chiết rễ chứa nhiều hợp chất có cấu trúc tương đồng. Sự xuất hiện của các đồng phân lập thể khiến các peak sắc ký chèn ép lẫn nhau. Phương pháp sắc ký cột thông thường không đủ độ phân giải để thu hồi hợp chất tinh khiết. Do đó, nghiên cứu đòi hỏi phải chuyển đổi sang hệ thống sắc ký pha đảo RP-18 nhằm cải thiện khả năng chọn lọc và tách đỉnh rõ nét.

2.2. Khảo sát đặc tính phân đoạn con OM Et20 Me40 P1

Phân đoạn con OM-Et20-Me40-P1 được cô lập tại thời gian lưu tR từ 32,2 phút đến 36,2 phút trên cột pha đảo. Nồng độ dung môi tương ứng ghi nhận trong khoảng 41% đến 42% methanol. Sau khi thu gom và làm bay hơi dung môi, nghiên cứu thu được 13,2 mg mẫu rắn. Kiểm tra trên hệ thống HPLC đầu dò UV-PDA cho thấy sự xuất hiện của mũi chất mục tiêu vượt trội. Tuy nhiên, sát chân peak chính vẫn tồn tại hai peak tạp chất nhỏ bám dính liền kề. Điều này phản ánh sự tương đồng về độ phân cực giữa các cấu tử. Việc tinh chế hợp chất chính đòi hỏi điều chỉnh pha động tối ưu để đạt độ tinh khiết phục vụ phân tích phổ cấu trúc.

III. Phương pháp tách Et20 cao methanol rễ cây dương đầu Phú Yên

Quy trình tinh chế hợp chất TT1 từ phân đoạn Et20 áp dụng kỹ thuật sắc ký điều chế hiện đại. Mẫu OM-Et20-Me40-P1 được hòa tan hoàn toàn bằng hệ dung môi tối thiểu trước khi bơm vào hệ thống. Dung dịch được lọc kỹ qua màng PTFE kích thước 0,22 micromet nhằm bảo vệ cột. Hệ thống sử dụng cột sắc ký Silica gel RP-18 kích thước 250 x 20 mm với kích thước hạt 9 micromet. Pha động đẳng dòng được lựa chọn gồm acetonitrile và nước theo tỷ lệ thể tích 15:85, bổ sung 0,1% acid formic. Acid formic đóng vai trò chất ức chế hiện tượng phân ly và cải thiện đối xứng mũi sắc ký. Tốc độ dòng được cài đặt cố định tại mức 7 mL/phút với thể tích tiêm mẫu 2,5 mL mỗi mẻ. Đầu dò tử ngoại UV được thiết lập đồng thời tại hai bước sóng 203 nm và 254 nm để giám sát độ hấp thụ quang học. Áp suất vận hành duy trì dưới ngưỡng giới hạn 4000 psi nhằm đảm bảo tính ổn định của thiết bị. Quy trình tiêm mẫu lặp lại ba lần liên tiếp để thu thập đủ lượng hợp chất tinh khiết TT1 phục vụ giải mã cấu trúc phân tử.

3.1. Kỹ thuật sắc ký điều chế HPLC pha đảo RP 18

Kỹ thuật sắc ký điều chế RP-18 đóng vai trò then chốt trong việc phân lập thành công hợp chất tinh khiết TT1. Thiết bị sử dụng cột bán điều chế BUCHI kích thước lớn 250 x 20 mm, nhồi hạt silica gel C18 kích thước 9 micromet. Hệ dung môi pha động gồm acetonitrile và nước pha trộn theo tỷ lệ thể tích chuẩn 15:85. Việc bổ sung 0,1% acid formic giúp ion hóa các tâm bazơ và ức chế sự phân ly của nhóm phenolic hydroxyl. Nhờ đó, hình dạng peak sắc ký trở nên sắc nét và giảm thiểu tối đa hiện tượng đuôi gai. Quá trình chạy đẳng dòng diễn ra trong 60 phút ở tốc độ dòng 7 mL/phút giúp tách rời hoàn toàn mũi chất chính ra khỏi hai tạp chất bám liền kề.

3.2. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc hợp chất TT1

Sau khi tinh sạch hợp chất TT1, cấu trúc phân tử được xác định toàn diện thông qua tổ hợp các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hiện đại. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR cung cấp số lượng proton và carbon trong khung phân tử. Phổ tương tác proton - proton hai chiều 1H-1H COSY giúp xác định các hệ thống spin kế cận. Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết 1H-13C HSQC cho biết liên kết trực tiếp giữa từng proton với carbon tương ứng. Tiếp đó, phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết 1H-13C HMBC làm sáng tỏ sự kết nối giữa các phân mảnh dị vòng và mạch đường. Kết hợp cùng khối phổ phân giải cao LC-MS/MS, nghiên cứu khẳng định chính xác hợp chất TT1 là một sesquiterpenoid tropolone glycoside mới chưa từng công bố trước đây.

IV. Kết luận phân đoạn Et20 cao methanol rễ cây dương đầu Phú Yên

Khảo sát hóa học phân đoạn Et20 từ cao methanol rễ cây dương đầu Phú Yên mang lại kết quả khoa học nổi bật. Đề tài đã tinh sạch và nhận danh thành công hợp chất tự nhiên TT1. Hợp chất TT1 được xác định là một sesquiterpenoid tropolone glycoside mới trong tự nhiên. Sự hiện diện của khung tropolone liên kết phân tử đường tạo ra cấu trúc hóa học độc đáo và quý hiếm. Khám phá này đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng vào kho tàng hóa thực vật của chi Olax và họ Olacaceae. Kết quả khẳng định giá trị nguồn tài nguyên dược liệu bản địa tại tỉnh Phú Yên. Về mặt ứng dụng, các hợp chất thuộc nhóm tropolone glycoside thể hiện nhiều hoạt tính sinh học triển vọng như kháng khuẩn, kháng viêm và gây độc tế bào ung thư. Dữ liệu từ nghiên cứu này mở đường cho việc phát triển các chế phẩm dược dụng có nguồn gốc từ thiên nhiên. Đây là cơ sở thực tiễn để nâng cao giá trị khai thác và bảo tồn nguồn cây thuốc quý tại Việt Nam.

4.1. Đóng góp học thuật của hợp chất mới TT1

Việc tìm thấy hợp chất sesquiterpenoid tropolone glycoside mới TT1 là một phát hiện học thuật có ý nghĩa lớn. Cấu trúc lai giữa khung sesquiterpenoid mang vòng bảy cạnh tropolone với phân tử đường là dạng hiếm thấy trong tự nhiên. Công trình bổ sung thông tin khoa học quý báu về sự đa dạng hóa học của loài Olax imbricata Roxb. Kết quả này chứng minh tiềm năng chưa khai phá hết của các loài thực vật họ Olacaceae tại Việt Nam. Dữ liệu phổ chi tiết bao gồm 1D, 2D NMR và LC-MS/MS cung cấp nguồn tham chiếu chuẩn mực cho các nhà nghiên cứu hóa tự nhiên trên thế giới. Đây là minh chứng rõ nét cho năng lực nghiên cứu phân lập và giải cấu trúc hợp chất thiên nhiên chuyên sâu.

4.2. Tiềm năng ứng dụng sinh học và hướng phát triển

Nhóm hợp chất tropolone sở hữu cấu trúc vòng bảy cạnh thơm phi benzen có khả năng tạo phức kim loại bền vững. Đặc tính này mang lại hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế enzyme mạnh mẽ. Sự gắn kết giữa khung sesquiterpenoid và đường glycoside trong hợp chất TT1 giúp cải thiện khả năng hòa tan cùng sinh khả dụng. Trong tương lai, các thử nghiệm sinh học in vitro và in vivo cần được thực hiện để đánh giá tác dụng kháng viêm và ức chế tế bào khối u. Ngoài ra, việc hoàn thiện quy trình tách chiết từ rễ cây dương đầu Phú Yên sẽ mở đường cho ứng dụng thực tiễn. Nghiên cứu mang lại tiềm năng phát triển dược phẩm mới từ thảo dược bản địa.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chi Olax thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) gồm khoảng 40 loài phân bố chủ yếu tại các khu vực rừng nhiệt đới và xavan ở châu Á và châu Phi. Tại Việt Nam, loài dương đầu Olax imbricata Roxb. (còn gọi là dương đầu kết lợp, cây cát lộ, dây mao trật) lần đầu tiên được ghi nhận tại vùng núi Đakrông thuộc tỉnh Quảng Trị, sau đó được tìm thấy rải rác ở Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng và Phú Yên. Trong y học dân gian, các bộ phận của cây dương đầu thường được nhân dân sử dụng làm dược liệu điều trị một số chứng bệnh. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu khoa học chuyên sâu về thành phần hóa thực vật và tác dụng dược lý của loài này tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Phần lớn các tài liệu quốc tế tập trung vào các loài khác cùng chi như Olax dissitiflora, Olax andronensis, Olax mannii, Olax nana, hoặc Olax psittacorum. Nhằm thiết lập luận cứ khoa học cho việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên bản địa, tác giả Trịnh Thị Thủy đã thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp: "Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn ET20 của cao methanol điều chế từ rễ cây dương đầu (Olax imbricata Roxb.)" dưới sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Ngà tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai nội dung:

1. Khảo sát thành phần hoá học của chiết xuất n-hexane từ rễ cây dương đầu bằng kỹ thuật phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
2. Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc hoá học của hợp chất tinh khiết phân lập được từ phân đoạn OM-Et20 thuộc cao methanol (MeOH).

Đối tượng nghiên cứu là cao chiết n-hexane và cao chiết MeOH được điều chế từ rễ cây dương đầu (Olax imbricata Roxb.). Phạm vi nghiên cứu về mặt không gian tập trung vào nguồn mẫu rễ cây thu hái tại thị xã Đông Hòa, tỉnh Phú Yên; mẫu được nhận danh thực vật bởi chuyên gia từ Công ty nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung và lưu trữ tiêu bản với mã số UTE-A002 tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh. Về mặt thời gian, mẫu thực vật được thu thập vào tháng 8 năm 2020 và các nội dung thực nghiệm phân lập, đo phổ được hoàn thành vào tháng 8 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên hệ thống phân loại học thực vật và các công bố hóa thực vật về các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp thuộc chi Olax, bao gồm:

• Phân loại thực vật học: Cây dương đầu thuộc giới Plantae, lớp Magnoliopsida, bộ Santalales, họ Olacaceae, chi Olax, loài Olax imbricata Roxb.
• Khung lý thuyết thành phần hóa học: Tổng quan các nhóm hợp chất tự nhiên đặc trưng đã được phân lập từ chi Olax gồm nhóm acid béo acetylenic (santalbic acid, exocarpic acid, octadec-9,11-diynoic acid, (E)-henicos-7-en-9-ynoic acid); nhóm triterpenoid và saponin triterpenoid (olaxoside, glutinol, rhoiptelenol, các dẫn xuất oleanolic acid); nhóm sesquiterpenoid tropolone ngưng tụ; nhóm flavonoid glycoside (các dẫn xuất kaempferol, quercetin, morin); nhóm hợp chất phenolic glycosidic (leonuriside A) và các hợp chất chứa nitrogen (S-ethenylcysteine, methyl salicylate, (Z)-docos-13-enamide).

Hệ thống phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và trang thiết bị được tác giả triển khai bao gồm:

• Phương pháp chiết xuất: Chiết hồi lưu bột rễ cây bằng dung môi ethanol (EtOH) 96°, sau đó phân đoạn lỏng-lỏng bằng n-hexane và MeOH dưới áp suất giảm trên hệ thống cô quay chân không.
• Phương pháp phân tích acid béo: Chuyển hóa acid béo thành dẫn xuất methyl ester (FAME) theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC 996.06 (Association of Official Analytical Chemists) và phân tích định tính, định lượng bằng hệ thống GC-MS.
• Phương pháp sắc ký tách phân đoạn và tinh chế:
  • Sắc ký cột (SKC) hấp phụ pha đảo với chất nhồi là hạt nhựa Diaion HP-20 (kích thước hạt 0,6 – 0,8 mm, Mitsubishi, Nhật Bản).
  • Sắc ký cột nhanh hút chân không (VLC) sử dụng pha tĩnh silica gel pha đảo LiChroprep RP-18 (kích thước hạt 0,040 – 0,063 mm, Merck, Đức).
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích (HPLC/UV-PDA) trên hệ thống Jasco (Nhật Bản) sử dụng cột phân tích RP-18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) để khảo sát thành phần pha động và thời gian lưu.
  • Sắc ký điều chế (SKĐC) trên hệ thống Pure C-835 Prep Advance (Buchi, Thụy Sĩ) tích hợp đầu dò UV và ELSD, sử dụng cột điều chế RP-18 (250 × 20 mm, 9 µm) để phân tách và tinh sạch hợp chất.
• Phương pháp xác định cấu trúc phân tử: Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR: 1H-NMR, 13C-NMR), phổ hai chiều (2D-NMR: 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) kết hợp với sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập trực tiếp tại Phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ và Phòng thí nghiệm Công nghệ cao thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh; dữ liệu GC-MS được đo tại Trung tâm phân tích kỹ thuật cao Sài Gòn; dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo tại Phòng NMR thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này cung cấp hệ thống dữ liệu toàn diện về cây dương đầu (Olax imbricata Roxb.) và các công trình nghiên cứu liên quan đến chi Olax. Tác giả mô tả đặc điểm hình thái thực vật của loài: cây bụi đứng thường xanh, thân gỗ cao từ 2 đến 6 m, cành non màu xám, thân màu nâu; lá dai hình trứng hoặc elip thuôn dài (7 – 10 cm), không lông; hoa mọc thành chùm nhỏ màu trắng hoặc hơi vàng (dài 1,5 – 2,5 cm) ra hoa từ tháng 4 đến tháng 10; quả hạch hình cầu hoặc trứng ngược bao bọc bởi đài hoa.

Phần tổng quan hóa học phân loại chi tiết các nghiên cứu trước đây theo từng nhóm hợp chất:

• Nhóm chất béo: Phân lập ba acid béo từ Olax dissitiflora (Mavundza et al., 2016); ba hợp chất béo acetylenic lần đầu được phân lập từ rễ O. imbricata gồm (E)-henicos-7-en-9-ynoic acid, (E)-henicos-7-en-9-ynoylglycerol và 7,8,9,10-tetrahydroxyhexadeca-4,10-diynoic acid (Vo Thi Nga et al., 2018).
• Nhóm terpenoid và saponin: Triterpenoid saponin olaxoside từ Olax andronensis có tác dụng kháng viêm và nhuận tràng (Provost, 1981); hợp chất sesquiterpenoid tropolone ngưng tụ từ rễ O. imbricata (Huong T. Nguyen et al., 2019); ba hợp chất triterpenoid glycoside dẫn xuất từ oleanolic acid từ rễ O. imbricata (Vo Thi Nga et al.).
• Nhóm flavonoid và hợp chất phenolic: 17 hợp chất flavonoid glycoside và 2 hợp chất kaempferol triglycoside từ lá cây Olax mannii (Okoye et al.); các phenolic glycoside từ rễ O. imbricata (Huynh et al., 2015, 2018) như leonuriside A; các polyphenol từ lá Olax nana (Ovais et al., 2018).
• Nhóm alkaloid và chứa nitrogen: S-ethenylcysteine từ rễ Olax phyllanthi (Thumfort et al., 1993); (Z)-docos-13-enamide và methyl salicylate từ lá Olax psittacorum (Majumder et al., 2020).
• Hoạt tính sinh học: Tác giả dẫn chứng các thử nghiệm in vitro về hoạt tính kháng oxy hóa (kích hoạt yếu tố Nrf2, giảm nồng độ gốc oxy phản ứng ROS), kháng khuẩn của hạt nano Ag-Cu tổng hợp từ lá Olax scandens, bảo vệ gan chống độc tính CCl4, chống trầm cảm của Olax subscorpioidea, và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ O. imbricata trên các dòng tế bào ung thư người gồm MCF-7 (vú), HepG2 (gan), và LU (phổi) với giá trị IC50 đạt 16,94 µM đối với hợp chất sesquiterpenoid tropolone.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Nội dung chương trình bày chi tiết toàn bộ quy trình xử lý mẫu, điều chế cao và các thông số vận hành kỹ thuật sắc ký:

• Xử lý mẫu và điều chế cao: 50,0 kg rễ tươi sau khi làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60 – 70°C và xay nhỏ thu được 7,0 kg bột rễ khô. Tiến hành ngâm chiết hồi lưu với dung môi EtOH 96°, cô hồi lưu dung môi dưới áp suất giảm thu được 1,5 kg cao thô EtOH. Hòa tan cao EtOH vào n-hexane, thu hồi phần tan được 600,0 g cao n-hexane. Phần bã không tan tiếp tục được hòa tan hoàn toàn trong MeOH, cô quay thu được 750,0 g cao MeOH.
• Phân đoạn trên cột Diaion HP-20: Lấy 200,0 g cao MeOH hòa tan trong nước cất bằng bể siêu âm tạo hỗn dịch đậm đặc, nạp lên cột sắc ký hạt nhựa Diaion HP-20 pha đảo. Tiến hành giải ly với hệ dung môi có độ phân cực giảm dần EtOH-H2O theo tỷ lệ: 20% EtOH (OM-Et20), 40% EtOH (OM-Et40), 60% EtOH (OM-Et60), 80% EtOH (OM-Et80), 96% EtOH (OM-Et96) và xả cột bằng acetone. Thu được 54,30 g phân đoạn OM-Et20.
• Phân đoạn sắc ký cột chân không (VLC) silica gel RP-18: Lấy 50,0 g mẫu OM-Et20 phối trộn với silica gel RP-18 tạo bột khô tơi xốp, nạp vào cột pha đảo RP-18 hút chân không. Giải ly bằng hệ MeOH-H2O với tỷ lệ giảm dần độ phân cực: (2:8), (4:6), (5:5), (6:4), (10:0) và xả bằng acetone. Thu được 5 phân đoạn tương ứng: OM-Et20-Me20, OM-Et20-Me40 (2,75 g), OM-Et20-Me50, OM-Et20-Me60, OM-Et20-Me100. Phân đoạn OM-Et20-Me40 được chọn để tinh chế tiếp.
• Khảo sát HPLC phân tích và điều chế (Prep-HPLC):
  • Khảo sát HPLC/UV-PDA: Cột RP-18 (250 × 4,6 mm, 5 µm), pha động nước (A) và MeOH (B), chạy gradient từ 25% đến 60% B trong 60 phút, tốc độ dòng 1 mL/phút, bước sóng phát hiện 203 và 254 nm. Tác giả phát hiện một mũi sắc ký chính tại thời gian lưu tR = 13,8 phút tại bước sóng 254 nm.
  • Sắc ký điều chế phân đoạn OM-Et20-Me40: Hòa tan 2,75 g mẫu trong 30 mL dung môi MeOH-H2O (30:70), lọc qua màng PTFE 0,22 µm. Cột Prep RP-18 (250 × 20 mm, 9 µm), pha động dung môi A (H2O + 0,1% acid formic) và B (MeOH). Áp suất tối đa 4000 psi, tốc độ dòng 7 mL/phút, tiêm mẫu 2,5 mL/lần (thực hiện lặp lại 14 lần). Chương trình gradient dung môi: cân bằng cột 0 – 15 phút (32% B), rửa giải 0 – 45 phút (32% → 45% B), 45 – 60 phút (45% B). Thu gom peak xuất hiện ở tR = 32,2 – 36,2 phút (ứng với nồng độ MeOH 41 – 42%), thu được 13,2 mg phân đoạn ký hiệu OM-Et20-Me40-P1.
  • Tinh chế hợp chất TT1 (TT01): Mẫu OM-Et20-Me40-P1 (13,2 mg) được hòa tan trong hệ CH3CN-H2O (15:85), lọc qua màng PTFE 0,22 µm. Chạy sắc ký điều chế đẳng dung với hệ dung môi CH3CN-H2O (15:85) có bổ sung 0,1% HCOOH, tốc độ dòng 7 mL/phút, thể tích tiêm 2,5 mL/lần (bơm lặp lại 3 lần) trên cùng cột Prep RP-18 để tách hoàn toàn 2 mũi tạp dính kề, thu được hợp chất sạch ký hiệu TT1.

Thông số vận hành	HPLC phân tích khảo sát	SKĐC phân tách OM-Et20-Me40	SKĐC tinh chế hợp chất TT1
Loại cột	Silica gel RP-18 (250 × 4,6 mm; 5 µm)	Silica gel RP-18 (250 × 20 mm; 9 µm)	Silica gel RP-18 (250 × 20 mm; 9 µm)
Hệ pha động	MeOH - H2O	MeOH - H2O (+ 0,1% HCOOH)	CH3CN - H2O (15:85) (+ 0,1% HCOOH)
Chế độ rửa giải	Gradient 25% → 60% MeOH (60 phút)	Gradient 32% → 45% MeOH (45 phút)	Đẳng dung (Isocratic 15% CH3CN, 60 phút)
Tốc độ dòng	1,0 mL/phút	7,0 mL/phút	7,0 mL/phút
Bước sóng dò	203 nm và 254 nm	203 nm và 254 nm	203 nm và 254 nm
Khối lượng mẫu	Khảo sát vết phân tích	2,75 g (tiêm 2,5 mL × 14 lần)	13,2 mg (tiêm 2,5 mL × 3 lần)
Thời gian lưu peak	tR = 13,8 phút	tR = 32,2 – 36,2 phút	Tinh sạch mũi đơn TT1

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được về thành phần hóa học:

• Phân tích GC-MS chiết xuất hexane: Phân tích định tính và định lượng các hợp chất acid béo sau methyl hóa theo chuẩn AOAC 996.06 cho thấy phổ thành phần các acid béo mạch thẳng no và không no đặc trưng trong rễ cây dương đầu, làm sáng tỏ tiềm năng hóa thực vật của phân đoạn kém phân cực.
• Kết quả phân lập và tinh chế hợp chất: Bằng quy trình kết hợp nhiều giai đoạn sắc ký hấp phụ pha đảo và sắc ký điều chế hai lần (gradient MeOH-H2O và đẳng dung CH3CN-H2O), tác giả đã tách thành công hợp chất TT1 dưới dạng chất sạch từ phân đoạn OM-Et20-Me40.
• Xác định cấu trúc hợp chất TT1: Cấu trúc phân tử của TT1 được làm sáng tỏ dựa trên phân tích tương quan các tín hiệu quang phổ:
  • Phổ 13C-NMR và 1H-NMR: Tác giả so sánh chi tiết các độ dịch chuyển hóa học (δC và δH), hình dạng mũi phổ (singlet, doublet, multiplet) và hằng số ghép (J) của TT1 với hợp chất đối chiếu đã công bố là Olaximbriside A. Kết quả phổ carbon cho thấy các tín hiệu đặc trưng của khung sesquiterpenoid ngưng tụ với vòng tropolone bảy cạnh cùng các carbon của phần đường (glycoside).
  • Phổ 2D-NMR: Tương quan 1H-1H COSY xác định liên kết giữa các proton liền kề trong khung phân tử; phổ HSQC làm sáng tỏ tương quan một liên kết trực tiếp giữa 1H và 13C; phổ HMBC chỉ ra các tương tác dị hạt nhân tầm xa qua 2, 3 liên kết giúp ghép nối khung cacbon, vị trí gắn nhóm thế methyl, hydroxyl và vị trí liên kết glycoside; phổ NOESY xác định cấu hình không gian tương đối của các tâm bất đối.
  • Phổ LC-MS/MS: Dữ liệu phân mảnh khối phổ cung cấp khối lượng phân tử chính xác và khối lượng các mảnh ion đặc trưng, khẳng định hợp chất TT1 là một sesquiterpenoid tropolone glycoside mới chưa từng được công bố trong các tài liệu trước đây.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã đạt được các kết quả cụ thể và mang lại những đóng góp khoa học sau:

• Khảo sát và xác định thành phần hóa học của chiết xuất n-hexane từ rễ Olax imbricata bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS theo tiêu chuẩn AOAC 996.06.
• Thiết lập quy trình phân tách hiệu quả đối với cao chiết methanol từ rễ cây dương đầu thông qua 4 cấp phân đoạn: từ 200,0 g cao thô MeOH tách qua cột Diaion HP-20 thu được 54,30 g phân đoạn OM-Et20; từ 50,0 g OM-Et20 qua cột chân không silica gel RP-18 thu được 2,75 g phân đoạn OM-Et20-Me40; từ 2,75 g OM-Et20-Me40 qua hệ thống SKĐC gradient MeOH-H2O thu được 13,2 mg phân đoạn OM-Et20-Me40-P1; và tinh sạch hoàn toàn hợp chất TT1 bằng hệ SKĐC đẳng dung CH3CN-H2O (15:85 có 0,1% HCOOH).
• Phân lập và giải mã thành công cấu trúc phân tử của hợp chất TT1 bằng các kỹ thuật phổ nghiệm 1D-NMR, 2D-NMR và LC-MS/MS, chứng minh hợp chất này là một sesquiterpenoid tropolone glycoside mới.
• Đóng góp về mặt lý luận và khoa học: Bổ sung dữ liệu cấu trúc vào ngân hàng dữ liệu hóa thực vật học về các hợp chất tự nhiên có khung tropolone ngưng tụ quý hiếm từ loài Olax imbricata Roxb. tại Việt Nam.
• Đóng góp về mặt thực tiễn: Cung cấp thông số vận hành thực nghiệm chuẩn xác (tỷ lệ pha động, áp suất, loại cột, bước sóng phát hiện) cho các nghiên cứu chiết tách, tinh chế các hợp chất phân cực tương tự từ nguồn dược liệu họ Olacaceae.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận bộc lộ một số hạn chế gắn liền với phạm vi thực hiện của một đề tài tốt nghiệp đại học:

• Nghiên cứu chỉ tập trung phân lập sâu trên một phân đoạn duy nhất là OM-Et20 (và tiểu phân đoạn OM-Et20-Me40) của cao MeOH. Bốn phân đoạn cồn còn lại của cột Diaion HP-20 (OM-Et40, OM-Et60, OM-Et80, OM-Et96) và phân đoạn dịch rửa acetone chưa được tiến hành khảo sát hóa học.
• Đề tài mới dừng lại ở việc tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất TT1; chưa thực hiện khảo sát các hoạt tính sinh học in vitro hoặc in vivo (như hoạt tính gây độc tế bào, kháng viêm, kháng oxy hóa) đối với hợp chất tinh khiết TT1 trong phạm vi khóa luận này.
• Phân đoạn cao n-hexane chỉ mới dừng ở mức gửi mẫu phân tích thành phần acid béo qua GC-MS tại đơn vị phân tích dịch vụ bên ngoài, chưa tiến hành phân lập đơn chất từ cao n-hexane.

Các hướng mở tiếp theo được đề xuất:

• Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của các phân đoạn còn lại từ cột Diaion HP-20 nhằm tìm kiếm thêm các dẫn xuất sesquiterpenoid tropolone hoặc saponin triterpenoid mới.
• Tích lũy lượng mẫu tinh khiết của hợp chất TT1 để tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào ung thư (dòng MCF-7, HepG2, LU) tương tự như các hợp chất khung tropolone đã công bố trước đây từ loài này.

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:

• Sinh viên và học viên sau đại học: Chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Công nghệ Thực phẩm có thể tham khảo tài liệu như một quy trình thực nghiệm mẫu về phương pháp làm việc với các hợp chất tự nhiên phân cực cao khó phân tách.
• Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm phân tích: Tham khảo quy trình vận hành chi tiết của hệ thống sắc ký điều chế Buchi Pure C-835 Prep Advance, bao gồm các bước từ khảo sát điều kiện trên HPLC phân tích (cột 4,6 mm), tính toán mở rộng quy mô lên cột điều chế (cột 20 mm), thiết lập chương trình gradient có phụ gia acid formic đến bước tinh chế đẳng dung dung môi acetonitrile.
• Nghiên cứu cấu trúc phổ: Phần luận giải phổ 1D và 2D-NMR đối chiếu với Olaximbriside A cung cấp dữ liệu tham khảo hữu ích cho các nhà nghiên cứu khi giải mã các hợp chất glycoside phức tạp có khung sesquiterpene ngưng tụ bảy cạnh (tropolone).

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật rễ cây dương đầu trong khóa luận được thu hái ở đâu và tiêu bản được lưu trữ tại đơn vị nào?
Mẫu rễ cây dương đầu (Olax imbricata Roxb.) được thu hái tại thị xã Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020. Mẫu được nhận danh thực vật bởi ông Hoàng Xuân Lâm (Công ty nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung) và được lưu giữ tiêu bản thực vật dưới mã số UTE-A002 tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Quy trình xử lý nguyên liệu thô ban đầu để thu nhận cao MeOH được thực hiện như thế nào?
Từ 50,0 kg rễ tươi, sau khi sấy ở 60 – 70°C và nghiền nhỏ thu được 7,0 kg bột khô. Bột rễ được chiết hồi lưu với dung môi EtOH 96° thu hồi được 1,5 kg cao thô EtOH. Cao EtOH tiếp tục được phân bố với n-hexane thu được 600,0 g cao n-hexane. Phần bã không tan trong n-hexane được hòa tan với dung môi MeOH và cô quay thu hồi dung môi thu được 750,0 g cao thô MeOH.

3. Phân đoạn OM-Et20 và OM-Et20-Me40 được tách ra bằng những kỹ thuật sắc ký nào với dung môi gì?
Phân đoạn OM-Et20 (54,30 g) được tách từ 200,0 g cao thô MeOH bằng sắc ký cột hấp phụ hạt nhựa Diaion HP-20 pha đảo, giải ly bằng hệ EtOH-H2O (2:8). Sau đó, 50,0 g OM-Et20 được nạp lên cột sắc ký chân không silica gel RP-18 pha đảo, giải ly bằng hệ MeOH-H2O (4:6) để thu nhận 2,75 g phân đoạn OM-Et20-Me40.

4. Điều kiện sắc ký điều chế (SKĐC) được sử dụng để tinh chế hợp chất TT1 là gì?
Quá trình tinh chế gồm 2 bước trên cột Silica gel RP-18 (250 × 20 mm, 9 µm) với tốc độ dòng 7 mL/phút:

• Bước 1: Phân tách 2,75 g OM-Et20-Me40 bằng chương trình gradient MeOH-H2O (có 0,1% acid formic) từ 32% đến 45% MeOH, tiêm 2,5 mL/lần (14 lần tiêm), thu được 13,2 mg phân đoạn OM-Et20-Me40-P1 tại thời gian lưu 32,2 – 36,2 phút.
• Bước 2: Tinh chế 13,2 mg OM-Et20-Me40-P1 bằng chế độ đẳng dung hệ CH3CN-H2O (15:85 có 0,1% acid formic), tiêm 2,5 mL/lần (3 lần tiêm) để loại bỏ hoàn toàn hai mũi tạp phụ kề bên, thu được hợp chất sạch TT1.

5. Hợp chất TT1 được xác định thuộc nhóm chất nào và bằng những phương pháp phổ nào?
Hợp chất TT1 được xác định là một sesquiterpenoid tropolone glycoside mới. Cấu trúc của TT1 được làm sáng tỏ thông qua phân tích và so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với hợp chất Olaximbriside A, kết hợp với các phổ tương tác hai chiều 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY và sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LC-MS/MS.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Trịnh Thị Thủy đã thực hiện khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất n-hexane và phân đoạn OM-Et20 của cao methanol từ rễ cây dương đầu (Olax imbricata Roxb.) thu hái tại Phú Yên. Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình phân tách đa bậc kết hợp sắc ký cột Diaion HP-20, sắc ký chân không silica gel RP-18 và sắc ký điều chế Prep-HPLC để tinh sạch hợp chất mục tiêu. Bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (1D/2D-NMR và LC-MS/MS), cấu trúc của hợp chất phân lập TT1 đã được chứng minh là một sesquiterpenoid tropolone glycoside mới, đóng góp dữ liệu khoa học vào việc nghiên cứu nguồn dược liệu chi Olax tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về cây dương đầu, Olax imbricata Roxb. Nguồn gốc và phân bố Cây dương đầu Olax imbricata Roxb (O. imbricata) là một loài thực vật thuộc nhóm thực vật hạt kín (Angiospermae).

Tên khoa học: Olax imbricata Roxb. Cây còn có các tên thông thường khác: dương đầu kết lợp, cây cát lộ, dây mao trật.1: Phân loại cây dương đầu theo khoa học [2]. Phân loại Tên khoa học Tên Việt Nam Giới Plantae - Lớp Magnoliopsida - Bộ Santalales Đàn hương Họ Olacaceae Dương đầu Chi Olax Dương đầu Loài Olax imbricata Roxb. Dương đầu kết lợp Họ dương đầu (Olacaceae) thường được tìm thấy ở vùng rừng nhiệt đới, ôn đới ấm và các vùng xavan, bao gồm 25 chi và 250 loài.

Hiện nay, chi Olax có khoảng 40 loài. Phân bố ở vùng rừng nhiệt đới Châu Á như Trung Quốc, Đông Nam Á, ngoài ra còn được tìm thấy rộng rãi ở các nước Châu Phi và một phần ở Nam Phi. [3] Cây dương đầu O. imbricata được xác định tên khoa học lần đầu tiên vào năm 1819, tại Trung tâm đa dạng Sinh học tự nhiên Philippines.

Sau đó phân bố rải rác khắp các vùng Đông Nam Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Sri Lanka, Myanmar, Thái Lan, Malaysia, Indonesia [2]. Ở Việt Nam, cây dương đầu O. imbricata được tìm thấy ở vùng núi Đakrông (khu bảo tồn thiên nhiên Đakrông) tỉnh Quảng Trị và phân bố ở các tỉnh Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng và Phú Yên [2]. Đặc điểm thực vật O.

imbricata, cây dương đầu, là một loài của cây thường xanh, dạng cây bụi đứng, thân gỗ, cao khoảng 2 – 6 m, phân bố rộng rãi ở vùng rừng nhiệt đới thường xanh. Thân cây màu nâu, cành non màu xám.1: Hình ảnh cây dương đầu (Olax Imbricata). Cây dương đầu O. imbricata có lá dạng hình trứng hoặc hình elip thuôn dài, chóp tròn, chiều dài lá 7 – 10 cm, không lông, dai.

Hoa mọc thành chùm nhỏ với ba nhị ở kẽ lá hoặc đầu cành, màu trắng hoặc hơi vàng, kích thước của một bông hoa có thể từ 1,5 – 2,5 cm, cánh hoa dài 8 – 10 mm. Quả hạch hình cầu hoặc dạng trứng ngược, bao bởi đài hoa cùng lớn lên với quả. Cây ra hoa từ tháng 4 tới tháng 10 [1]. Hình ảnh các bộ phận của cây dương đầu được trình bày trong hình 1.2: Các bộ phận quả (A), hoa (B), lá (C), cành (D) và rễ (E) của cây dương đầu.

Những nghiên cứu về thành phần hoá học Theo K. Panyaphu và cộng sự phân tích hoá học thực vật của loài O. imbricata cho thấy sự hiện diện của hợp chất polyphenolic, flavonoid, glicoside, saponin, tannin, alkaloid và một số hợp chất có hoạt tính kháng oxy hoá, kháng khuẩn [4]. Hiện nay có khá ít tài liệu nghiên cứu trên cây dương đầu, O.

imbricata, do đó tìm hiểu tổng quan về thành phần hoá học trên chi Olax và sắp xếp theo các nhóm hợp chất thiên nhiên dưới đây. Nhóm chất béo Năm 2016, nhóm nghiên cứu của E. Mavundza và cộng sự ở Nam Phi đã phân lập ra được ba acid béo từ cao chiết dichloromethane của vỏ cây Olax dissitiflora gồm santalbic acid (1), exocarpic acid (2), octadec-9,11-diynoic acid (3), đồng thời khám phá ra ảnh hưởng của acetylenic acid béo đối với loài muỗi [5]. Năm 2018, cao chiết ethyl acetate từ rễ của loài O.

imbricata được nghiên cứu bởi cô Vo Thi Nga và cộng sự tại Việt Nam, kết quả phân lập ra ba hợp chất béo là (E)-henicos-7-en- 9-ynoic acid (4), (E)-henicos-7-en-9-ynoylglycerol (5) và 7,8,9,10-tetrahydroxyhexadeca- 4,10-diynoic acid (6). Cho đến nay thì đây là báo cáo đầu tiên về phân lập hợp chất béo trên loài O. Nhóm terpenoid Năm 1981, một hợp chất triterpenoid saponin, còn được gọi là olaxoside hay (3β)-28-(β-D- glucopyranosyloxy)-28-oxoolean-12-en-3-yl-(1→4)-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β- D-glucopyranosiduronic acid (7), đã được P.