Luận án tiến sĩ về phân lập và tinh chế lignan trong quả chi Cleistanthus thuộc họ Thầu Dầu

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập, tinh chế chất chuẩn để định tính, định lượng lignan trong quả chi Cleistanthus họ Thầu dầu Euphorbiaceae.

• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Và Tinh Chế Lignan Trong Quả Chi Cleistanthus

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: Tình hình nghiên cứu về chi Cách hoa trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.1. Tổng quan về chi Cách hoa (Cleistanthus)
• 1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư của chi Cách hoa
• 1.3. Một số hoạt chất nhóm aryltetralin lignan được phát triển thành thuốc
• 1.4. Một số hoạt chất chính nhóm aryltetralin lignan phân lập được từ quả của chi Cleistanthus tại Việt Nam
• 1.5. Một số phương pháp phân tích hoạt chất nhóm aryltetralin lignan trong dịch chiết thực vật
• 1.6. Tổng quan về chất chuẩn
• 1.6.1. Khái niệm
• 1.6.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học
• 1.6.3. Tổng quan các hướng dẫn về thiết lập chất chuẩn gốc
• 1.6.4. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.7. Tính cấp thiết của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và trang thiết bị
• 2.2.1. Hóa chất
• 2.2.2. Dung môi
• 2.2.3. Thiết bị nghiên cứu
• 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc một số chất tinh khiết nhóm lignan trong quả Chả chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
• 2.3.2. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng và định tính
• 2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập, tinh chế một số chất nhóm lignan từ quả cây Chả chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
• 3.1.1. Phân lập thô cleistantoxin và cleisindoside D trên cột silica gel
• 3.1.2. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của cleistantoxin làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng
• 3.1.3. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng
• 3.1.4. Khẳng định cấu trúc của cleisindoside A làm chất chuẩn định tính
• 3.1.5. Tinh chế và xác định cấu trúc các chất phân lập mới
• 3.2. Thiết lập chất chuẩn gốc
• 3.2.1. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D
• 3.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính cleisindoside A và 7',8'-dehydrocleistantoxin (chất MGi-CT1)
• 3.3. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa
• 3.3.1. Xây dựng phương pháp định tính 4 lignan trong quả của chi Cách hoa bằng TLC
• 3.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD
• 3.3.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính và định lượng đồng thời một số lignan trong mẫu quả của chi Cách hoa (Cleistanthus)
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleistantoxin và cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
• 4.1.1. Phân lập thô cleistantoxin và cleisindoside D trên cột silica gel
• 4.1.2. Phân lập, tinh chế, khẳng định cấu trúc cleistantoxin làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng
• 4.1.3. Phân lập, tinh chế, khẳng định cấu trúc cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng
• 4.1.4. Khẳng định cấu trúc cleisindoside A làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn định tính
• 4.1.5. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các chất phân lập mới
• 4.2. Thiết lập chất chuẩn
• 4.2.1. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D
• 4.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn định tính cleisindoside A và 7',8'-dehydrocleistantoxin (CT1)
• 4.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa
• 4.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính 4 chất chuẩn đã được thiết lập trong quả của chi Cách hoa
• 4.3.2. Xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleistantoxin và cleisindoside D trong quả của chi Chả chôi
• 4.3.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính và định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan phân lập và tinh chế lignan trong quả chi Cleistanthus

Chi Cleistanthus thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Chi này bao gồm nhiều loài cây gỗ nhỏ phân bố tại các khu rừng nhiệt đới. Quả của cây chứa hàm lượng phong phú các dẫn chất polyphenol đặc hữu. Trong đó, nhóm hợp chất cyclolignan thể hiện giá trị dược lý nổi bật. Hai hoạt chất tiêu biểu gồm cleistantoxin và cleisindoside D. Nghiên cứu hiện đại chứng minh các hợp chất này có khả năng ức chế mạnh tế bào ung thư. Việc tách chiết hợp chất thứ cấp từ quả thực vật đòi hỏi kỹ thuật cao. Nguồn nguyên liệu tự nhiên thường có hàm lượng hoạt chất biến thiên theo mùa thu hái. Các hợp chất lignan trong quả thường tồn tại dưới dạng aglycon tự do hoặc liên kết glycoside. Cấu trúc hóa học của chúng phức tạp với nhiều tâm lập thể. Quá trình nghiên cứu tạo tiền đề vững chắc cho việc bảo tồn và phát triển dược liệu. Đồng thời, việc làm sáng tỏ cơ chế phân tử mang lại tiềm năng phát triển thuốc điều trị ung thư mới. Các kết quả phân lập mở ra triển vọng to lớn trong ngành dược phẩm sinh học hiện đại.

1.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố của chi Cleistanthus

Chi Cleistanthus là một phân chi lớn trong thực vật nhiệt đới. Cây thường mọc hoang dã tại vùng núi đá vôi và ven rừng thưa. Lá cây mọc so le, nguyên vẹn và có cuống ngắn. Hoa của cây đơn tính cùng gốc hoặc khác gốc, mọc thành cụm nhỏ ở kẽ lá. Quả thuộc dạng quả nang hình cầu, nứt thành ba mảnh khi chín. Quả chứa nhiều hạt nhỏ với nội nhũ giàu dầu béo. Tại Việt Nam, các loài Cleistanthus phân bố rải rác từ miền Trung đến Nam Bộ. Đồng bào địa phương thường sử dụng lá và vỏ thân làm dược liệu chữa bệnh ngoài da. Tuy nhiên, quả của cây ít khi được khai thác thương mại do thiếu các đánh giá hóa học đầy đủ. Thu hái quả đúng thời điểm giúp bảo toàn nồng độ hoạt chất cao nhất.

1.2. Giá trị y sinh của nhóm hoạt chất cyclolignan

Cyclolignan là nhóm hợp chất phenol có cấu trúc khung aryltetralin đặc thù. Khung carbon này sở hữu liên kết ngưng tụ giữa hai đơn vị phenylpropanoid. Các dẫn xuất cyclolignan trong quả Cleistanthus mang các nhóm thế methylenedioxy và methoxy phân bố đặc trưng. Những biến đổi cấu trúc này quyết định trực tiếp hoạt tính chống khối u. Nhiều thử nghiệm sinh học in vitro đã chứng minh hiệu lực độc tế bào của cleistantoxin đối với các dòng ung thư gan và phổi. Khối lượng phân tử của cleistantoxin là 398,0 Da với công thức C21H16O8. Đồng thời, chất cleisindoside D mang gốc phân tử glucose giúp cải thiện độ tan trong dung môi phân cực. Sự đa dạng cấu trúc mang lại triển vọng lớn trong nghiên cứu phát minh dược phẩm đích.

II. Thách thức phân lập và tinh chế lignan trong quả chi Cleistanthus

Quá trình chiết xuất và làm sạch lignan từ quả chi Cleistanthus đối mặt nhiều rào cản kỹ thuật. Quả chứa lượng lớn lipid, sắc tố diệp lục, sáp và tannin. Các tạp chất này dễ kéo theo hoạt chất trong pha chiết dung môi. Sự hiện diện của các đồng phân lập thể có cấu trúc tương đồng gây khó khăn cho việc phân tách sắc ký. Các pic sắc ký thường bị chồng chập hoặc dính đuôi kéo dài. Bên cạnh đó, độ bền hóa học của khung cyclolignan rất nhạy cảm với nhiệt độ và pH. Môi trường acid hoặc kiềm mạnh dễ gây mở vòng lacton hoặc gãy liên kết glycoside. Nếu không kiểm soát chặt chẽ điều kiện bay hơi, hợp chất sẽ bị biến tính nhanh chóng. Hiện tượng thoái hóa hoạt chất làm giảm đáng kể hiệu suất thu hồi thực tế. Ngoài ra, việc thiếu hụt các chất chuẩn thương mại gốc cũng cản trở quá trình kiểm soát chất lượng. Các phòng thí nghiệm gặp nhiều trở ngại khi định danh và xây dựng đường chuẩn định lượng. Do đó, việc xây dựng phương pháp phân lập tinh sạch trở thành yêu cầu cấp thiết.

2.1. Tạp chất cản trở và hiện tượng chồng chập pic sắc ký

Mẫu dịch chiết quả thô thường chứa nhiều chất béo và nhựa thực vật. Các tạp chất không phân cực này bám dính rất chặt trên silicagel. Chúng làm giảm nhanh dung lượng hấp phụ của cột sắc ký. Đồng thời, các phân đoạn rửa giải đầu tiên luôn chứa hỗn hợp nhiều đồng phân lignan tương đồng. Trên bản mỏng sắc ký, các vết di chuyển sít nhau và khó tách rời. Khi phân tích bằng HPLC, hiện tượng giãn rộng dải pic thường xuyên xuất hiện. Tình trạng pic chính lẫn pic tạp làm giảm độ tinh khiết sản phẩm phân lập. Mẫu cũng dễ bị mất mát hoạt chất trong các bước tinh chế kéo dài. Do đó, việc loại tạp sơ bộ bằng chiết lỏng - lỏng đóng vai trò quyết định.

2.2. Vấn đề suy giảm độ bền hóa học của hoạt chất

Vòng lacton trong phân tử cleistantoxin rất kém bền dưới tác động nhiệt và môi trường kiềm. Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, nhiệt độ cao thúc đẩy phản ứng mở vòng hoặc đồng phân hóa. Các dẫn xuất mở vòng này làm mất hẳn hoạt tính sinh học nguyên bản. Đối với cleisindoside D, liên kết beta-D-glucopyranoside rất nhạy cảm với vết acid vô cơ. Sự thủy phân ngoài ý muốn sẽ cắt đứt phân tử đường, biến đổi hợp chất thành dạng aglycon không mong muốn. Ánh sáng tán xạ cũng gây ra các phản ứng quang phân hủy đối với khung thơm liên hợp. Mọi sai sót nhỏ trong thao tác xử lý mẫu đều dẫn đến sai lệch kết quả định tính và định lượng. Việc duy trì nhiệt độ thấp và môi trường trung tính là điều kiện sống còn.

III. Quy trình phân lập và tinh chế lignan trong quả chi Cleistanthus

Phương pháp tiếp cận tích hợp nhiều kỹ thuật sắc ký hiện đại giải quyết hiệu quả các trở ngại phân tách. Bột quả khô được chiết ngấm kiệt hoặc chiết hồi lưu bằng cồn sinh học. Cao toàn phần sau đó được phân tán vào nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexan, dicloromethan và ethyl acetat. Phân đoạn dicloromethan chứa phần lớn cleistantoxin, trong khi phân đoạn ethyl acetat giàu cleisindoside D. Quá trình tinh chế sơ bộ sử dụng sắc ký cột cổ điển nhồi silicagel pha thường. Hệ dung môi rửa giải n-hexan - ethyl acetat hoặc dicloromethan - methanol với độ phân cực tăng dần giúp tách riêng các nhóm phân đoạn chính. Tiếp theo, hệ thống HPLC điều chế pha đảo với cột C18 hoặc phenyl được vận hành để tinh chế triệt để. Pha động gồm acetonitril và dung dịch đệm điều chỉnh pH 4,6 giúp pic sắc ký sắc nét và đối xứng. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn trong dicloromethan hoặc acetonitril lạnh giúp thu được sản phẩm có độ tinh khiết trên 98%. Quy trình này đảm bảo tính lặp lại cao và thu hồi tối đa hoạt chất.

3.1. Kỹ thuật sắc ký cột phân đoạn kết hợp HPLC điều chế

Sắc ký cột silicagel pha thường là bước phân tách sơ cấp mang tính quyết định. Lớp chất hấp phụ giữ lại hầu hết các hợp chất phân cực cao và tạp chất sáp. Mẫu rửa giải được theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn tương đồng. Các phân đoạn giàu dẫn xuất lignan tiếp tục được tinh sạch qua cột sắc ký phân bố pha đảo. Hệ thống HPLC điều chế sử dụng cột pha tĩnh liên kết phenyl hoặc octadecylsilane kích thước hạt 5 micromet. Pha động vận hành theo chương trình gradient nồng độ giữa acetonitril và nước chứa acid formic 0,1%. Detector DAD quét dải bước sóng tối ưu giúp cắt pic chuẩn xác tại đỉnh hấp thụ cực đại. Nhờ đó, tạp chất đồng phân được loại bỏ hoàn toàn khỏi hoạt chất chính.

3.2. Phương pháp xác định cấu trúc và độ tinh khiết hóa học

Hợp chất tinh chế được khẳng định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều gồm 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và NOESY. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xác định chính xác khối lượng phân tử phân mảnh ion. Phổ hồng ngoại IR ghi nhận các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm carbonyl lacton và liên kết ete. Góc quay cực riêng và phổ lưỡng sắc tròn CD làm sáng tỏ cấu hình lập thể tuyệt đối. Độ tinh khiết sắc ký được xác định trên thiết bị HPLC/DAD với nhiều hệ pha động khác nhau. Mẫu chuẩn cleistantoxin dạng bột trắng có nhiệt độ nóng chảy 195 - 196 độ C. Tín hiệu pic đơn lẻ trên sắc ký đồ khẳng định độ tinh sạch vượt ngưỡng 99%. Toàn bộ dữ liệu hóa lý phục vụ hoàn hảo cho việc lập hồ sơ chất chuẩn đối chiếu gốc.

IV. Ứng dụng phân lập và tinh chế lignan trong quả chi Cleistanthus

Nghiên cứu phân lập và tinh chế thành công lignan từ quả chi Cleistanthus mở ra hướng đi chiến lược cho ngành dược. Quy trình cung cấp nguồn nguyên liệu chất chuẩn có độ tinh khiết cao phục vụ công tác kiểm nghiệm. Việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu giúp chuẩn hóa quy trình định tính và định lượng dược liệu trong nước. Nhờ đó, các đơn vị kiểm nghiệm giảm bớt sự phụ thuộc vào nguồn chuẩn ngoại nhập đắt đỏ. Ngoài ra, các hợp chất lignan tinh khiết là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu sàng lọc hoạt tính dược lý chuyên sâu. Các thử nghiệm độc tính tế bào cho thấy tiềm năng điều chế thuốc chống ung thư hiệu quả. Sự hiện diện của cleistantoxin và cleisindoside D tạo bước đột phá trong nghiên cứu hóa thực vật tại Việt Nam. Các doanh nghiệp dược có thể ứng dụng quy trình để phát triển thực phẩm bảo vệ sức khỏe hoặc thuốc từ thảo mộc. Nghiên cứu cũng góp phần gia tăng giá trị kinh tế cho các loài thực vật đặc hữu thuộc chi Cách hoa. Việc bảo tồn và khai thác bền vững nguồn gen bản địa nhờ vậy được thúc đẩy mạnh mẽ.

4.1. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm thuốc

Chất chuẩn đối chiếu đóng vai trò thước đo pháp lý trong kiểm nghiệm dược phẩm. Quy trình phân lập cung cấp cleistantoxin và cleisindoside D có độ tinh khiết cao. Hồ sơ kỹ thuật chất chuẩn được hoàn thiện với đầy đủ thông số phổ nghiệm và độ sạch HPLC. Bộ dữ liệu này đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe của Dược điển Việt Nam. Các viện kiểm nghiệm có thể sử dụng trực tiếp các chất chuẩn để định lượng dược liệu. Việc tự chủ sản xuất chất chuẩn giúp giảm chi phí phân tích đáng kể cho các đơn vị. Đây là cơ sở khoa học vững chắc nhằm phát hiện dược liệu giả mạo trên thị trường. Công tác quản lý chất lượng thuốc đông dược từ đó trở nên minh bạch và chuẩn xác.

4.2. Tiềm năng phát triển thuốc kháng ung thư thế hệ mới

Các dẫn xuất cyclolignan sở hữu cơ chế tác động chọn lọc trên các tế bào ung thư. Cleistantoxin can thiệp vào phân chia tế bào thông qua ức chế trùng hợp vi ống. Đồng thời, hợp chất kích hoạt chu trình chết tế bào theo chương trình apoptosis. Khả năng tiêu diệt tế bào ác tính mà ít gây độc lên mô lành tạo ưu thế vượt trội. Cấu trúc khung cyclolignan cung cấp khung sườn hóa học lý tưởng cho nghiên cứu bán tổng hợp. Các nhà hóa dược có thể gắn thêm nhóm chức để tăng sinh khả dụng đường uống. Thành công trong phân lập tinh khiết tạo nguồn chất đầu cho các thử nghiệm tiền lâm sàng. Hướng nghiên cứu này mở ra triển vọng phát triển thuốc kháng ung thư hiệu quả cao.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Lâm Hồng tại Trường Đại học Dược Hà Nội, chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất (mã số 62720410), bảo vệ năm 2019, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Việt Hùng (Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM) và PGS.TS Đoàn Thị Mai Hương (Phó phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam). Kinh phí thực hiện từ Đề tài độc lập cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Dịch chiết ethyl acetat từ quả ba loài thuộc chi Cách hoa — Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis Merr. ex Croiz.), Chả chôi (C. tonkinensis Jabl.) và Cách hoa eberhardt (C. eberhardtii Gagn.) — được Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học hợp chất tự nhiên CNRS (Cộng hòa Pháp) xác định có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô KB từ 88,40 đến 95,17% ở nồng độ 1 µg/mL. Từ dịch chiết đó, hai hoạt chất chính là cleistantoxin và cleisindoside D được phân lập, có cấu trúc hóa học gần tương đồng với etoposid và teniposid — hai dẫn chất glycosid của podophyllotoxin đang được sử dụng làm thuốc điều trị ung thư tinh hoàn và phổi. Thử nghiệm trên chuột Nude cho thấy nhóm điều trị bằng cao khô chiết xuất từ quả Chả chôi với liều 100 mg/kg (nhóm CT-HSB 2) có 100% chuột còn sống sau 6 tuần và thời gian sống kéo dài hơn nhóm chứng 45,43%.

Để xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô đang được phát triển thành nguyên liệu thuốc, cần có phương pháp định tính và định lượng cleistantoxin và cleisindoside D, từ đó đòi hỏi phải có chất chuẩn tương ứng. Tuy nhiên, trên thế giới chưa có chất chuẩn đối chiếu cleistantoxin và cleisindoside D, và tại Việt Nam hầu như chưa có công trình nào công bố thiết lập chất chuẩn gốc (primary reference standard) — chủ yếu mới dừng lại ở thiết lập chất chuẩn thứ cấp.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án đặt ra ba mục tiêu:

1. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleistantoxin và cleisindoside D từ quả cây Chả chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn; đồng thời xác định cấu trúc các chất tinh khiết mới phân lập được.
2. Thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D.
3. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa (Cleistanthus).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng phân lập, tinh chế là 168 g cao cồn khô chiết xuất từ 16 kg quả tươi cây Chả chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.), thu hái ngày 06/06/2016 tại Đại Từ – La Bằng – Thái Nguyên (ký hiệu VN 0308 I.B-TN). Đối tượng phân tích định tính, định lượng bao gồm quả Chả chôi thu hái ngày 16/06/2018 tại Đại Từ – La Bằng – Thái Nguyên và quả Cách hoa eberhardt thu hái ngày 08/06/2018 tại Phú Lộc – Thừa Thiên Huế (ký hiệu ĐI.3). Mẫu được xác định tên loài và lưu giữ tại Viện Tài nguyên và sinh thái, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả điểm lại

Tác giả tổng quan nghiên cứu theo ba nhóm chính:

Nghiên cứu trên thế giới về chi Cleistanthus:

• Loài Cleistanthus collinus Roxb. tại Ấn Độ được nghiên cứu kỹ nhất: Thamburaj Suman và cộng sự thử tác dụng gây độc tế bào in vitro của dịch chiết và các phân đoạn (nước, methanol, ethyl acetat, 100 µg/mL) từ lá khô trên dòng tiền tế bào mỡ 3T3-L1 (ủ 48 giờ). Nhiều tác giả phát hiện cleistanthin A và B trong lá và lõi gỗ cây, trong đó cleistanthin A có giá trị LD₅₀ là 38,1 µM so với etoposid là 22; cleistanthin B thử in vivo với dòng EAC và DAL ở liều 25, 50 và 100 mg/kg trong 10 ngày, so với 5-fluorouracil (5-FU) 20 mg/kg — kết quả cleistanthin B ở liều 50 mg/kg có hoạt tính kháng u nhưng không hiệu quả bằng 5-FU.
• Từ lõi gỗ Cleistanthus patulus (Muell.) phân lập được cleistanthosid A và B, taiwanin C, cleistanthin A.
• Từ dịch chiết EtOAc thân cây Cleistanthus boivinianus (Baill.) Müll. Arg. (Madagascar) phân lập được lignan mới: hợp chất (1) 3α-O-(β-D-glucopyranosyl)desoxypodophyllotoxin với giá trị IC₅₀ kháng A2780 là 33,0 ± 3,6 nM; kháng HCT-116 IC₅₀ là 20,5 nM; hợp chất (2) 4-O-(β-D-glucopyranosyl)dehydropodophyllotoxin IC₅₀ kháng A2780 là 2,3 nM.

Nghiên cứu tại Việt Nam:

• Năm 2012, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam lần đầu tiên phân lập và công bố cấu trúc cleistantoxin, cleisindoside D từ quả cây chi Cách hoa tại Việt Nam (tài liệu [82], [83]). Cleistantoxin có hoạt tính kháng ung thư in vitro trên các dòng MCF7, MCF7R, HT29 với giá trị IC₅₀ trong khoảng 14–36 nM (tương đương 0,006–0,014 µg/mL); đặc biệt ức chế chọn lọc dòng ung thư vú kháng thuốc MCF7R với IC₅₀ 14 nM so với MCF7 thông thường IC₅₀ 36 nM. Theo Viện Nghiên cứu Ung thư Mỹ (NCI), hợp chất có IC₅₀ < 4 ng/mL mới được coi là có hoạt tính gây độc tế bào.
• Nghiên cứu mô phỏng tương tác cho thấy cleistantoxin và cleisindoside D có ái lực với receptor của con đường nội bào (PARP-I, BID, BIA, NOXA); cleisindoside D cho ái lực với PARP-I là -10.

Phương pháp phân tích aryltetralin lignan đã có:

• Jairo K. Bastos và cộng sự phân tích lignan trong Podophyllum peltatum bằng HPLC pha đảo (cột Taxsil®, pha động MeOH:H₂O:CH₃COOH với 0,192% NH₄COOH pH=3,46) nhưng mới dừng ở xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp hữu cơ, chưa xác định tạp bay hơi và tạp vô cơ theo hướng dẫn IP và WHO.
• Nghiên cứu phân tích aryltetralin lignan trong C. indochinensis [82] mới bước đầu xác định hàm lượng bằng cột Zorbax XDB C-18, chưa khảo sát trên nhiều loại dung môi chiết, và chất chuẩn sử dụng chỉ dừng lại ở nhận dạng cấu trúc mà chưa tiến hành xác định độ tinh khiết đầy đủ.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Chưa có chất chuẩn gốc cleistantoxin và cleisindoside D trên thế giới. Tại Việt Nam, chưa có công trình công bố thiết lập chất chuẩn gốc từ hợp chất phân lập từ tự nhiên theo hướng dẫn của IP, WHO và USP. Phương pháp định tính và định lượng đồng thời các lignan này trong dược liệu cũng chưa được xây dựng và thẩm định đầy đủ.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

Luận án dựa trên khái niệm chất chuẩn gốc (primary chemical reference standard – PCRS) theo định nghĩa của ICH Guideline Q7: là chất được xác định nhiều đặc tính bằng các kỹ thuật phân tích phù hợp, có độ tinh khiết cao và đáng tin cậy, giá trị ấn định không cần so sánh với chất chuẩn khác. Quy trình thiết lập tuân theo ISO 17034 và ISO GUIDE 35 gồm: xác định nhu cầu → thu thập nguyên liệu → chuẩn bị → đánh giá độ đồng nhất → xác định các đặc tính → kiểm soát độ ổn định.

Độ tinh khiết của chất chuẩn gốc được tính theo công thức cân bằng khối lượng:

Độ tinh khiết = (100 − % tạp hữu cơ) × (100 − % tạp bay hơi − % tạp vô cơ) / 100

Các nhóm tạp được phân loại thành tạp hữu cơ (tạp chất liên quan, tạp chất phân hủy), tạp vô cơ và tạp bay hơi.

Nhóm lignan là trọng tâm hóa học: aryltetralin lignan có cấu trúc từ hai đơn vị phenylpropanoid C₆-C₃ liên kết qua vị trí C-8 và C-8'. Cleistantoxin (C₂₁H₁₈O₈, MW 398,0 Da; công bố [82]) và cleisindoside D (C₂₇H₂₈O₁₃, MW 560 Da; công bố [83]) là glycosid aryltetralin có cấu trúc gần với podophyllotoxin và etoposid.

Phương pháp thực tế

Phân lập và tinh chế:

Kỹ thuật	Điều kiện
Sắc ký cột cổ điển (CC)	Silica gel 40–63 µm (Merck); pha động n-hexan/CH₂Cl₂/aceton/MeOH
Cột Sephadex LH-20	25–100 µm (Sigma); rửa giải MeOH 100%
Cột pha đảo	YMC-GEL ODS-A, cỡ hạt 75 µm; pha động aceton-H₂O, MeOH-H₂O
TLC và TLC điều chế	Silica gel 60 GF₂₅₄ (Merck); phát hiện Ce(SO₄)₂ hoặc vanilin/H₂SO₄ đặc; UV 254 nm và 365 nm
Kết tinh	Dung môi thích hợp + dung môi thứ hai không hòa tan

Khẳng định cấu trúc:

• Phổ NMR 1D (¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT) và 2D (HSQC, COSY, HMBC, NOESY): thiết bị Bruker AMS500 FT-NMR, Viện Hóa học, Viện HL KH&CN VN; dung môi CDCl₃, CD₃OD, DMSO
• Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): FT-ICR-Mass spectrophotometer, Viện Hóa học
• Phổ hồng ngoại (IR): Nicolet LEXUS8, 670FT-W
• Phổ lưỡng sắc tròn (CD): Chirascan™ CD spectrometer, Viện Hóa sinh biển
• Góc quay cực riêng: JASCO DIP-2000 KUP polarimeter

Thiết lập chất chuẩn gốc:

• Độ tinh khiết sắc kí: HPLC/DAD (Agilent 1200 và Shimadzu 20A), phương pháp chuẩn hóa diện tích
• Tạp bay hơi: TGA/DSC1 Mettler Toledo STAR System (lượng mẫu 10–20 mg)
• Tạp vô cơ: phép thử tro sulfat (IP 2.3, Ph.Eur, DĐVN V – Phụ lục 9.6)
• Độ tinh khiết trực tiếp: DSC (yêu cầu > 95%, tốt hơn > 97%)
• Nhiệt độ nóng chảy: Kofler micro-hotstage; Buchi M-565
• Đánh giá độ đồng nhất lô: đóng ống chất chuẩn và kiểm tra bằng HPLC/DAD

Phát triển phương pháp phân tích dược liệu:

• Định tính 4 lignan bằng HPLC/DAD với 4 chất chuẩn đã thiết lập
• Định lượng đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin bằng HPLC/DAD
• Cột sắc kí: Inertsil RP và Phenyl Phenomenex (250 × 4,6 mm, 5 µm)
• Thẩm định theo các chỉ tiêu: độ ổn định hệ thống, độ lặp lại dung dịch chuẩn, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ tái lặp và độ đúng trên mẫu quả

Nguồn tư liệu và dữ liệu

Nguyên liệu thực vật thu hái tại Thái Nguyên và Thừa Thiên Huế, xác định tên loài tại Viện Tài nguyên và sinh thái. Dữ liệu phổ tham chiếu từ các công bố [82] và [83]. Hướng dẫn thiết lập chất chuẩn theo ISO 17034, ISO GUIDE 35, IP, WHO và USP.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tình hình nghiên cứu về chi Cách hoa trên thế giới và tại Việt Nam

Chương tổng quan phân loại học chi Cleistanthus (thuộc bộ Sơ-ri Malpighiales, họ Thầu dầu Euphorbiaceae), gồm khoảng 140 loài phân bố nhiệt đới; tại Việt Nam có 11 loài (theo Nguyễn Nghĩa Thìn) hoặc 14 loài (theo Phạm Hoàng Hộ). Ba loài được khảo sát gồm C. indochinensis, C. tonkinensis và C. eberhardtii, với mô tả hình thái chi tiết cho từng loài.

Tác giả điểm lại thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư của năm loài trong chi đã được nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu từ Nam Phi, Thái Lan, Ấn Độ, Madagascar và Việt Nam (xem mục Tổng quan tài liệu). Phần nhóm chất lignan được trình bày hệ thống: định nghĩa, phân loại tám nhóm khung (arylnaphthalen, aryltetralin, dibenzocyclooctadien, dibenzylbutan, dibenzylbutyrolactol, dibenzylbutyrolacton, furan, furofuran), phân nhóm neolignan và lịch sử phát triển podophyllotoxin thành etoposid, etopophos và teniposid.

Phần phương pháp phân tích điểm qua ba hướng nghiên cứu đã có: phân tích lignan trong Podophyllum peltatum (HPLC pha đảo, chất chuẩn nội acetylpodophyllotoxin C=400 µg/mL EtOH); trong Schisandra chinensis (chiết siêu tới hạn CO₂ loại lipid, sau đó RP-HPLC cột Separon SGX C18, 5 µm, 150×3 mm, pha động MeOH:nước 73:27); và trong C. indochinensis [82] bằng cột Zorbax XDB C-18 — nhưng đều chưa đủ điều kiện thiết lập chất chuẩn gốc.

Phần tổng quan chất chuẩn trình bày khái niệm, phân loại (chất chuẩn gốc và thứ cấp), quy trình thiết lập theo ISO GUIDE 35, tình hình trên thế giới (WHO, EDQM, USP với hơn 3.500 CCĐC, giá dao động 125–2.875 USD tính đến tháng 05/2018; EDQM hơn 2.800 CCĐC, giá 79–1.000 EUR) và tại Việt Nam (VKNT TƯ và VKNT TP.HCM chủ yếu thiết lập chất chuẩn thứ cấp; 10 chất chuẩn thứ cấp từ dược liệu đã được thiết lập giai đoạn 2008–2010, bao gồm acid oleanolic, asiaticosid, curcumin I, damnacanthal, diosgenin, hesperidin, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Re1, majonosid-R2).

Chương 2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương mô tả chi tiết đối tượng nghiên cứu (quả Chả chôi và Cách hoa eberhardt với thông tin thu hái, ký hiệu mẫu), hóa chất và thiết bị. Các thiết bị chính bao gồm: NMR Bruker AMS500 (Viện Hóa học), HR-ESI-MS FT-ICR (Viện Hóa học), IR Nicolet LEXUS8 (Phòng Vật lí đo lường, Viện KNT TƯ), CD Chirascan™ (Viện Hóa sinh biển), HPLC/DAD Agilent 1200 (Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất, ĐH Dược Hà Nội) và Shimadzu 20A (Viện KNT TƯ), TGA/DSC1 Mettler Toledo STAR System (Viện KNT TƯ và Viện KNT TP.HCM, Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất).

Nội dung nghiên cứu được trình bày dưới dạng sơ đồ tóm tắt (Hình 2.4) với ba nhánh chính: (1) phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc; (2) thiết lập chất chuẩn gốc định lượng và định tính; (3) xây dựng, thẩm định phương pháp và áp dụng định tính, định lượng trên mẫu quả.

Tiêu chí lựa chọn chất để thiết lập chất chuẩn: chất chuẩn định lượng cần đặc trưng cho loài, hàm lượng lớn và/hoặc có tác dụng sinh học; chất chuẩn định tính cần đặc trưng cho chi hoặc giúp phân biệt các loài. Yêu cầu độ tinh khiết sắc kí: > 95% cho chất chuẩn định lượng, > 90% cho chất chuẩn định tính.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Phân lập và tinh chế

Từ 168 g cao cồn khô quả Chả chôi, tác giả tiến hành phân lập trên cột silica gel qua nhiều giai đoạn. Kết quả thu được theo từng bước:

Phân đoạn/chất	Nguồn gốc phân lập
Cleistantoxin (thô)	PĐ7–8–9–10 (PĐ7) trên cột silica gel
Cleisindoside D	PĐ16 trên cột silica gel
CT1 và CT7	PĐ11–12–13–14–15 trên cột silica gel
CT2 và CT6	PĐ19–23 trên cột silica gel

Sắc ký đồ (SKĐ) được dùng để phát hiện cleistantoxin trong các phân đoạn từ PĐ1–14 và cleisindoside D từ PĐ12–23. Tổng cộng phân lập được nhiều chất tinh khiết, bao gồm: cleistantoxin, cleisindoside D, cleisindoside A, neo-cleistantoxin, CT1 (7',8'-dehydrocleistantoxin), CT2, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 — trong đó một số là chất mới. Cấu trúc được khẳng định qua bộ phổ COSY, HMBC, NOESY (Hình 3.7, 3.8, 3.10, 3.12, 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18, 3.20, 3.21, 3.24, 3.27, 3.29, 3.30 theo danh mục hình).

Thiết lập chất chuẩn gốc

Kết quả tính chất lý hóa của hai chất chuẩn định lượng (Bảng 3.5 và 3.6):

Chỉ tiêu	Cleistantoxin	Cleisindoside D
Hình thức	Bột kết tinh màu trắng	Bột màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy (DSC)	Ghi theo Bảng 3.8	Ghi theo Bảng 3.8
Góc quay cực [α]D²⁰	−148,0 (c 0,5; CHCl₃) [82]	−188 [83]
Độ tinh khiết SK (LOD phát hiện)	Bảng 3.15	Bảng 3.15

Chương trình sắc kí HPLC/DAD xác định độ tinh khiết (Bảng 3.11, 3.12): LOD của cleistantoxin đạt 0,05 µg/mL; LOD của cleisindoside D đạt 0,1 µg/mL. Khoảng tuyến tính và dung dịch định lượng ở nồng độ 1000 µg/mL được khảo sát và đánh giá độ lặp lại (Bảng 3.14, 3.16).

Kết quả thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí (Bảng 3.13): đánh giá độ ổn định hệ thống và các điều kiện sắc kí. Độ lặp lại dung dịch cleistantoxin và cleisindoside D ở nồng độ 1000 µg/mL ghi nhận ở Bảng 3.16. Bảng 3.17 ghi nhận độ chính xác trung gian. Bảng 3.18 ghi nhận độ ổn định dung dịch. Tạp bay hơi xác định bằng TGA (Bảng 3.19); tạp vô cơ bằng tro sulfat (Bảng 3.20). Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D lần lượt ở Bảng 3.21 và 3.22.

Đánh giá độ đồng nhất lô đóng ống (Bảng 3.23); độ tinh khiết sắc kí sau đóng ống (Bảng 3.24); tạp bay hơi sau đóng ống (Bảng 3.25); tạp vô cơ sau đóng ống (Bảng 3.26); hàm lượng công bố trên ống chuẩn (Hình 3.45); nghiên cứu độ ổn định ống chuẩn (Bảng 3.27).

Chất chuẩn định tính: cleisindoside A và 7',8'-dehydrocleistantoxin (CT1). Tính chất ghi nhận ở Bảng 3.28–3.36 bao gồm góc quay cực riêng, nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ IR, UV, HR-ESI-MS và ¹H, ¹³C-NMR. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn định tính cleisindoside A (Bảng 3.34) và 7',8'-dehydrocleistantoxin/CT1 (Bảng 3.35).

Xây dựng phương pháp định tính và định lượng

Chương trình gradient tách hỗn hợp 4 chất (Bảng 3.37). Điều kiện chiết mẫu dược liệu được khảo sát qua hàm lượng cleistantoxin và cleisindoside D chiết bằng các hệ dung môi khác nhau (Hình 3.55) và các kỹ thuật chiết khác nhau (Hình 3.56); sơ đồ quy trình chiết đồng thời xây dựng và mô tả ở Hình 3.57. Định tính 4 lignan bằng HPLC/DAD với 4 chất chuẩn đã thiết lập.

Kết quả thẩm định phương pháp định lượng đồng thời (6 lần tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp, Bảng 3.38):

Chỉ tiêu	Cleisindoside D	Cleistantoxin
Khoảng nồng độ tuyến tính	Bảng 3.39	Bảng 3.39
Độ lặp lại (% RSD)	Bảng 3.40	Bảng 3.40
Độ tái lặp (% RSD)	Bảng 3.41	Bảng 3.42
Độ đúng (% phục hồi)	Bảng 3.43	Bảng 3.44

Kết quả hàm lượng cleisindoside D và cleistantoxin trong quả các loài thuộc chi Cách hoa được trình bày ở Bảng 3.45. SKĐ định tính 4 lignan trong quả một số loài thuộc chi Cách hoa thể hiện ở Hình 3.60.

Chương 4. Bàn luận

Chương bàn luận được cấu trúc song song với kết quả nghiên cứu, lần lượt thảo luận về: (4.1) phân lập thô trên cột silica gel và lý do chọn phân đoạn; (4.2 và 4.3) phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleistantoxin và cleisindoside D — so sánh dữ liệu phổ thu được với tài liệu công bố [82], [83]; (4.4) khẳng định cấu trúc cleisindoside A; (4.5) các chất mới phân lập; (4.1 phần thiết lập) bàn về lựa chọn phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance) để xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc; (4.2a) thiết lập chất chuẩn gốc định lượng; (4.2b) tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn định tính cleisindoside A và CT1; (4.3) bàn luận về xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Theo mục "Những đóng góp mới của luận án" (trang 146), luận án tự nêu các đóng góp sau:

Về lý luận và khoa học:

• Lần đầu tiên tại Việt Nam thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D từ quả cây Chả chôi (Cleistanthus tonkinensis) theo quy trình đầy đủ của ISO GUIDE 35 và hướng dẫn IP, WHO, USP — bao gồm xác định tạp hữu cơ (HPLC/DAD), tạp bay hơi (TGA/DSC) và tạp vô cơ (tro sulfat).
• Thiết lập hai chất chuẩn gốc định tính cleisindoside A và 7',8'-dehydrocleistantoxin (CT1).
• Xác định cấu trúc một số chất mới phân lập được từ quả cây Chả chôi.
• Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng (phổ IR, UV, HR-ESI-MS, ¹H và ¹³C-NMR, góc quay cực, nhiệt độ nóng chảy) cho bốn chất chuẩn.

Về thực tiễn:

• Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính đồng thời 4 lignan trong quả các loài thuộc chi Cách hoa bằng HPLC/DAD sử dụng 4 chất chuẩn đã thiết lập.
• Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin trong quả Chả chôi bằng HPLC/DAD, áp dụng để xác định hàm lượng trong quả một số loài thuộc chi Cleistanthus (Bảng 3.45).
• Cung cấp cơ sở chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm cao khô Cleistanthus đang được nghiên cứu phát triển thành nguyên liệu thuốc.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi nghiên cứu được trình bày trong văn bản, một số giới hạn có thể nhận thấy:

• Phương pháp định lượng được xây dựng và thẩm định trên mẫu quả Chả chôi (C. tonkinensis) và bước đầu áp dụng trên quả Cách hoa eberhardt (C. eberhardtii), chưa áp dụng toàn diện trên tất cả các loài trong chi Cleistanthus tại Việt Nam.
• Nghiên cứu độ ổn định ống chuẩn cleistantoxin và cleisindoside D (Bảng 3.27) mới ở giai đoạn ban đầu; cần theo dõi dài hạn để xác định hạn dùng của chất chuẩn.
• Luận án tập trung vào thiết lập chất chuẩn gốc; các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng tiếp theo của cao khô nằm ngoài phạm vi nghiên cứu.
• Chất chuẩn định tính CT1 (7',8'-dehydrocleistantoxin) được phân lập với hàm lượng có hạn từ quả Chả chôi.

Hướng tiếp theo tác giả ngầm định qua phần "Kết luận và kiến nghị" (trang 147): tiếp tục theo dõi độ ổn định dài hạn của chất chuẩn đã thiết lập; áp dụng phương pháp định tính, định lượng để kiểm nghiệm cao khô Cleistanthus trong các giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng.

---

Giá trị tham khảo

Đối với nghiên cứu sinh và giảng viên trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc và hóa phân tích: Chương 1 (mục 1.3 về tổng quan chất chuẩn) và Chương 2 (phương pháp nghiên cứu) cung cấp hệ thống khái niệm và quy trình thiết lập chất chuẩn gốc theo ISO GUIDE 35, IP, WHO và USP — có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo phương pháp luận cho các đề tài thiết lập chất chuẩn gốc từ hợp chất thiên nhiên khác.

Đối với người làm thực hành kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc: Phần thẩm định phương pháp HPLC/DAD định tính và định lượng đồng thời các lignan (Chương 3) trình bày chi tiết điều kiện sắc kí, quy trình xử lý mẫu và tiêu chí chấp nhận — có thể tham chiếu khi xây dựng phương pháp kiểm nghiệm cho các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu chi Cleistanthus.

Đối với nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên: Danh mục hình từ Hình 3.7 đến Hình 3.32 (tương tác COSY, HMBC, NOESY) cùng dữ liệu phổ NMR ¹H và ¹³C của các chất CT1–CT8 và chất đã biết là nguồn tham chiếu phổ cho các hợp chất khung aryltetralin lignan.

Đối với người làm chính sách trong lĩnh vực tiêu chuẩn hóa thuốc: Phần tình hình thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam (Chương 1) mô tả hiện trạng VKNT TƯ và VKNT TP.HCM, có thể tham chiếu khi xây dựng lộ trình phát triển chất chuẩn gốc từ dược liệu trong nước.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao lại chọn quả cây Chả chôi (Cleistanthus tonkinensis) thay vì hai loài còn lại trong chi để phân lập nguyên liệu thiết lập chất chuẩn?

Văn bản cho biết quả cây Chả chôi có hàm lượng hai hoạt chất cleistantoxin và cleisindoside D cao nhất trong ba loài được khảo sát (C. indochinensis, C. tonkinensis và C. eberhardtii). Đây là tiêu chí chính để lựa chọn nguồn nguyên liệu cho phân lập với lượng đủ lớn phục vụ thiết lập chất chuẩn.

2. Hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D có độ tinh khiết như thế nào, và được xác định bằng phương pháp nào?

Theo yêu cầu nêu ở Chương 2, chất chuẩn gốc định lượng phải có độ tinh khiết sắc kí > 95%. Độ tinh khiết được xác định bằng phương pháp cân bằng khối lượng: tạp hữu cơ bằng HPLC/DAD (chuẩn hóa diện tích), tạp bay hơi bằng TGA/DSC (lượng mẫu 10–20 mg), tạp vô cơ bằng tro sulfat. Giá trị cụ thể ghi nhận ở Bảng 3.19, 3.20, 3.21 (cleistantoxin) và Bảng tương ứng cho cleisindoside D.

3. Phương pháp HPLC/DAD định lượng đồng thời cleistantoxin và cleisindoside D trong mẫu quả được thẩm định theo những chỉ tiêu nào, và kết quả LOD là bao nhiêu?

Phương pháp được thẩm định các chỉ tiêu: độ ổn định hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD (cleistantoxin: 0,05 µg/mL; cleisindoside D: 0,1 µg/mL theo Hình 3.38), LOQ, độ lặp lại, độ tái lặp và độ đúng trên mẫu thực (Bảng 3.40–3.44). Độ tinh khiết pic của cleisindoside D và cleistantoxin trong dung dịch chuẩn, thử và thử thêm chuẩn được kiểm tra bằng phổ 3D DAD (Hình 3.42, 3.43, 3.44).

4. Cơ chế gây độc tế bào ung thư của cleistantoxin và cleisindoside D là gì, và kết quả thử nghiệm in vivo trên chuột Nude ra sao?

Theo mô phỏng tính toán trong văn bản, hai hợp chất tương tác với ba con đường apoptosis: nội bào, ngoại bào và con đường qua kênh Perforin/granzyme B. Ái lực mạnh nhất với PARP-I: cleisindoside D cho ái lực −10. Thử nghiệm in vivo trên chuột Nude mang u phổi người: sau 6 tuần, nhóm CT-HSB 2 (100 mg/kg) có 100% chuột còn sống, thời gian sống kéo dài hơn nhóm chứng 45,43%; nhóm CT-HSB 1 (50 mg/kg) còn 60% chuột và thời gian sống dài hơn 21,14%; nhóm chứng còn 20% chuột.

5. Sự khác nhau giữa chất chuẩn gốc (PCRS) và chất chuẩn thứ cấp (SCRS) là gì, và tại thời điểm luận án thực hiện, Việt Nam đang ở mức độ nào trong thiết lập chất chuẩn?

Theo ICH Guideline Q7 và WHO được trích dẫn trong luận án: PCRS là chất được xác định đầy đủ đặc tính bằng nhiều kỹ thuật phân tích độc lập, giá trị ấn định không cần so sánh với chất chuẩn khác; SCRS là chất được xác định bằng cách so sánh với PCRS. Tại Việt Nam, VKNT TƯ và VKNT TP.HCM chủ yếu thiết lập chất chuẩn thứ cấp; VKNT TƯ cung cấp 10 chất chuẩn thứ cấp từ dược liệu và hàng trăm chất tân dược; VKNT TP.HCM cung cấp 213 chất tân dược và 18 chất từ dược liệu (tính đến tháng 8/2018). Hầu như chưa có công bố về thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam trước thời điểm luận án này.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Lâm Hồng (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2019) giải quyết vấn đề thiếu chất chuẩn đối chiếu cho hai hoạt chất aryltetralin lignan — cleistantoxin và cleisindoside D — phân lập từ quả cây Chả chôi (Cleistanthus tonkinensis) có hoạt tính kháng ung thư đã được ghi nhận. Công trình thiết lập lần đầu tiên hai chất chuẩn gốc định lượng và hai chất chuẩn gốc định tính theo quy trình ISO GUIDE 35 với đầy đủ ba nhóm tạp (hữu cơ, vô cơ, bay hơi), lấp khoảng trống mà trước đó Việt Nam chưa có công bố về thiết lập chất chuẩn gốc. Trên cơ sở bốn chất chuẩn này, phương pháp HPLC/DAD định tính và định lượng đồng thời được xây dựng, thẩm định và áp dụng trên mẫu quả thực, tạo tiền đề cho kiểm nghiệm nguyên liệu thuốc và cao khô đang trong giai đoạn nghiên cứu phát triển. Nghiên cứu thuộc chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất, kết hợp hóa học hợp chất thiên nhiên với phân tích dược phẩm, và được tài trợ bởi Đề tài độc lập cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I. TINH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHI CÁCH HOA TREN THÊ GIỚI VÀ TAI VIET NAM 1. Tong quan vé chi Cach hoa (Cleistanthus) LLLL I† trí phân loại Theo APG, chỉ Cach Hoa (Cleistanthus) duge phan loai nhu sau; Thire vat c6 hoa (Angiosperms) Thye vat hai 1a mam that sw (Eudicots) Nhánh Họa hỏng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Ho Thau pau (Euphorbiaceae) 1. Ho Théu Dat (Euphorbiaceae) ¢ Ho Thay Dau (Euphorbiaceae) hay con goi 14 ho DajKich là một họ lớn của thực vật cỏ hoa với 240 chi và khoảng 6000 loät, được chia thành 5 phan họ bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae.

Euphorbioideae, Oldfieldioideaeøwả Phyllanthoideae. Ba phan ho dau tién 1a các. phân họ một lá mâm trồng khi bai phân họ sau là hai lá mam. Phan lớn là thân cây thao, ở khu vực nhiệt đới cũng tôn tại các loài cây bụi hoặc cây Thân gỗ.

phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [2]. Chi Cach hoa (Cleistanthus) Ch#'Cach hoa (Cleistanthus) la mot chi thuộc họ Thầu dà##thường phân bố ở các vùng nhiệt đới, cựu lục địa [6]. Một số công trinh nghiên cứu trên thẻ giới cho thầy đây là clại chứa nhiều hợp chất có hoạt tínhỉ sinh học lý thủ như hoạt tính chông ung thư, chống oxy hóa. kháng vị sinh vật.

Cleistanthug (do chit latin cleisto, tir chit Hy lap kleistos: déng, khong mé va anthos: hoa) — cách hoa. La cay 26 hay nhữ, lắ mọc so le xếp hai dãy, nguyễn. Cụm hoa ở nách lá, thành xim doh hode fÕng, nhiều hoa hoặc ít hoa: lá bắc thường ngắn hơn hoa: hoa không cuồng hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở góc. Hoa đực có 4-6 lá đài, thường 14 5, xép van.

Cánh hoa 5Š nhỏ. thường nguyễn. Đĩa mặt phăng hay lỗi. Bầu không lông hoặc có lông nhung.

Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lưng: hạt hình trứng - 3 góc. Chi Cleistanthus 66 khoaig 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phí, sang châu Á (An Độ). theo sách “Cây có Việt Nam" của tác giả Phạm Hoang H6 thi chi Cleistanthus cd 14 loai [6] và theo sách “Taxonomy of Euphorbiaceae in Vietnam” cia tac gia Nguyen Nghia Thin co 11 loai do một số loài là dong vat (synonym) [61] 46 la: C. acuminatns : Cach hoa nhon C.

concinnus Croiz ; Cach hoa ca C.ex Croiz : Cách hoa đông đương €. annamensis Gagn : Cách hoa ganep C. eberhardtti (Gagn) Croiz : Cách hoa eberhardt C.tonkinensis Jabl : Cha chdi, coe rao C_ sageretoides Merr : Cach hoa dang Chanh chau C. Arg: Cach hoa Sumatra C.

longipedicellatus : Cach hoa cong dai C. myrianthus Kurz : Cách hoa nhiều hoa C. Ex Croiz £ Cach hoa Peteloti C.f ; Cach Woa phiin C. tometosus Hana : Cách hoa đầy lông C.

: Cách hoa Pierre 1. Đặc điểm thực vật của một số loài trong chi Cleistanthus s* Loài Cách hoa dong-dwomg (C. indochinensis Merro ex Croiz.,) Cay Cach hoa déng durong cé tén khoa hoe 14 Cleistanthus indochinensis Mert, ex Croiz "là cây tiểu mộc, lá có phiển bẩu dục thon, to 8- 14 x 3,5 “Š em, đầu có đuôi đài 1-1. đáy tà, gân phy 8-9 cặp.

Hoa cỏ lá đài 5. cao 4,5 mm, canh hoa 5, dĩa mật tiêu nhuy 5, cái lép ở hoa đực, hoa'eái ngũ phân. Nang cao 1 em: mảnh 3-4. có vôi côn lại chế hai.

Cây phân bỏ ở nơi rất âm miền Bắc và miễn Trung nước tạ như Hoa Binh. “ Loai Cha chéi (Cleistantinis tonkinerigis Jabl.,) Cay Chà chội có tên khoa hoc Clerstanthus tonkinensis Jabl, cay 36 nhé cao 1 - 3 m: nhanh Ling. Phién 14 tron dai, to 7- 13 x 2- 5 em, chót có mũi nhọn, đáy tròn. cứng, lắng, gan phẾ 7 - 8 cặp: cuống, 1 di.

Chim hoa cao | - 1,5 cm; hoa nho, khéng cong: canh hoa 5. to 1 mm, tiéu nhụy Š, nhụy cái lép: hoa cái không cọng. cảnh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông, Nang (quả) xoan. cao 1,3 cm, nau den, nở làm 3 mánh: hột hoe, cao 7 mm.

Cây phân bỏ ở khu vực rừng trên da vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Ha Tinh [6]. s* Loài Cách hoa eberhardt (Cleistanthus eherhardtii Gagn.) Cây Cách hoa eberhardt ¢6 tén khoa hoe la Cleistanthus eberhardtii Gagn, la loại cây đại mộc. không lỏng, nhánh mảnh, Lá có phiên bầu dục thon, đài đến 14em, đầu có mũi dai, day tà tròn. móng, gân phụ 7 - 9 cặp.

cuông ngắn, lá bẹ tam giác cao 2 - 3 mm, máu rụng, Chụm 3 dén 5 hoa, không cọng, lá hoa cao 4 mm, hoa cé 5 cảnh hoa nhỏ. 5 tiêu nhuy quanh noãn sao lép; hoa cái có noãn sảo có lông. Cây phần bố ở Thừa Thiên Huẻ [6]. Cảy Cách hoa đông dương (a), Cha chéi (b), Cach hoa eberhardt (c} 1.

Tình hình nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính kháng ung thư của chi Cleistanthus trén thế giới và tại Việt Nam 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ¢ Chỉ Cieistanthux có ngưỗn góc từ châu Phi, Ân Độ, Uc, bao gom khoang 140 loài. nhưngschi cỏ năm loài: C. sehleclteri var, Schlechteri & Nam Phi.

6 Thai Lan va C. indochinensis & Việt Nam đã được nghiên cứu thành phan hóa học. chủ yêu là các hợp chất nhỏm arylnaphthalide lignan, aryltetralin. furofuranoid, dibenzylbutan lignan vả được ghièn cứu khả năng gây độc tẻ bào trén in vitro’ va in vivo.

s* Lodi Gteistantins collinus Roxb & An dé = Cleistanthus collimis: một loài cây có độc tính cao được tìm thấy ở Nam Án Độ, tắt cả các bộ phân của cây đều có độc tỉnh đối với người, động vật và độc tố chính được tìm thấy tử các phần khác nhau €úa thực vật là lignan laeton, diphyllin và #lyeosid như cleistanthin A và B. Qua tông quan các tải liệu về loài Cleistanthus collinus cho thay loai cây là nguồn thực vật quí có tiêm năng được lý. Nhiêu tac gia đã nghiên cứu các phân đoạn va chất tinh rge phan lập có khả năng ức chẻ sự phát trién cdc dong té bao ung thu trén /n vitro va in vivo [12], [63]. 'Thamburaj Suman và cộng sự đã thứ tác dụng gây độc tế bao in vitro của các dịch chiết và các phân đoạn nước, methanol, etthy] acetat (100 g/mL) ter bot lá khô Clestanthus collimis Roxb (Virallimalai, An D6).

cd kha năng kiểm soát đáng kẻ sự phát triển của đỏng tiền té bao m6 mG 3T3-L1 trong thoi gian u 48 giờ [75]. nhiều tác già đã tiên hành nghiên cứu hoá thực vật đã phát hiện trong lá cây có các thành phân như: eleistanthin A. trong lõi gỗ cây có: taiwanin C_ E eleistanhin E,:. Các thứ nghiệm trên in vitro cho thay cleistanthin A có tac dung khang dong té bảo ung thư biêu mô KB và ung thư biêu m6 vom hong SiHa [68].

cleistanon tac dung dong TB ung the MT>. với giá trị LD‹o la 38.1 1M so với chat đổi chứng etoposid là 22. Cleistanthin A va B c6 cầu trúc tương tự nhau đã được nghiên cứu tác đụng được lí và cơ chế độc tính tẻ bảo, cả 2 chất được dự đoản cỏ khả năng chồng ung thư [63] và hạ huyết áp [64]. collinus va cau tric cite cleistanthin A (a) cleistanthin B (b) Cleistanifiin A va cleistanthin B durge tiếp tục nghiên ứu khả năng chống ung thư trên động vật so với thuốc chong ung thu.

Cleistanthin A co hicu qua kim git su phat triển khối u Ở những con chuột có chứa u lympho cô tử cúng Dalton va khdi u rắn S-180, khỏi u được giảm đáng kẻ và tăng tuôi thọ của chuột tương tự như nhóm điều trị băng cisplatin WA etoposid [69]. Cleistanthin B thir in vivo với đồng ung thư biểu mô có tứ cung cla Ehrlich (EAC) và tế bảo ưng thireta Dalton (DAL) dé tao ra khéi u co tir cung ác tính và khôi u rắn trên chuột abino Swiss. Chuột được diéu tri bangeleistanthin B tiém ba liêu là 25, 50 và 100 mg/kg trong 10 ngày số với thuốc đối chimg 5-fluorouracil (5- FU) 20 mg/kg Ket qua cho thay cleistanthin B 6 liều 50 mg/kg cô hoạt tính kháng u dong EAC va DAL nhumg khéng hiệu qua nhur 5-FU {81}. Từ kết quả #ghiên cứu vẻ loài Clestanthus collinus Roxb tai An Dé cho thay, loai cay nay durge nghiễn,cửu rất kĩ lưỡng từ sảng lọc tửng dịch chiết va phan đoạn thử hoạt tính gây độc tế bao trérfin vitro tiếp đó phân lập tìm được các chat tinh khiết, xác định cau trúc và thứ hoạt tính kháng tế bào ung thư trên / viø.

trong đó noi bat là 2 chat cleistanthin A va B. Cac chat nay đã được nghiên cứu tìm đích tác đụng và dự đoán tác dụng dược lí cũng như độc tính của chúng. Hai ứng viên cleistanthin A va B sau khi dự đoán được tác dụng theo đích đã được tiên hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên chuột đều cho kết qua rat khả quan so với nhóm thuốc đối chứng. Các ứng viên này có thể được tiếp te nghiên cứu thứ lâm sảng trên người.

Đây là hướng nghiên cứu phát triển thuốc mới và thuốc có nguôn gốc từ tự nhiên đang được thực hiện trên thê giới. s* Loài Cleistanthus patulus (Afteell) Từ lõi gỗ loài cay Cleistanthus pafuis (Muell) đã phân lập được các hoạt chất cleistanthosid À và B, taiwanin C, cleistanthm A. Hợp chat cleistanthin A đã được thứ hoạt tính trèn / vitro va in vive [68]. % Lodi Cleistanthus boivinianus (Baill) & rimg Madagascar: Trong chương trình nghiền cứu của tô chức hợp tác đa đạng sinh học quốc tế Madagascar (ICBG).

dịch chiết ethanol của thân cay Cleistanthus boivinianus (Baill.) MalL Arg, được tìm thấy có hoạt tính ức chế sự phát triển trung bình với đông tế bào ung ther buông trứng A2780 (ICso 4,5 Hg/mL) và được lựa chọn đề đánh giả tác nhân chong ung thư mới. Tử dịch chiết EtOAAe của loài cây này, đã phân lập được hai lignans mới là: hợp chất (1) 3ø-O- (8- -D-glucopy ranosy!) đesoxypodophyllotoxin có tác dụng kháng lại sự phát triển của dong tế bao ung thư buông trứng .\27§0, với ICso giá trị tương ứng là 33,0 + 3,6, 63.7 và 230 + 1 nM và hoạt tính kháng mạnh sự phát triển của dong t bao ung thư biểu mỏ HCT-]16 ở người vó# giá trị ICso là 20,5 nM. Hợp chất (2) 4-O- (B-D-glucopyranosyl) dehydropodophyllotoxin có tác đụng kháng lại sự phát tiên của đồng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở mực trung bình với các gid trị ICso là 2.3, Cay ol le(stanthux boivinianus và cẩu trúc một số chất phản lập được 1. Tình hình nghiêẪ cứu cứu tại Liệt 'Vam ` Trong khuôn khổ của dự án *Nghiễn cứu sảng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ tham thực vật Việt Nam”, Viện Hỏa sinh biên, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam phỏi hợp với Viện Hóa học HCTN - Cộng hòa Pháp CNRS đã phát hiện dịch chiết E(OA€ của quả cây Cách hoa Đông Dương (C.) va Cach hoa eberhardt (C.