Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của hợp chất trong cao chiết n-butanol của lá loài Cáp Đồng Văn (Capparis dongvanensis Sy)

Luận văn hoạt tính ức chế tế bào ung thư của cao chiết n-butanol lá loài cáp Đồng Văn

• Tác giả: Đinh Thị Hoài
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Văn Khang
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của hợp chất trong cao chiết n-butanol của lá loài Cáp Đồng Văn (Capparis dongvanensis Sy)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn

Cáp Đồng Văn có tên khoa học là Capparis dongvanensis Sy. Thực vật này thuộc họ Màng màng Capparaceae. Loài cây phân bố chủ yếu tại vùng núi đá vôi tỉnh Hà Giang. Y học cổ truyền thường dùng thân, rễ và lá cây để điều trị bệnh phong thấp và viêm khớp. Nghiên cứu hóa thực vật hiện đại phát hiện nhiều hợp chất thứ cấp trong lá cây. Các nhóm chất chính gồm alkaloid, flavonoid, glucosinolate và polyphenol. Trong đó, phân đoạn dịch chiết n-butanol thể hiện hoạt tính sinh học vượt trội. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn thu hút sự chú ý của giới y dược học. Thử nghiệm thực nghiệm chứng minh cao chiết phân đoạn có khả năng ngăn cản quá trình phân bào của khối u. Cấu trúc hóa học của các phân tử tự nhiên tạo ra tương tác phân tử đặc hiệu. Hiện tượng này ức chế chu kỳ tế bào ung thư. Dữ liệu từ luận văn khẳng định giá trị dược liệu của loài thực vật đặc hữu Việt Nam. Việc khai thác tiềm năng hóa học giúp mở ra hướng đi bền vững trong tầm soát dược chất tự nhiên.

1.1. Đặc điểm thực vật học của loài cáp Đồng Văn

Cáp Đồng Văn là cây bụi leo hoặc cây gỗ nhỏ thân hóa gỗ. Cành non thường mảnh, có gai nhỏ cong gập xuống. Lá cây mọc so le, phiến lá dai hình bầu dục thuôn dài. Cuống lá ngắn, gân lá nổi rõ ở mặt dưới. Hoa mọc thành cụm ở nách lá hoặc đầu cành. Quả mọng hình cầu chứa nhiều hạt. Cây thích nghi trên các vách đá vôi khắc nghiệt tại cao nguyên đá Đồng Văn. Khí hậu khô lạnh tạo điều kiện tích lũy nhiều chất trao đổi cấp hai. Mẫu lá thu hái phục vụ nghiên cứu cần đảm bảo độ đồng nhất về tuổi sinh lý. Thổ nhưỡng đặc thù tạo nên đặc tính chuyển hóa riêng biệt.

1.2. Thành phần hóa thực vật phong phú của chi Capparis

Chi Capparis sở hữu kho tàng hợp chất tự nhiên đa dạng về cấu trúc. Các tài liệu quốc tế ghi nhận nhiều khung sườn hóa học quý hiếm trong chi này. Alkaloid là nhóm chất đặc trưng với các dẫn xuất stachydrine, cadabicine và capparisine. Nhóm flavonoid phong phú bao gồm quercetin, rutin và kaempferol. Ngoài ra, glucosinolate và isothiocyanate tạo nên hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Sterol thực vật như beta-sitosterol và daucosterol xuất hiện phổ biến trong dịch chiết thân lá. Sự kết hợp giữa các nhóm chất này đem lại hiệu ứng kháng viêm và chống oxy hóa cao. Nghiên cứu sâu về lá cáp Đồng Văn làm rõ mối liên hệ giữa nhóm polyphenol và tác dụng bảo vệ tế bào. Đây là cơ sở khoa học mở rộng kiểm tra hoạt tính kháng ung thư.

II. Phân tích hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn

Ung thư vẫn là nguyên nhân tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu. Hóa trị liệu hiện hành thường gây độc tính nặng nề lên các cơ quan nội tạng. Tình trạng kháng thuốc hóa trị ngày càng lan rộng và phức tạp. Nhu cầu tìm kiếm dược chất mới có nguồn gốc thực vật trở nên cấp thiết. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn cung cấp hướng tiếp cận đầy triển vọng. Phân tích cao chiết n-butanol cho thấy sự tập trung của nhiều hoạt chất phân cực trung bình và cao. Những hợp chất này thể hiện khả năng kìm hãm chọn lọc sự phân chia tế bào bất thường. Việc phân lập gặp nhiều thách thức do hỗn hợp dịch chiết phức tạp. Sự tương đồng về độ phân cực giữa các chất gây khó khăn khi tinh chế. Phân tích cơ chế đòi hỏi xác định chính xác cấu trúc tinh khiết của từng đơn chất. Bỏ qua bước giải mã phổ học sẽ dẫn đến sai lệch trong đánh giá độc tính tế bào. Vì vậy, việc bóc tách từng phân đoạn n-butanol đóng vai trò then chốt.

2.1. Thách thức phân tách hợp chất trong cao chiết n butanol

Phân đoạn n-butanol chứa lượng lớn hợp chất phân cực và bán phân cực. Sự hiện diện đồng thời của saponin, đường và glycoside cản trở quá trình kết tinh. Sắc ký lớp mỏng thường ghi nhận các vết chất dính liền và kéo đuôi. Điều kiện rửa giải đòi hỏi tối ưu hóa tỷ lệ dung môi nghiêm ngặt. Hệ dung môi dichloromethane kết hợp ethanol hoặc methanol cần được cân chỉnh tinh vi. Lựa chọn chất hấp phụ silica gel thích hợp quyết định độ thu hồi hoạt chất sạch. Sự phân hủy nhiệt trong quá trình cô quay chân không cũng là rủi ro hiện hữu. Kiểm soát nhiệt độ bay hơi dưới 50 độ C bảo toàn nguyên vẹn cấu trúc hóa học nhạy cảm.

2.2. Vấn đề kháng thuốc và nhu cầu tìm kiếm hoạt chất tự nhiên

Các dòng tế bào ung thư thường biến đổi để kháng lại các thuốc hóa trị truyền thống. Cơ chế kháng thuốc liên quan đến bơm tống thuốc P-glycoprotein và đột biến gen kháng chết tế bào. Tình trạng này làm giảm hiệu quả điều trị lâm sàng và tăng tỷ lệ tái phát. Độc tính không mong muốn của thuốc tổng hợp còn làm suy kiệt hệ miễn dịch người bệnh. Các phân tử tự nhiên từ thực vật mang cấu trúc lập thể phức tạp và độc đáo. Chúng có khả năng tương tác đồng thời với nhiều đích phân tử trong khối u. Cơ chế tác động đa mục tiêu giúp giảm thiểu nguy cơ phát sinh kháng thuốc. Do đó, việc khai thác hợp chất từ lá cáp Đồng Văn đáp ứng trúng nhu cầu phát triển dược liệu hiện đại.

III. Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn

Quy trình nghiên cứu áp dụng các phương pháp hóa học và sinh học thực nghiệm hiện đại. Lá khô của loài cáp Đồng Văn được chiết ngấm kiệt với dung môi phân cực. Dịch chiết tổng trải qua quá trình phân bố lỏng-lỏng với n-butanol. Cao n-butanol được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo. Các hệ dung môi phân đoạn gồm dichloromethane và ethanol với tỷ lệ gradient thích hợp. Hợp chất tinh khiết được kết tinh phân đoạn và kiểm tra độ sạch trên bản mỏng TLC. Cấu trúc hóa học được xác định nhờ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR cung cấp số lượng proton và cacbon trong khung phân tử. Phổ tương tác tầm xa HMBC và COSY hỗ trợ xác lập liên kết cấu trúc chính xác. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn được đánh giá qua thử nghiệm MTT hoặc SRB. Thử nghiệm thực hiện trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy in vitro. Kết quả đo quang cho phép xác định chính xác nồng độ ức chế 50% IC50.

3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập sắc ký hợp chất

Bột lá khô được ngâm chiết kiệt với dung môi cồn ở nhiệt độ phòng. Dịch cồn được cô đặc thành cao tổng dưới áp suất giảm. Cao tổng hòa tan lại trong nước rồi chiết phân bố lần lượt với n-hexan, ethyl acetate và n-butanol. Cao phân đoạn n-butanol thu được với khối lượng lớn được nạp lên cột sắc ký silica gel. Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi gradient dichloromethane và cồn 90 độ tăng dần độ phân cực. Các phân đoạn nhỏ được thu gom và gộp lại dựa trên tín hiệu phân tích TLC. Các hợp chất mục tiêu kết tinh dạng chất rắn màu trắng ngà hoặc màu vàng. Tinh chế lặp lại bằng sắc ký cột giúp đạt độ tinh khiết cao phục vụ đo phổ.

3.2. Xác định cấu trúc NMR và đánh giá hoạt tính sinh học

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được giải mã bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều. Phổ 1H-NMR cung cấp tín hiệu các nhóm thế methyl, methoxy và proton vòng thơm. Phổ 13C-NMR chỉ rõ độ chuyển dịch hóa học của từng nguyên tử cacbon trong mạch. Tương tác dị hạt qua nhiều liên kết trên phổ HMBC giúp gắn kết các mảnh phân tử hoàn chỉnh. Độc tính tế bào được kiểm tra trên các dòng tế bào ung thư in vitro chuẩn. Nồng độ gây chết 50% tế bào IC50 đóng vai trò thước đo so sánh hoạt lực. Các hợp chất từ dịch chiết n-butanol chứng minh khả năng ức chế sinh trưởng tế bào u rõ rệt. Phương pháp thực nghiệm bảo đảm độ lặp lại và tính khách quan cao.

IV. Tiềm năng hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn

Nghiên cứu về lá loài cáp Đồng Văn mang lại nhiều đóng góp khoa học thiết thực. Kết quả thực nghiệm xác nhận sự tồn tại của các hợp chất có hoạt tính sinh học cao trong phân đoạn n-butanol. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư từ lá loài cáp Đồng Văn mở ra triển vọng phát triển dẫn chất kháng u thế hệ mới. Các hợp chất phân lập thể hiện hiệu lực gây độc tế bào ung thư và tính an toàn tiềm năng. Việc bảo tồn và nhân giống loài thực vật đặc hữu này tại cao nguyên đá trở nên cấp thiết. Phát triển nguồn dược liệu quy mô lớn cần đi đôi với quy trình thu hái bền vững. Hướng nghiên cứu tiếp theo đòi hỏi thử nghiệm chuyên sâu trên mô hình động vật sống in vivo. Việc đánh giá dược động học và cơ chế phân tử chi tiết sẽ tạo tiền đề thử nghiệm tiền lâm sàng. Công trình khẳng định giá trị to lớn của hệ thực vật Việt Nam trong nền y học hiện đại.

4.1. Ứng dụng hoạt chất tự nhiên trong sản xuất thuốc kháng u

Hoạt chất tự nhiên từ phân đoạn n-butanol cung cấp tiền chất quan trọng cho hóa dược. Khung cấu trúc hóa học của chúng đóng vai trò mẫu định hướng tổng hợp dẫn xuất mới. Các nhà khoa học có thể tối ưu hóa cấu trúc để nâng cao hoạt lực và giảm độc tính ngoại ý. Nghiên cứu tạo tiền đề phát triển các dạng thuốc viên nang hoặc dung dịch tiêm hỗ trợ ung thư. Kết hợp hoạt chất từ lá cây với thuốc kháng u chuẩn giúp hạ liều hóa trị độc hại. Hiệu ứng cộng hưởng làm tăng độ nhạy cảm của khối u với thuốc đặc hiệu. Đây là hướng phát triển dược phẩm sinh học giàu tiềm năng thương mại hóa.

4.2. Bảo tồn nguồn gen và định hướng phát triển dược liệu sạch

Cáp Đồng Văn phân bố hẹp tại các hệ sinh thái núi đá vôi nhạy cảm. Hoạt động khai thác tự phát có nguy cơ làm cạn kiệt nguồn tài nguyên bản địa. Công tác khoanh vùng bảo vệ quần thể cây mọc hoang dã tại Hà Giang cần được triển khai cấp bách. Song song đó, công nghệ nhân giống vô tính giúp bảo tồn nguyên vẹn nguồn gen quý. Xây dựng các vùng trồng chuyên canh theo tiêu chuẩn GACP-WHO đảm bảo chất lượng dược liệu ổn định. Quá trình thu hoạch lá cây cần tuân thủ chu kỳ sinh trưởng để không làm suy thoái cây mẹ. Sự phối hợp giữa viện nghiên cứu và địa phương sẽ thúc đẩy kinh tế sinh thái bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới chỉ ra khoảng 80% dân số toàn cầu dựa vào các thảo dược tự nhiên để chăm sóc sức khỏe ban đầu, trong đó 11% trên tổng số 255 loại thuốc thiết yếu được phân lập trực tiếp hoặc bán tổng hợp từ thực vật. Tại thị trường Việt Nam, báo cáo của Cục Quản lý Dược thuộc Bộ Y tế cho thấy mỗi năm cả nước tiêu thụ từ 50.000 đến 60.000 tấn dược liệu phục vụ điều chế y học cổ truyền và công nghiệp dược phẩm. Tuy nhiên, việc khai thác hoạt chất mới từ các loài thực vật đặc hữu vùng núi cao vẫn còn nhiều khoảng trống khoa học cần lấp đầy.

Họ Màng Màng trên thế giới sở hữu khoảng 40 đến 50 chi với hơn 900 loài, riêng tại Việt Nam đã ghi nhận 6 chi cùng 55 loài khác nhau. Trong đó, loài Cáp Đồng Văn là một nguồn gen thực vật mới được phát hiện và công bố khoa học vào tháng 10 năm 2017 bởi các nhà nghiên cứu thực vật học tại vùng núi đá vôi tỉnh Hà Giang. Mặc dù các loài trong chi Cáp từ lâu đã được ứng dụng trong điều trị viêm nhiễm và đau nhức xương khớp, dữ liệu về thành phần hóa sinh và tiềm năng kháng u của loài Cáp Đồng Văn trước năm 2022 gần như chưa được khai phá.

Đề tài luận văn thạc sĩ hóa học được thực hiện tại tỉnh Thái Nguyên và tỉnh Hà Giang trong giai đoạn 2021 đến 2022 nhằm giải quyết mục tiêu trọng tâm: phân lập 2 hợp chất hữu cơ từ phân đoạn cao chiết n-butanol, xác định chính xác cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ học hiện đại và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư phổi A549. Công trình hoàn thành với chỉ số trùng lặp văn bản Turnitin ở mức 24%, tạo tiền đề học thuật chuẩn mực trong việc chuẩn hóa nguồn nguyên liệu tự nhiên bản địa và mở rộng hướng sàng lọc thuốc chống ung thư tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được thiết lập dựa trên lý thuyết phân lập hợp chất tự nhiên và phân loại hóa thực vật họ Capparaceae, tập trung vào các nhóm chuyển hóa thứ cấp quan trọng như flavonoid, sterol, alkaloid và glucosinolate. Về mặt xác định cấu trúc, đề tài ứng dụng lý thuyết phổ học phân tử hữu cơ hiện đại, bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều và phổ khối lượng nhằm giải mã các liên kết carbon, hydro cùng cấu hình không gian của phân tử.

Về thử nghiệm sinh học, đề tài vận hành theo mô hình sàng lọc độc tính tế bào in vitro do Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ chuẩn hóa, sử dụng phương pháp đo mật độ quang của phẩm nhuộm protein tế bào. Nghiên cứu tập trung vào năm khái niệm chuyên ngành then chốt: cao phân đoạn chiết xuất, chỉ số nồng độ ức chế 50% tăng trưởng tế bào, độ độc tế bào in vitro, độ chuyển dịch hóa học trên phổ cộng hưởng từ và kỹ thuật đo quang phổ protein tổng số.

Phương pháp nghiên cứu

Quy trình thực nghiệm được triển khai từ nguồn dữ liệu mẫu thực vật thu hái tại vùng cao núi đá Đồng Văn thuộc tỉnh Hà Giang. Cỡ mẫu nghiên cứu ban đầu là 5 kg lá khô, được chọn lọc theo phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên đại diện trong tự nhiên, sau đó sấy khô ổn định ở nhiệt độ 50°C để bảo toàn các liên kết hóa sinh kém bền nhiệt.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích sắc ký cột silica gel pha thường cỡ hạt 63 đến 200 micromet kết hợp hệ dung môi diclometan và cồn 90 độ theo tỷ lệ 4:1 là nhằm tối ưu hóa khả năng phân tách các hợp chất có độ phân cực trung bình và cao trong phân đoạn n-butanol. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết được phân tích trên máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker tần số 500 MHz và máy đo khối phổ thời gian bay. Hoạt tính kháng ung thư phổi A549 được định lượng bằng phép thử nhuộm Sulforhodamine B trên đĩa 96 giếng, ủ trong 48 giờ tại tủ ấm 37°C và đọc mật độ quang học ở bước sóng 515 đến 540 nm trên máy ELISA. Toàn bộ thực nghiệm tinh chế và thử hoạt tính sinh học diễn ra tập trung từ tháng 03 đến tháng 04 năm 2022.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học quan trọng thông qua chuỗi thực nghiệm chuẩn xác:

Thứ nhất, từ 5 kg nguyên liệu lá khô ban đầu thông qua quá trình chiết hồi lưu với cồn 90% ở 70°C trong 3 đợt, mỗi đợt 3 giờ, tác giả đã thu được 650 gam cao cặn ethanol tổng số, đạt hiệu suất chiết xuất tương đương 13,0%. Quá trình chiết phân đoạn kế tiếp bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần đã phân lập được 125 gam cao n-hexane chiếm 19,23%, 95 gam cao ethyl acetate chiếm 14,62% và 135 gam cao n-butanol chiếm 20,77% tổng lượng cao cặn.

Thứ hai, sắc ký cột trên 1 kg silica gel với kích thước cột 9 nhân 100 cm đã phân tách thành công 135 gam cao n-butanol thành 4 phân đoạn chính. Tại phân đoạn thứ hai với 18 ống nghiệm thu thập từ ống 65 đến ống 83, tác giả tinh chế được hợp chất 1 ở dạng chất rắn màu trắng ngà. Tại phân đoạn thứ ba thu từ ống 84 đến ống 101, hợp chất 2 được phân lập thành công ở dạng chất rắn màu vàng.

Thứ ba, dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon của hợp chất 1 xác nhận sự hiện diện của 22 tín hiệu nguyên tử carbon. Trong đó, tín hiệu phổ proton tại độ dịch chuyển hóa học 1,20 ppm đại diện cho nhóm methyl gắn ở vị trí carbon C-4 có độ dịch chuyển 29,68 ppm. Hai nhóm methoxy được định vị rõ nét tại độ dịch chuyển proton 3,83 ppm tương ứng với tín hiệu carbon ở mức 55,97 ppm trên phổ tương quan dị hạt nhân HMBC.

Thứ tư, thử nghiệm sàng lọc độc tính tế bào trên dòng ung thư phổi A549 ở 4 dải nồng độ chuẩn gồm 0,8 microgam/ml, 4 microgam/ml, 20 microgam/ml và 100 microgam/ml sau 48 giờ nuôi cấy đã ghi nhận khả năng ức chế tăng sinh tế bào rõ rệt, đáp ứng các tiêu chuẩn sàng lọc chất tinh khiết có hoạt tính sinh học của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất thu nhận phân đoạn n-butanol đạt 20,77% cho thấy hàm lượng các hợp chất phân cực như glycoside, alkaloid bậc cao hoặc dẫn xuất flavonoid trong lá Cáp Đồng Văn chiếm tỷ trọng rất đáng kể. Khi so sánh với loài Cáp Spinosa trong công bố của các nhà khoa học trước đây vốn chỉ ghi nhận chỉ số ức chế IC50 ở mức 46,546 microgam/ml trên tế bào ung thư gan hoặc 471,53 mg/l trên biểu mô ung thư dạ dày, các hợp chất phân lập từ Cáp Đồng Văn thể hiện tiềm năng tác động trực tiếp lên hình thái và sự nhân lên của dòng tế bào biểu mô ung thư phổi A549.

Trong báo cáo thực nghiệm, dữ liệu được minh họa trực quan qua bảng tổng hợp độ chuyển dịch hóa học và biểu đồ đường cong ức chế tăng sinh tế bào dạng sigmoidal biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chất thử từ 0,8 đến 100 microgam/ml và giá trị mật độ quang đo tại bước sóng 515 đến 540 nm. Sự sụt giảm mật độ quang tỷ lệ nghịch với nồng độ chất 2 minh chứng cơ chế gây độc tế bào thông qua việc làm biến đổi hình thái và gây chết rụng tế bào khối u. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu kháng u của các loài cùng chi Cáp tại khu vực châu Á nhưng cho thấy tính đặc hiệu cao hơn trên dòng mô phổi người.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm thu được, tác giả cùng nhóm nghiên cứu đưa ra 4 giải pháp khoa học mang tính ứng dụng cao:

Một là, tối ưu hóa quy trình trích ly hoạt chất bằng cách ứng dụng công nghệ chiết xuất có hỗ trợ sóng siêu âm hoặc vi sóng nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi phân đoạn n-butanol từ mức 20,77% lên trên 25,0% trong vòng 6 tháng tới, do phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ thuộc Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên chủ trì thực hiện.

Hai là, mở rộng thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên ít nhất 3 dòng tế bào ung thư khác bao gồm ung thư gan HepG-2, ung thư dạ dày SGC-7901 và ung thư buồng trứng SKOV-3 với mục tiêu xác định giá trị IC50 dưới ngưỡng 10 microgam/ml trong giai đoạn 2023 đến 2024, do các nhà khoa học phối hợp cùng Viện Hóa học triển khai.

Ba là, hoàn thiện việc đo phổ khối phân giải cao và nhiễu xạ tia X đơn tinh thể cho hợp chất 2 trong thời hạn 9 tháng nhằm xác định tuyệt đối cấu hình lập thể, hướng tới mục tiêu công bố từ 1 đến 2 bài báo khoa học trên các tạp chí quốc tế chuyên ngành uy tín thuộc danh mục ISI hoặc Scopus.

Bốn là, đề xuất Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Hà Giang phối hợp với chính quyền địa phương triển khai dự án quy hoạch vùng đệm bảo tồn nguồn gen tự nhiên có diện tích từ 50 đến 100 hecta tại cao nguyên đá Đồng Văn trong chu kỳ 2024 đến 2026, ngăn chặn nguy cơ tận diệt cây dược liệu quý khi thương mại hóa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn chuyên sâu cho 4 nhóm đối tượng cụ thể:

Thứ nhất, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Luận văn cung cấp case study thực nghiệm mẫu mực về kỹ thuật chia tách phân đoạn cao chiết từ 5 kg lá khô và phương pháp giải mã cấu trúc phân tử qua hệ thống phổ NMR 500 MHz đa chiều.

Thứ hai, các giảng viên và nhà nghiên cứu thực vật học tại các trường đại học y dược. Tài liệu là nguồn tham chiếu cập nhật về đặc điểm hóa sinh của loài thực vật mới công bố năm 2017, hỗ trợ đối sánh dữ liệu thực vật học giữa 55 loài thuộc họ Màng Màng tại Việt Nam.

Thứ ba, chuyên viên nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các viện nghiên cứu dược liệu và doanh nghiệp sản xuất dược phẩm. Doanh nghiệp có thể khai thác quy trình thử nghiệm độ độc tế bào bằng phương pháp nhuộm SRB trên đĩa 96 giếng để sàng lọc nhanh các hoạt chất kháng ung thư tiềm năng.

Thứ tư, cán bộ quản lý tài nguyên dược liệu và phát triển nông thôn tại tỉnh Hà Giang và các tỉnh miền núi phía Bắc. Công trình cung cấp luận cứ khoa học xác thực giúp xây dựng đề án bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển kinh tế lâm nghiệp dưới tán rừng bền vững.

Câu hỏi thường gặp

Loài Cáp Đồng Văn có điểm gì khác biệt so với các loài thực vật khác trong chi Capparis? Cáp Đồng Văn là loài đặc hữu mới được định danh năm 2017 tại Hà Giang, dạng bụi trườn cao khoảng 10 mét với gai nhọn 1 đến 2 mm và lá hình giọt nước dài 9 đến 16,5 cm. Khác với Cáp gai nhỏ hay Cáp Spinosa vốn phổ biến ở đồng bằng và duyên hải, loài này thích nghi trên núi đá vôi cao độ lớn, tích lũy các dẫn xuất chuyển hóa phân cực có hoạt tính sinh học vượt trội.

Vì sao tác giả lựa chọn phân đoạn cao chiết n-butanol để tiến hành phân lập chất tinh khiết? Phân đoạn n-butanol thu được 135 gam từ 650 gam cao cặn cồn, chiếm tỷ trọng cao tới 20,77%. Khối lượng này đại diện cho nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học phong phú như glycoside và alkaloid hòa tan. Trên bản mỏng sắc ký, phân đoạn n-butanol cho các vết tách rời rõ rệt, tạo điều kiện thuận lợi nhất để thu nhận hoạt chất tinh khiết bằng sắc ký cột.

Phương pháp nhuộm Sulforhodamine B có ưu điểm gì trong đánh giá độ độc tế bào ung thư? Phương pháp SRB được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ công nhận là chuẩn mực nhờ khả năng gắn tĩnh điện chọn lọc với protein tế bào đã cố định bằng axit trichloroacetic. Khác với phép thử MTT phụ thuộc vào hoạt tính enzyme ty thể dễ bị nhiễu bởi các chất khử, kỹ thuật SRB đo quang ở bước sóng 515 đến 540 nm phản ánh chính xác số lượng tế bào khối u sống sót.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất 1 cung cấp những thông tin cấu trúc then chốt nào? Phổ cộng hưởng từ carbon xác định khung phân tử gồm 22 nguyên tử carbon. Các tín hiệu đặc trưng bao gồm nhóm methyl tại vị trí C-4 cộng hưởng ở 29,68 ppm tương ứng với đỉnh proton 1,20 ppm. Hai nhóm methoxy gắn vào vòng thơm được định vị chính xác ở 55,97 ppm nhờ tương quan liên kết qua nhiều liên kết trên phổ hai chiều HMBC.

Tiêu chuẩn nào của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ được áp dụng để kết luận hoạt tính kháng u của mẫu? Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ quy định đối với cao chiết thô, mẫu thử được xem là có hoạt tính kìm hãm tốt khi đạt chỉ số IC50 nhỏ hơn hoặc bằng 20 microgam/ml. Đối với các hợp chất hóa học tinh khiết, ngưỡng hoạt tính đạt chuẩn được xác định khi giá trị IC50 đạt dưới mức 5 micromol, làm căn cứ chuyển giao sang các thử nghiệm tiền lâm sàng tiếp theo.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thành quy trình chiết xuất từ 5 kg lá khô loài Cáp Đồng Văn, thu nhận 650 gam cao cồn tổng số và phân đoạn thành công 135 gam cao n-butanol giàu hoạt tính.
• Phân lập thành công 2 hợp chất hữu cơ tinh khiết ký hiệu chất 1 và chất 2 thông qua sắc ký cột silica gel với hệ dung môi diclometan và cồn theo tỷ lệ 4:1.
• Giải mã thành công cấu trúc hóa học của hợp chất 1 gồm 22 nguyên tử carbon bằng việc phối hợp các phương pháp phổ tiên tiến bao gồm 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và phổ khối lượng.
• Xác định hoạt tính độc tế bào của chất tinh khiết trên dòng tế bào ung thư phổi người A549 thông qua phương pháp đo quang phổ SRB tại dải nồng độ từ 0,8 đến 100 microgam/ml sau 48 giờ nuôi cấy.
• Công trình cung cấp bộ dữ liệu hóa thực vật đầu tiên về loài dược liệu mới, mở đường cho định hướng tổng hợp dẫn chất ức chế khối u và bảo tồn nguồn tài nguyên bản địa vùng núi đá phía Bắc giai đoạn 2023 đến 2025.

Quý độc giả, nhà khoa học và các đơn vị nghiên cứu quan tâm có thể tiếp tục khai thác trọn vẹn dữ liệu phổ nghiệm và quy trình phân tách chi tiết trong toàn văn luận văn thạc sĩ hóa học của tác giả Đinh Thị Hoài tại Thư viện Trường Đại học Sư phạm thuộc Đại học Thái Nguyên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Dược liệu đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người do thuộc tính đặc biệt của chúng như là một nguồn cung cấp vô giá các hoạt chất tự nhiên từ thực vật cho y học. Năm 1985, Farsworth và cộng sự đã xác định được 119 chất chuyển hóa thực vật được sử dụng để làm thuốc. Trong số 255 loại thuốc được coi là cơ bản và cần thiết của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 11% trong số đó là các dược chất thu được từ thực vật hoặc được tổng hợp từ các tiền chất tự nhiên.

Các hợp chất tự nhiên từ thực vật được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, … Hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới, nguyên liệu sản xuất dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên và chiết xuất từ thực vật đang là xu hướng mới nhằm tạo ra các loại thuốc thân thiện với sức khỏe con người và ít tác dụng phụ hơn. Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay vẫn dựa vào các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là sử dụng các chế phẩm, sản phẩm từ dược liệu, kể cả các nước phát triển và đang phát triển. Các loại thuốc được sử dụng trong phòng và chữa bệnh hầu hết được điều chế từ hai nguồn: dược liệu và hóa dược. Không chỉ các nước Á Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng khá lớn dược liệu.

Người ta thống kê thấy rằng ở các nước có nền công nghiệp phát triển mạnh thì ¼ số thuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất từ thảo dược. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục quản lý dược - Bộ Y tế, mỗi năm nước ta tiêu thụ khoảng 50 - 60 nghìn tấn các loại dược liệu khác nhau, sử dụng vào việc chế biến các vị thuốc Y học cổ truyền, cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược hoặc xuất khẩu. Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế rất được các nhà khoa học quan tâm. Nhiều dược liệu đã được sử dụng để tách chiết các hoạt chất để làm thuốc như: chiết berberin từ cây vàng đắng (Coscinium fenestratum), rutin từ hoa hòe (Shophora japonica), morphin từ cây thuốc phiện (Papaver somniferum),… Dược liệu còn mở đường cho ngành hóa dược phát triển, từ việc nghiên cứu các hoạt chất có cấu trúc mới từ dược liệu rồi sau đó 1 bán tổng hợp các dẫn chất có hiệu quả hơn.

Tuy nhiên nhiều hoạt chất quan trọng như quinone, morphin, strychnin,… đều phải chiết xuất từ dược liệu mà chưa thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Loài Cáp Đồng Văn là loài mới được phát hiện và phân loại, thuộc họ Màng Màng. Các loài thuộc chi Cáp đã được sử dụng từ lâu để chữa một số bênh như: viêm nhiễm, đau lưng. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết cao tổng số và hợp chất hóa học được phân lập từ loài thực vật này có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư và bảo vệ tế bào não dưới các tác động gây tổn thương của glutamat, hyperglycemia, beta-amyloid nhằm định hướng chữa bệnh Alzheimer và Parkinson.

Ở Việt Nam, loài Cáp Đồng Văn được nhóm nghiên cứu của PGS.TS Sỹ Danh Thường - Phó trưởng phòng khảo thí và quản lý chất lượng trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên định danh và công bố tên khoa học năm 2017. Hiện nay, loài thực vật này được phát hiện tại Hà Giang và Lào Cai. Đến nay chưa có nhiều công bố về thành phần hóa học của loài thực vật này. Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của hợp chất trong cao chiết n- butanol của lá loài Cáp Đồng Văn (Capparis dongvanensis Sy).

Đề tài này khi hoàn thành sẽ cung cấp các thông tin khoa học giá trị làm cơ sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh và sàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời góp phần vào đào tạo nguồn nhân lực cho vùng núi phía Bắc và cả nước. Mục tiêu của đề tài 1. Phân lập 2 hợp chất từ cao chiết n-butanol.

Xác định cấu trúc 2 hợp chất phân lập được. Đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của hợp chất. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các hợp chất từ cao chiết n-butanol bằng các phương pháp sắc ký pha thuận và pha đảo.

Xác định cấu trúc các hợp chất bằng các phương pháp phổ: 1H-NMR, 13C- NMR, MS, IR, HSQC, HMBC. Tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các hợp chất đã phân lập được. Phƣơng pháp nghiên cứu 4. Phương pháp lý thuyết - Thu thập, tổng hợp, phân tích tài liệu trong và ngoài nước về chi Cáp.

- Phân tích tài liệu để có cơ sở khoa học về phương pháp phân tích mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc, hoạt tính sinh học của mẫu nghiên cứu. Phương pháp thực nghiệm 1. Xây dựng quy trình phân lập hợp chất bằng các phương pháp sắc ký. Dùng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc của hợp chất: 1H-NMR, 13 C-NMR, MS, IR, HSQC, HMBC.

Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Dự kiến kết quả đạt đƣợc - 2 hợp chất phân lập được từ trong mẫu nghiên cứu. - Cấu trúc hợp chất phân lập được - Báo cáo kết quả đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các chất phân lập được. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.

Khái quát về loài Cáp Đồng văn 1. Sơ lược về họ Capparaceae (họ Màng Màng) - Tên khoa học: Capparaceae Juss. - Tên tiếng việt: Màn Màn (Cáp, Màn Màn) hoặc Màng Màng. - Họ Màng Màng gồm các chi: Cleome, Cadaba, Capparis, Sodada, Crateva, Morisonia.

- Capparaceae là một họ của thực vật có hoa chứa khoảng 40-50 chi và khoảng 900 loài cây một năm hay cây lâu năm, bao gồm từ cây thân thảo tới cây bụi hay cây thân gỗ, đôi khi có dạng leo, bò, phân bố ở Nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam Phi (khô hạn). - Cụm hoa chùm với nhiều hoa có mầu sắc sặc sỡ. Hoa đa số mẫu 4. Bầu hay cả bầu và bộ nhị dính trên cuống dài tách xa các cánh hoa.

Quả có chuôi riêng tách biệt với cuống bởi đốt. - Ở Việt Nam họ Màng Màng có khoảng 6 chi, 55 loài với nhiều giá trị kinh tế như làm thuốc, làm thực phẩm (làm rau ăn, lấy quả), lấy gỗ, làm cảnh,… và nhiều giá trị khác. Cáp gai nhỏ Màng màng tím 4 Màng màng trắng Màng màng đẹp (Hồng ri) Màng màng trĩn (Màng màng hoa vàng) Bún trái đỏ Hình 1. Một số hình ảnh các cây thuộc họ Màng Màng 1.

Sơ lược về chi Capparis - Tên khoa học: Capparis. - Tên tiếng việt: Bạch hoa, Cáp. - Capparis là một chi lớn bao gồm từ 250 đến 400 loài, nó thuộc họ Capparaceae, chi Capparis có một số đặc điểm sau:  Dạng sống: Các loài thuộc họ này thường gặp là những cây bụi trườn, bụi đứng, cây gỗ đôi khi là cây bụi leo hay cây thân cỏ. Thân cành non thường có lông, màu nâu đỏ, màu trắng xám hoặc màu nâu vàng, ít khi nhẵn; lông bao phủ thường là lông đơn bào hay đa bào hình sao, lông tuyến.

 Lá: Lá thường nhẵn hay chỉ có lông ở một mặt hoặc có lông ở cả 2 mặt với các dạng lông giống như ở thân và cành. Cuống lá dài, đôi khi có cuống rất ngắn thường lúc đầu có lông hoặc nhẵn, cuống lá thường phù ở phần đỉnh. Một số dạng lá, lá kèm và lá bắc của họ Màng Màng Các dạng lá: 1-9. Lá kép chân vịt 13-14.

Lá kèm dạng gai 15-19. Lá bắc  Cụm hoa: Thường gặp hoa xếp thành hàng trên nách lá mang 1-6 hoa, kích thước cuống hoa thường dài dần từ phía gần gốc lá ra phía ngoài, cụm hoa ngù ở nách lá hoặc ở đỉnh cành.  Hoa lưỡng tính, mọc đơn, có hình dây dù, nách hoặc phần cuối của lá hiếm khi ở trên. Các bẹ lá thường mọc nhiều hơn nhưng quấn nhau sớm.

Các đài hoa gỡ ra hoặc chụm lại tại đáy, mở bằng mảnh vỏ hoặc lợp. Các đài hoa mọc sau thường rộng hơn và lõm hơn các đài khác. Các cánh hoa thường thuôn và khá mỏng, chủ yếu là đầu nhỏ ở phía cuống lá, thường có nhiều lông sau khi nở hoa. Hai cánh hoa sau kết hợp lại với nhau, tạo thành một khối nhô ra ở khoang mật.

Nhị hoa rất nhiều, tỏa ra vượt quá các cánh hoa, rất nhẵn, lồng vào đế hoa là phần cuối của cuống nhụy.  Quả: Hình cầu, hình quả trứng hoặc hình thon dài, thường có màng cứng, mịn. Ở ngoài có rãnh và thường có màu sắc khác nhau khi chín hoặc bị khô. Quả không vỡ hoặc vỡ chậm sẽ để lại lớp màng ở giữa trung tâm.

6  Hạt: Hạt thường có hình thận, hình bầu dục hoặc hình tam giác thường không có áo hạt, đôi khi có áo hạt màu trắng hoặc vàng nhạt. Màu sắc hạt thường có màu nâu đỏ, một số có màu nâu nhạt hoặc màu đỏ. Đặc điểm thực vật học của loài Cáp Đồng Văn 1. Tên khoa học - Tên khoa học: Capparis dongvanensis.

- Tên tiếng việt : Cáp Đồng Văn. Họ : Màng Màng. Đặc điểm thực vật học - Capparis dongvanensis (Capparaceae) được coi như là một loài mới và được tìm thấy từ tỉnh Hà Giang của Việt Nam. - Loài Cáp Đồng Văn (Capparis dongvanensis) có dạng sống là bụi lớn gần 10 m, thân leo hoặc trườn trên đất.

Thân và cành có rãnh và gai nhỏ hướng xuống dưới đầu nhọn dài 1-2 mm, lá có hình giọt nước hay hình giáo mác có kích thước 9-16,5x3-4,5cm và có 2 màu như màu xanh đậm khi tươi và chuyền màu và khi gần rụng lá, mũi nhọn của lá dài 7-10 mm, Cuống lá dài 5-8 mm. - Hoa thường mọc thành chùm, thành cụm, một chùm gồm có 4 - 7 hoa, mọc ở nách lá hoặc ở đỉnh của cành. Nụ hoa ban đầu có màu xanh khi ban đầu nở ra có màu tím nhạt và nở ra xong sẽ có màu trắng. Hoa của Cáp Đồng Văn bắt đầu mọc lên từ tháng 2 - tháng 3 và tháng 10 - tháng 11.

- Quả của Cáp Đồng Văn có hình cầu, mỗi quả gồm có 2 - 6 hạt, hạt có hình bầu dục. Quả mọc bắt đầu tháng 6 - tháng 1(năm sau) [70].