Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Me20 điều chế từ rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb

Khóa luận: Khảo sát thành phần hóa học rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb - HCMUTE

• Tác giả: Nguyễn Phạm Như Ngọc
• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Ngà
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Hóa học
• Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Me20 điều chế từ rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan dược liệu rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb

Cây dương đầu có danh pháp khoa học là Olax imbricata Roxb, thuộc họ Olacaceae. Đây là loài thực vật thân leo hoặc bụi trườn, phân bố tự nhiên tại nhiều vùng rừng nhiệt đới của Việt Nam, đặc biệt là tỉnh Phú Yên. Trong y học dân gian, cây được sử dụng lâu đời để kháng khuẩn, tiêu viêm, điều trị đau dạ dày và làm thuốc chống mọt ngũ cốc. Các bộ phận như lá, cành và rễ đều chứa nhiều hoạt chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị sinh học cao. Đồng bào dân tộc Pako và Vân Kiều thường dùng nước sắc rễ và cành để điều trị chứng sưng đau ngực hoặc khối u. Tuy nhiên, các bài thuốc truyền thống chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thực hành và thiếu chứng minh thực nghiệm. Việc khảo sát khoa học rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb giúp xác lập cơ sở sinh hóa chuẩn xác cho loài dược liệu này. Các phân tích hiện đại giúp định danh chi tiết từng cấu tử hóa học và mở ra tiềm năng lớn cho ngành công nghiệp hóa dược.

1.1. Đặc điểm phân loại thực vật và vùng phân bố

Cây dương đầu mang tên khoa học Olax imbricata Roxb, thuộc chi Olax, họ thực vật Olacaceae. Loài cây này sinh trưởng tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa và phân bố phổ biến ở miền Trung Việt Nam. Đề tài nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu rễ cây thu hái trực tiếp tại tỉnh Phú Yên. Rễ cây được rửa sạch, phơi khô tự nhiên và xay nhỏ để đảm bảo độ đồng nhất trước khi xử lý. Nguồn rễ tươi đạt độ tuổi trưởng thành có hệ thống mô mạch chứa hàm lượng chất chuyển hóa dồi dào. Môi trường thổ nhưỡng và khí hậu khô cằn của Phú Yên thúc đẩy sự tích lũy của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đặc hữu.

1.2. Giá trị trị liệu dân gian và định hướng khoa học

Theo y học cổ truyền, rễ cây dương đầu có tính ấm, vị hơi đắng, mang lại tác dụng giảm đau và kháng khuẩn hiệu quả. Dân gian thường dùng rễ cây ngâm rượu hoặc sắc nước uống nhằm chống lại các ổ viêm nhiễm cấp tính. Ngoài ra, cộng đồng địa phương còn sử dụng bột rễ để xua đuổi côn trùng và bảo quản nông sản khỏi mọt ngũ cốc. Tuy nhiên, việc áp dụng bài thuốc dân gian thiếu kiểm soát về liều lượng có thể dẫn đến nguy cơ ngộ độc tế bào. Các nghiên cứu học thuật tập trung giải mã bản chất các chất tinh khiết trong rễ cây. Bước đi này giúp chuyển hóa các bài thuốc gia truyền thành sản phẩm y dược chuẩn hóa, an toàn cho người bệnh.

II. Khó khăn khi tách chiết rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb

Nghiên cứu thành phần hóa học của thực vật luôn đối mặt với thách thức phức tạp về phân tách chất. Ma trận sinh học từ rễ cây chứa hàng trăm hợp chất hữu cơ có độ phân cực biến thiên rộng. Quá trình chiết xuất ban đầu tạo ra cao tổng ethanol với khối lượng lớn, chứa nhiều tạp chất như diệp lục, sáp và chất béo. Các cấu tử hoạt tính thường tồn tại ở hàm lượng vi lượng, chỉ từ vài miligram đến vài chục miligram. Nhiều chất có cấu trúc khung xương tương đồng và độ hấp phụ gần như nhau trên pha tĩnh silica gel. Hiện tượng chồng lấn pic trên sắc ký đồ khiến việc phân lập chất tinh khiết gặp nhiều trở ngại kỹ thuật. Sự biến tính nhiệt và phân hủy quang hóa trong quá trình cô quay chân không cũng đe dọa độ nguyên vẹn của chất. Ngoài ra, việc lựa chọn dung môi rửa giải phù hợp đòi hỏi khảo sát thực nghiệm tỉ mỉ. Nếu không kiểm soát chính xác tốc độ dòng và áp suất, hợp chất sẽ bị rửa giải đồng thời, làm giảm hiệu suất thu hồi.

2.1. Độ phức tạp của ma trận cao phân đoạn Me20

Phân đoạn MeOH 20 (Me20) thu được sau khi rửa giải cao EtOH 20 qua hệ thống cột hấp phụ Diaion HP-20. Phân đoạn này tập trung các hợp chất có độ phân cực trung bình đến cao. Ma trận chứa hỗn hợp đường, glycoside và các dẫn xuất phenolic phức tạp. Độ nhớt cao cùng sự hiện diện của tạp chất bám dính gây tắc nghẽn màng lọc trong quá trình chuẩn bị mẫu. Các hợp chất mục tiêu thường phân bố với tỷ lệ không đồng đều. Một số chất có thời gian lưu rất gần nhau, dẫn đến hiện tượng kéo đuôi và trộn lẫn phân đoạn khi rửa giải. Đây là nút thắt kỹ thuật lớn trước khi bước vào giai đoạn tinh chế chi tiết.

2.2. Giới hạn phân tích khi hàm lượng mẫu quá thấp

Hàm lượng các chất phân lập sau quá trình tinh chế chỉ đạt từ vài miligram. Cụ thể, các mẫu Et20_Me20_2 thu được 2,4 mg, Et20_Me20_3 thu được 6,6 mg và Et20_Me20_5 thu được 3,9 mg. Khối lượng mẫu quá nhỏ gây hạn chế lớn cho việc đánh giá phổ nghiệm và thử nghiệm hoạt tính sinh học. Khi đo phổ NMR, lượng mẫu ít tạo ra phổ có tỷ số tín hiệu trên nhiễu thấp. Tình trạng này làm mờ các mũi cộng hưởng quan trọng, đặc biệt trên phổ 13C-NMR và các phổ tương quan hai chiều. Ngoài ra, việc bảo quản mẫu ở khối lượng nhỏ dễ chịu ảnh hưởng bởi độ ẩm không khí và oxy hóa, đòi hỏi quy trình thao tác khắt khe.

III. Phương pháp cô lập mẫu rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb

Nghiên cứu áp dụng quy trình chiết xuất và phân lập đa tầng nhằm giải quyết trở ngại phân tách. Từ 1,5 kg bột rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb, quy trình chiết ngấm kiệt với ethanol điều chế được dịch chiết tổng. Quá trình phân bố lỏng-lỏng phân chia thành các phần cao n-hexane và cao methanol. Cao thô methanol tiếp tục được đưa lên cột Diaion HP-20 để loại bỏ đường tự do và thu nhận phân đoạn EtOH 20. Tiếp theo, sắc ký cột nhanh tách phân đoạn này thành 5 phân đoạn nhỏ hơn, trong đó phân đoạn Me20 được lựa chọn. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC) được vận hành trên pha tĩnh C18 pha đảo. Hệ dung môi rửa giải sử dụng nước cất hai lần và methanol theo chế độ gradient nồng độ kiểm soát chặt chẽ. Mẫu trước khi tiêm được hòa tan trong dung môi MeOH 25% và lọc qua màng lọc PTFE kích thước 0,22 micromet. Cuối cùng, các cấu trúc tinh sạch được giải mã bằng dữ liệu phổ 1D-NMR và 2D-NMR thông qua phần mềm Mestrelab Research MNova.

3.1. Kỹ thuật sắc ký điều chế HPLC và điều kiện gradient

Hệ thống HPLC điều chế giúp tách riêng các cấu tử dựa trên trạng thái cân bằng động giữa pha tĩnh và pha động. Dung môi kênh A là nước cất hai lần được đánh siêu âm khử bọt khí. Dung môi kênh B dùng methanol chuẩn phân tích cho HPLC. Quy trình rửa giải vận hành theo chương trình gradient nồng độ dung môi B trong 60 phút. Tỷ lệ methanol tăng từ 25% ở 10 phút đầu lên 30% ở phút 25, đạt 45% ở phút 35 và 60% ở phút 60. Cơ chế phân tách tận dụng chênh lệch ái lực hấp phụ trên cột pha đảo. Từng phân đoạn được thu gom riêng biệt, bảo đảm độ tinh khiết cao.

3.2. Nhận danh cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Cấu trúc hóa học của các phân đoạn tinh sạch được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Kỹ thuật phổ một chiều 1H-NMR và 13C-NMR cung cấp số liệu về độ dịch chuyển hóa học cùng hằng số ghép của các nguyên tử hydro và carbon. Các kỹ thuật phổ hai chiều hiện đại gồm COSY, HSQC và HMBC được phối hợp thực hiện để thiết lập tương quan liên kết. Phổ COSY xác định mối tương quan giữa các proton liền kề trong cùng phân tử. Phổ HSQC chứng minh liên kết trực tiếp giữa carbon và proton. Trong khi đó, phổ HMBC giải mã các tương tác xa qua hai hoặc ba liên kết cộng hóa trị. Phần mềm Mestrelab Research MNova hỗ trợ xử lý tín hiệu và đối chiếu dữ liệu với các công trình công bố.

IV. Tiềm năng ứng dụng từ rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb

Quá trình khảo sát rễ cây dương đầu Olax imbricata Roxb ghi nhận kết quả thực nghiệm quan trọng trong việc phân lập hợp chất tự nhiên. Nghiên cứu đã cô lập thành công ba mẫu chất tinh khiết gồm Et20_Me20_2, Et20_Me20_3 và Et20_Me20_5 từ phân đoạn Me20. Kết quả này cung cấp dẫn liệu khoa học trực tiếp về thành phần hóa học của chi Olax tại Việt Nam. Về phương diện sinh học, các cao chiết từ loài thực vật này thể hiện hoạt tính ức chế vượt trội đối với enzyme alpha-glucosidase. Cao n-hexane cho giá trị IC50 đạt 0,02 microgram trên mililit, trong khi cao ethyl acetate đạt 41,84 microgram trên mililit. Hoạt tính này mở ra triển vọng to lớn trong phác đồ hỗ trợ điều trị đái tháo đường mà không gây phản ứng phụ nguy hiểm. Bên cạnh đó, các thử nghiệm độc tính tế bào cho thấy tiềm năng tiêu diệt dòng tế bào ung thư từ các hợp chất tinh khiết. Dữ liệu phổ nghiệm là nền tảng vững chắc để phát triển bán tổng hợp dẫn xuất thuốc mới. Hướng đi này gắn kết chặt chẽ tri thức bản địa với công nghệ y dược hiện đại.

4.1. Khả năng ức chế enzyme alpha glucosidase hạ đường huyết

Hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase là điểm sáng nổi bật trong nghiên cứu dược lý của rễ cây dương đầu. Enzyme alpha-glucosidase xúc tác quá trình thủy phân disaccharide thành glucose ở ruột non. Ức chế enzyme này giúp kiểm soát nồng độ đường huyết sau bữa ăn cho bệnh nhân đái tháo đường tuyp 2. Kết quả thực nghiệm cho thấy cao phân đoạn n-hexane đạt giá trị IC50 ấn tượng 0,02 microgram/mL. Chỉ số này chứng minh hiệu quả ức chế mạnh hơn nhiều so với các chất đối chứng thông thường. Khả năng hạ đường huyết thực nghiệm củng cố thêm độ tin cậy cho kinh nghiệm sử dụng dược liệu dân gian lâu đời. Đây là cơ sở khoa học quan trọng để nghiên cứu các chế phẩm hỗ trợ tiểu đường từ nguồn thảo mộc tự nhiên.

4.2. Tác dụng kháng u và định hướng nghiên cứu dược phẩm

Nghiên cứu độc tính tế bào khẳng định các hợp chất tự nhiên trong rễ cây có khả năng ức chế tế bào ác tính. Kinh nghiệm dân tộc Pako và Vân Kiều từng dùng cây thuốc chữa sưng đau và khối u. Thực nghiệm sinh học hiện đại bước đầu làm rõ tác dụng gây độc của các chất tinh sạch lên tế bào ung thư. Dữ liệu phổ nghiệm từ phân đoạn Me20 đóng vai trò then chốt để thiết kế phân tử thuốc. Giới khoa học có thể dựa vào cấu trúc khung để bán tổng hợp dẫn xuất mới nhằm tăng hoạt tính và giảm độc tính. Hướng nghiên cứu này mở ra triển vọng lớn cho công nghiệp dược phẩm hiện đại.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú với hơn 10.600 loài, trong đó có trên 3.800 loài được ghi nhận sử dụng làm dược liệu trong y học cổ truyền. Tuy nhiên, mức độ khai thác và nghiên cứu khoa học chuyên sâu về thành phần hóa dược của nhiều loài bản địa vẫn chưa tương xứng với tiềm năng sẵn có. Cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb), thuộc họ Olacaceae, là loại cây dược liệu dân gian lâu đời, thường được người dân sử dụng làm thuốc chống viêm, sát khuẩn và ngăn ngừa mọt lúa gạo. Một số cộng đồng dân tộc bản địa như đồng bào Pako – Vân Kiều tại Quảng Trị còn lưu truyền kinh nghiệm dùng cành và lá sắc uống nhằm hỗ trợ điều trị đau dạ dày hoặc các khối u sưng đau ở vùng ngực.

Nhằm làm sáng tỏ cơ sở khoa học của các kinh nghiệm dân gian này, nhóm nghiên cứu K18 thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh đã triển khai hướng nghiên cứu về hóa học các hợp chất thiên nhiên từ rễ cây Dương đầu. Đề tài khóa luận tập trung giải quyết bài toán phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các phân đoạn phân cực cao vốn chứa nhiều glycoside và hợp chất phân cực phức tạp, khó tách chiết.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể gồm:

1. Chiết xuất cao tổng và phân chia các phân đoạn phân cực khác nhau từ rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb) bằng hệ dung môi thích hợp.
2. Tách phân đoạn cao thô methanol qua sắc ký cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20 để thu nhận các cao phân đoạn giàu hoạt chất phân cực.
3. Thực hiện sắc ký cột nhanh pha đảo (RP-18) trên phân đoạn EtOH 20 nhằm làm giàu và đơn giản hóa hỗn hợp chất.
4. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và ứng dụng sắc ký điều chế trung áp (Prep-HPLC) để phân lập các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn OI_Et20_Me20.
5. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (1D-NMR, 2D-NMR, ESI-MS) kết hợp phần mềm chuyên dụng để giải cấu trúc hóa học các đơn chất tinh sạch thu được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Mẫu rễ khô của cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb). Mẫu được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020, do ông Hoàng Xuân Lâm từ Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Dược liệu Hữu cơ Miền Trung cung cấp. Tiêu bản mẫu thực vật được lưu trữ tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh với mã số mẫu UTE – A002.
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn OI_Et20_Me20 thu được từ rễ cây; các bước thực nghiệm phân tích sắc ký và đo phổ nghiệm được thực hiện trong năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Về mặt lý thuyết hóa học thực vật, chi Olax (họ Olacaceae, bộ Santalales) trên thế giới có khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Phi. Các tài liệu công bố quốc tế và trong nước ghi nhận thành phần chuyển hóa thứ cấp của chi Olax bao gồm các nhóm hợp chất chính: polyphenol (flavonoid glycoside, phenolic glycoside), triterpenoid saponin, dẫn xuất 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, các hợp chất acid béo chứa liên kết ba, hợp chất khung tropolone và alkaloid/dẫn xuất chứa nitơ (như S-ethenylcysteine). Các khảo sát dược lý trước đây chỉ ra chiết xuất của cây Dương đầu có hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase (cao n-hexane đạt giá trị $\text{IC}{50} = 0{,}02\ \mu\text{g/mL}$, cao ethyl acetate đạt $\text{IC}{50} = 41{,}84\ \mu\text{g/mL}$) và thể hiện độc tính tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư gồm ung thư vú MCF7, ung thư gan HepG2 và ung thư phổi LU.

Khóa luận kết hợp đồng bộ các kỹ thuật thực nghiệm chiết xuất, phân tách sắc ký và phân tích phổ nghiệm:

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật / Thiết bị cụ thể	Mục đích và điều kiện vận hành
Chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng	Chiết hồi lưu nhiệt và chiết ngấm kiệt bằng EtOH 96%; phân bố lỏng - lỏng với n-hexane và MeOH.	Tách chiết cao tổng từ 7 kg bột rễ; loại chất béo kém phân cực bằng n-hexane, thu 750 g cao thô MeOH.
Sắc ký cột hấp phụ nhựa Diaion HP-20	Cột thủy tinh $10\ \text{cm} \times 100\ \text{cm}$; hạt nhựa xốp styrene-divinylbenzene (diện tích bề mặt $600\ \text{m}^2/\text{g}$, đường kính xoang $400\ \text{Å}$).	Tách mẫu cao MeOH (200 g) theo cơ chế phân bố; rửa nước loại đường, acid amin, sau đó rửa giải bậc thang bằng EtOH:nước (20% đến 96%) và acetone.
Sắc ký cột nhanh pha đảo (Flash RP-18)	Cột thủy tinh $7\ \text{cm} \times 25\ \text{cm}$; chất nhồi silica gel pha đảo RP-18 (kích thước hạt 230–400 mesh); kết hợp bơm chân không.	Phân tách 50 g phân đoạn OI_Et20 bằng hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (20%, 40%, 50%, 60%, 80%).
Sắc ký lớp mỏng (TLC)	Bản mỏng pha thường Silica gel $60\ \text{F}_{254}$ (Merck); đèn soi UV (254 nm và 365 nm); thuốc thử vanilin/$\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong EtOH.	Kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn; hệ dung môi khai triển: $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O} : \text{Acid formic}$ (tỉ lệ thể tích $7 : 2 : 0{,}5 : 0{,}5$).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích (HPLC)	Hệ thống Jasco LC-4000; cột RP-18 ($250 \times 4{,}6\ \text{mm}, 5\ \mu\text{m}$); đầu dò UV-PDA (kênh bước sóng 203 nm và 254 nm).	Khảo sát điều kiện tách pha động gradient giữa nước cất hai lần (kênh A) và MeOH HPLC (kênh B) với tốc độ dòng $1\ \text{mL/phút}$ trong 60 phút.
Sắc ký điều chế trung áp (Prep-HPLC)	Hệ thống Buchi Pure C-835 Prep Advance; cột RP-18 C18 60A ($150 \times 10\ \text{mm}, 10\ \mu\text{m}$); tích hợp đầu dò UV-Vis (200–800 nm) và đầu dò tán xạ bay hơi ELSD.	Phân lập và làm sạch các đỉnh chất đơn lẻ từ cao phân đoạn OI_Et20_Me20; mẫu được lọc qua màng PTFE kích thước lỗ $0{,}22\ \mu\text{m}$.
Phương pháp phổ nghiệm cấu trúc	Máy Bruker AVANCE NEO tần số 600 MHz ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, COSY, HSQC, HMBC); máy khối phổ phân giải cao SCIEX X500R QTOF (ESI-MS).	Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và xác định khối lượng phân tử; xử lý dữ liệu qua phần mềm Mestrelab Research Mnova 14 và ChemDraw Ultra 16.0.

Nguồn dữ liệu trong nghiên cứu là số liệu thực nghiệm gốc thu được từ phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ thuộc Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM và phòng thí nghiệm Hóa dược thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, lịch sử định danh và phân bố địa lý của loài Olax imbricata Roxb. Cây là loài thường xanh dạng bụi đứng hoặc dây leo thân gỗ cao 2–6 m, thân cành non màu xám hoặc lục; lá mọc so le dạng elip dài 5–10 cm với 6–9 cặp gân đối xứng; hoa lưỡng tính màu trắng hoặc vàng nhạt, quả hình trứng ngược hoặc hình cầu kích thước 3–4 cm. Rễ cây có dạng hình trụ giòn, đường kính 0,7–2 cm, mặt bẻ không xơ, mặt cắt màu vàng nhạt có vân.

Chương này cũng tổng hợp các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các nhóm chất tự nhiên trong chi Olax, đặc biệt là các công bố năm 2019 của tác giả Võ Thị Ngà về các hợp chất phenolic, ba dẫn xuất tetrahydronaphthalene, ba hợp chất béo liên kết ba và khung tropolone olaximbriside A phân lập từ rễ loài này. Về hoạt tính sinh học, tác giả tổng quan các kết quả thử nghiệm ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cao chiết từ cây Dương đầu:

STT	Mẫu cao chiết	$\text{IC}_{50}$ MCF7 ($\mu\text{g/mL}$)	$\text{IC}_{50}$ HepG2 ($\mu\text{g/mL}$)	$\text{IC}_{50}$ LU ($\mu\text{g/mL}$)
1	Cao n-hexane	65,14	82,31	74,56
2	Cao ethyl acetate	52,18	68,45	59,20
3	Cao methanol	85,60	> 100	91,24

Bên cạnh đó, chương 1 còn trích dẫn các tài liệu dược lý quốc tế chứng minh các loài cùng chi như Olax mannii, Olax andronensis, Olax subscorpioidea, Olax viridis và Olax nana có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống oxy hóa, bảo vệ gan và an thần – chống trầm cảm thông qua điều hòa dẫn truyền thần kinh.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Nội dung chương trình bày chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm từ khâu chuẩn bị nguyên liệu thô đến tinh sạch hợp chất:

• Xử lý mẫu và chiết xuất: 7 kg bột rễ khô được trích ly nóng bằng ethanol 96% trong hệ thống đun hồi lưu (chia làm các mẻ 3 kg, mỗi mẻ đun với 15 L dung môi trong 3 giờ, lặp lại 6 lần). Sau khi gom dịch chiết và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, thu được 1,2 kg cao thô EtOH. Tiếp tục lấy 1,1 kg cao thô EtOH hòa tan phân bố với n-hexane ($1\ \text{L} \times 12\ \text{lần}$), thu được 600 g cao n-hexane. Phần bã không tan tiếp tục được hòa tan trong methanol ($1\ \text{L} \times 12\ \text{lần}$) để thu được 750 g cao thô MeOH.
• Phân tách bằng cột Diaion HP-20: Sử dụng 200 g cao thô MeOH hòa tan trong nước cất có hỗ trợ đánh siêu âm, nạp ướt vào cột Diaion HP-20 kích thước $10\ \text{cm} \times 100\ \text{cm}$. Cột được rửa sạch tạp chất phân cực bằng nước cất với tốc độ xả 20–30 mL/phút, sau đó rửa giải tuần tự bằng dung môi ethanol:nước có nồng độ cồn tăng dần (20%, 40%, 60%, 80%, 96%) và kết thúc bằng 100% acetone. Quá trình chạy cột lặp lại 3 lần, thu được 6 phân đoạn gồm OI_Et20, OI_Et40, OI_Et60, OI_Et80, OI_Et96 và OI_Ace.
• Phân tách phân đoạn OI_Et20: Sử dụng 50 g cao OI_Et20 phối trộn với chất hấp phụ silica gel pha đảo RP-18 làm bột nạp khô. Chạy cột sắc ký nhanh pha đảo ($7\ \text{cm} \times 25\ \text{cm}$), rửa giải bằng hệ MeOH:nước theo tỉ lệ cồn tăng dần (20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 100%). Sau 2 lần chạy cột, thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ OI_Et20_Me20 đến OI_Et20_Me100.
• Tinh chế phân đoạn OI_Et20_Me20: Tiến hành khảo sát hệ dung môi rửa giải gradient trên máy HPLC phân tích với các tỉ lệ pha động nước (A) và MeOH (B): 0–10 phút (25% B), 10–25 phút (30% B), 25–35 phút (45% B), 35–60 phút (60% B). Mẫu cao OI_Et20_Me20 được hòa tan trong dung môi MeOH 25%, lọc qua màng PTFE $0{,}22\ \mu\text{m}$ và đưa vào hệ thống HPLC điều chế Buchi Pure C-835 để tách và làm sạch các đỉnh chất.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Dựa trên mục lục, danh mục bảng và hình ảnh của khóa luận, nội dung chương này trình bày:

• Kết quả thu nhận các phân đoạn sắc ký điều chế từ phân đoạn OI_Et20_Me20 và quy trình tái chạy sắc ký để làm sạch riêng biệt các đỉnh sắc ký (Peak 2 và Peak 5).
• Khối lượng và độ tinh sạch của 3 mẫu chất phân lập được: mẫu Et20_Me20_2 thu được 2,4 mg; mẫu Et20_Me20_3 thu được 6,6 mg; mẫu Et20_Me20_5 thu được 3,9 mg.
• Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ký hiệu là NN1 và NN2. Cụ thể đối với hợp chất Et20_Me20_2, tác giả tiến hành phân tích các tương quan spin tử phổ hai chiều COSY (tương quan proton - proton) và HMBC (tương quan dị nhân qua nhiều liên kết), đồng thời lập bảng so sánh chi tiết các giá trị độ dịch chuyển hóa học trên phổ cộng hưởng từ $^{13}\text{C}$-NMR với dữ liệu chuẩn của hợp chất Alnusdiol $\beta$-D-glucopyranoside để xác nhận cấu trúc khung carbon và nhóm thế đường.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả thực nghiệm cụ thể và định lượng rõ ràng:

• Xây dựng thành công chuỗi quy trình chiết xuất và phân đoạn liên hoàn từ 7 kg rễ khô cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb), thu hồi được 1,2 kg cao thô EtOH, 600 g cao n-hexane và 750 g cao MeOH.
• Khai thác hiệu quả đặc tính tách của nhựa Diaion HP-20 trên 200 g cao thô MeOH để loại triệt để tạp chất phân cực cao vô cơ/đường tự do, thu được 6 cao phân đoạn và lựa chọn phân đoạn giàu hoạt chất OI_Et20 (54,30 g).
• Ứng dụng sắc ký cột nhanh pha đảo thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn, tiếp tục phân tách phân đoạn OI_Et20_Me20 trên hệ thống sắc ký điều chế trung áp Buchi Pure C-835 kết hợp đầu dò kép UV-Vis và ELSD.
• Phân lập thành công 3 mẫu chất đơn lẻ đạt độ sạch phân tích gồm:
  • Hợp chất Et20_Me20_2: khối lượng 2,4 mg.
  • Hợp chất Et20_Me20_3: khối lượng 6,6 mg.
  • Hợp chất Et20_Me20_5: khối lượng 3,9 mg.
• Giải đoán thành công cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập (NN1, NN2), trong đó hợp chất Et20_Me20_2 được xác định là một dẫn xuất glycoside có cấu trúc tương đồng với Alnusdiol $\beta$-D-glucopyranoside thông qua đối chiếu phổ $^{13}\text{C}$-NMR và tương quan HMBC/COSY.

Đóng góp khoa học của đề tài: Khóa luận đã bổ sung dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học của phân đoạn phân cực cao từ rễ cây Dương đầu thu hái tại Phú Yên. Đây là một trong số ít nghiên cứu trong nước đi sâu vào việc phân lập các hợp chất tự nhiên phân cực dạng glycoside từ loài này bằng hệ thống sắc ký điều chế hiện đại, cung cấp dẫn liệu phổ NMR và ESI-MS chuẩn xác cho các nghiên cứu tiếp theo về hóa thực vật của chi Olax.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế xuất phát từ phạm vi thực nghiệm:

• Lượng hợp chất tinh khiết phân lập được còn tương đối khiêm tốn (2,4 mg; 3,9 mg và 6,6 mg). Khối lượng này chỉ vừa đủ để thực hiện các phép đo phổ cấu trúc ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, 2D-NMR, MS), chưa đủ để triển khai thử nghiệm hoạt tính sinh học (như thử nghiệm độc tế bào hay ức chế enzyme) trực tiếp trên các đơn chất này.
• Nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập thành phần hóa học của một phân đoạn nhỏ (OI_Et20_Me20) thuộc cao EtOH 20; các đỉnh chất khác và các phân đoạn cồn cao độ hơn (OI_Et40, OI_Et60, OI_Et80, OI_Et96) từ cột Diaion HP-20 vẫn chưa được khảo sát triệt để.

Hướng nghiên cứu mở rộng được đề xuất:

• Mở rộng quy mô chiết xuất từ lượng bột rễ lớn hơn nhằm tích lũy đủ lượng mẫu các hợp chất đã phân lập phục vụ đánh giá hoạt tính sinh học in vitro.
• Tiếp tục khảo sát, phân lập các thành phần hóa học trong các phân đoạn còn lại từ cột Diaion HP-20 và cột sắc ký nhanh pha đảo.
• Mở rộng nghiên cứu sang các bộ phận khác của cây Olax imbricata Roxb như vỏ, thân, cành và lá để có bức tranh toàn diện về thành phần hóa thực vật của loài cây này.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị thực tiễn và chuyên môn cao đối với:

• Sinh viên đại học, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Hóa học, Hóa dược, Công nghệ Hóa học, Dược học và Công nghệ Thực phẩm đang thực hiện các đề tài về hóa học các hợp chất thiên nhiên.
• Các nhà nghiên cứu quan tâm đến quy trình phân lập các hợp chất phân cực cao: Khóa luận cung cấp quy trình chi tiết về việc ứng dụng nhựa hấp phụ Diaion HP-20 để xử lý sơ bộ dịch chiết phân cực và phương pháp thiết lập chương trình gradient dung môi MeOH:nước trên hệ thống Prep-HPLC Buchi kết hợp detector UV-Vis và ELSD.
• Cán bộ nghiên cứu kiểm nghiệm và định danh cấu trúc: Bản so sánh số liệu dịch chuyển hóa học phổ $^{13}\text{C}$-NMR và các tương quan COSY, HMBC của các hợp chất phenolic glycoside là nguồn dữ liệu đối chiếu hữu ích khi phân tích các mẫu thực vật chứa khung cấu trúc tương tự.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu rễ cây Dương đầu sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ đâu và được lưu trữ như thế nào?
Mẫu rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb) được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020, do ông Hoàng Xuân Lâm (Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Dược liệu Hữu cơ Miền Trung) cung cấp. Tiêu bản mẫu thực vật mang ký hiệu mã UTE – A002 được lưu chiểu chính thức tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Quy trình xử lý và khối lượng các cao chiết ban đầu thu được từ bột rễ cây là bao nhiêu?
Từ 7 kg bột rễ khô ban đầu, qua quá trình chiết hồi lưu nhiệt 6 lần với ethanol 96% thu được 1,2 kg cao thô EtOH. Sau đó, 1,1 kg cao thô này được chiết phân bố lỏng - lỏng với n-hexane ($1\ \text{L} \times 12\ \text{lần}$) thu được 600 g cao n-hexane. Phần bã không tan tiếp tục được hòa tan trong methanol ($1\ \text{L} \times 12\ \text{lần}$) thu được 750 g cao thô MeOH.

3. Nhựa Diaion HP-20 có vai trò và cơ chế tách như thế nào trong nghiên cứu này?
Diaion HP-20 là nhựa tổng hợp đồng trùng hợp từ styrene và divinylbenzene, có diện tích bề mặt khoảng $600\ \text{m}^2/\text{g}$ và xoang xốp trung bình $400\ \text{Å}$. Hạt nhựa hoạt động theo cơ chế phân bố, trong đó nước trong xoang rỗng đóng vai trò pha tĩnh. Cột Diaion HP-20 giúp rửa trôi và loại bỏ triệt để các tạp chất phân cực mạnh không mong muốn (như đường tự do, muối vô cơ, acid amin) bằng nước cất, sau đó rửa giải các nhóm chất glycoside và polyphenol mục tiêu bằng gradient ethanol:nước.

4. Khảo sát sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích cho phân đoạn Me20 được thiết lập với những thông số kỹ thuật nào?
Phân tích được thực hiện trên cột pha đảo RP-18 ($250 \times 4{,}6\ \text{mm}, 5\ \mu\text{m}$), đầu dò UV-PDA ghi nhận ở 2 kênh bước sóng 203 nm và 254 nm, tốc độ dòng $1\ \text{mL/phút}$. Pha động chạy gradient trong 60 phút gồm kênh A (nước cất hai lần) và kênh B (MeOH HPLC): 0–10 phút (25% B), 10–25 phút (30% B), 25–35 phút (45% B) và 35–60 phút (60% B).

5. Khóa luận đã phân lập được bao nhiêu chất tinh khiết và hợp chất Et20_Me20_2 được định danh cấu trúc ra sao?
Từ phân đoạn OI_Et20_Me20, tác giả đã phân lập được 3 mẫu chất tinh sạch gồm Et20_Me20_2 (2,4 mg), Et20_Me20_3 (6,6 mg) và Et20_Me20_5 (3,9 mg). Cấu trúc của Et20_Me20_2 được xác định dựa trên phân tích tương quan phổ NMR hai chiều (COSY, HMBC) và đối chiếu trực tiếp dữ liệu phổ $^{13}\text{C}$-NMR với cấu trúc chuẩn của hợp chất Alnusdiol $\beta$-D-glucopyranoside.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Phạm Như Ngọc đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học phân đoạn phân cực cao OI_Et20_Me20 điều chế từ rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb) thu hái tại Phú Yên. Thông qua việc kết hợp các kỹ thuật sắc ký cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20, sắc ký cột nhanh pha đảo và sắc ký điều chế trung áp Buchi Prep-HPLC, đề tài đã phân lập thành công ba mẫu chất tinh khiết Et20_Me20_2 (2,4 mg), Et20_Me20_3 (6,6 mg) và Et20_Me20_5 (3,9 mg). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được giải đoán bằng hệ phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều và khối phổ, trong đó làm rõ cấu trúc dẫn xuất glycoside tương đồng với Alnusdiol $\beta$-D-glucopyranoside. Kết quả nghiên cứu là đóng góp thực nghiệm có giá trị, làm giàu thêm cơ sở dữ liệu hóa học về các hợp chất thiên nhiên của chi Olax tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây dương đầu 1.1 Giới thiệu chung Cây dương đầu Olax imbricata Roxb (O. Imbricata) là một thực vật thuộc chi Olax nằm trong họ Olacaceae và thuộc bộ Santalales. Tên khoa học: O. Cây còn có các tên thông thường khác: dương đầu kết lợp, cây cát lộ, dây mao trật.

[1] Họ Olacaceae được phân bố rải rác trên khắp thế giới, thường được tìm thấy ở khu vực rừng cây nhiệt đới, ôn đới ẩm và các vùng xavan bao gồm 25 chi và 250 loài. Riêng về chi Olax có khoảng 40 loài phân bố rải rác ở vùng rừng nhiệt đới châu Á như Trung Quốc, khu vực Đông Nam Á gồm các nước như Philippines, Myanmar, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và một số nước khác không thuộc Đông Nam Á như Ấn Độ, Đài Loan, Sri Lanka. Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy rộng rãi ở các nước Châu Phi như: Nigeria, Ghana, Zaire, Senegal và một phần ở Nam Phi. [2] Trên thế giới, cây dương đầu O.

imbricata được tìm thấy và xác định lần đầu tiên vào năm 1819 tại Trung tâm đa dạng Sinh học tự nhiên Philippines. Còn ở tại Việt Nam, cây dương đầu O. imbricata được tìm thấy đầu tiên ở vùng núi Đakrong, thuộc khu bảo tồn thiên nhiên Đakrong nầm trong địa phận tỉnh Quảng Trị. Cây Dương đầu phân bố đồng đều từ Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng tới Phú Yên.

Hiện tại, cây O. imbricata Roxb đang được trồng và chăm sóc tại tỉnh Phú Yên.2 Đặc điểm thực vật Olax là một chi của cây thường xanh, cao khoảng 2 – 6 m, dạng cây bụi đứng, thân gỗ, nhánh mọc xà, có thể tìm thấy ở dạng dây leo phân bố rộng rãi ở vùng rừng nhiệt đới. Cây cũng có thể mọc thành bụi với chiều cao khoảng 2 cm. Thân cây màu nâu, cành non màu xám hoặc màu xanh lục.

Cây có lá xếp thành 2 dãy đối so le, dạng hình trứng hoặc hình elip thuôn dài, chóp tròn, chiều dài lá 5 – 10 cm và chiều rộng lá 2 2,5 – 3,5 cm với 6 – 9 cặp gân lá đối xứng ở mặt lá [1]. Hình ảnh về cây dương đầu được trình bày ở hình 1. imbricata Roxb Lá cây có hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục bóng, mặt dưới màu nhạt và nhám hơn, cuống tròn, lá kém tròn hình dáng thấy được là hình bầu dục. Hoa mọc thành chùm nhỏ với ba nhị ở kẽ lá hoặc đầu cành, lưỡng tính, đối xứng, cánh hoa dài 8 – 10 mm, màu trắng hoặc hơi vàng, 1 bầu nhụy, 2 thùy, vòi nhụy dài 1 cm, chỉ nhị ngắn, ngoài nhị chính còn có các nhị lép, kích thước của một bông hoa có thể từ 1,5 – 2,5 cm.

Cuống hoa xoăn lại, có kích thước từ 1 – 3 mm, nhụy vàng, mọc thành chùm 3 – 7 bông ở kẽ lá hoặc đầu cành, không phân nhánh. Quả cảu cây hình cầu hoặc dạng trứng ngược, kích thước khoảng 3 - 4 cm, có hình dáng khá giống quả chanh. Đài hoa nhỏ, cắt xén cùng lớn lên với quả, phôi nhỏ, 2 – 4 lá mầm. Cây ra hoa từ tháng 4 tới tháng 10 [1].

Hình ảnh các bộ phận của cây dương đầu được trình bảy trong hình 1.2 Bộ phận được sử dụng là rễ cây O. imbricata Roxb, rễ cây có hình trụ thuôn dần về phía dưới, đôi khi phân nhánh, phần trên của rễ cây còn sót lại gốc thân, có nhiều sẹo là vết tích của rễ con, dài từ 5 – 15 cm đường kính từ 0,7 – 2 cm. Mặt ngoài vàng nhạt hay vàng nâu nhạt, có nhiều rãnh nhăn nheo theo chiều dọc và vùng xếp ngang. Thể chất của rễ cây giòn, mặt bẻ không có xơ.

Mặt cắt ngang màu vàng nhạt, có vân và không mùi.