Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Et40.7 điều chế từ cao chiết methanol từ rễ cây Dương đầu, Olax imbricata

Khóa luận: Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Et40.7 rễ cây Dương đầu Olax imbricata - HCMUTE

• Tác giả: Lê Kim Duyên
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Ngà
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Et40.7 điều chế từ cao chiết methanol từ rễ cây Dương đầu, Olax imbricata
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan phân đoạn Et40

Cây Dương đầu có tên khoa học là Olax imbricata, thuộc họ Olacaceae. Dược liệu phân bố tự nhiên tại nhiều vùng rừng ven biển Việt Nam, đặc biệt ở tỉnh Phú Yên. Rễ cây tích lũy nguồn hợp chất thứ cấp dồi dào. Nghiên cứu tập trung xử lý 50 kg rễ tươi nhằm tìm kiếm hoạt chất sinh học mới. Bột dược liệu khô được trích ly kiệt bằng dung môi ethanol 96%. Quá trình bay hơi dung môi tạo ra 1,5 kg cao chiết tổng ethanol. Cao tổng tiếp tục hòa tan phân bố trong n-hexane và methanol. Cao methanol chiếm lượng lớn và chứa nhiều chất phân cực cao. Nhóm nghiên cứu tiến hành sắc ký cột hấp phụ Diaion HP-20. Hệ dung môi ethanol và nước giải ly theo độ phân cực giảm dần. Các phân đoạn chính gồm Et20, Et40, Et60, Et80, Et96 và acetone. Phân đoạn Et40 đạt khối lượng 65,33 g. Đây là phân đoạn giàu saponin. Phân đoạn Et40 trải qua các bước sắc ký cột silica gel kế tiếp. Hỗn hợp được phân cắt thành các phân đoạn nhỏ hơn. Phân đoạn Et40.7 xuất hiện từ quá trình phân tách phân đoạn Et40.6. Đây là đối tượng nghiên cứu trọng tâm để phát hiện hoạt chất tinh khiết.

1.1. Nguồn gốc dược liệu và quy trình tạo cao chiết rễ Dương đầu

Nguồn dược liệu rễ cây Dương đầu được thu hái trực tiếp tại Phú Yên. Khối lượng mẫu ban đầu đạt 50 kg rễ thô. Mẫu rễ trải qua công đoạn rửa sạch tạp chất, phơi khô tự nhiên và xay mịn. Kết quả thu được 7 kg bột dược liệu đồng nhất. Quá trình chiết ngâm dầm với dung môi ethanol 96% diễn ra nhiều lần. Dung dịch lọc gom lại và cô quay chân không ở nhiệt độ thấp. Thu hồi được 1,5 kg cao chiết toàn phần. Cao toàn phần được chiết phân bố lần lượt với n-hexane để loại tạp chất kém phân cực. Phần cặn không tan tiếp tục hòa tan hoàn toàn bằng dung môi methanol. Cao methanol đạt độ sạch cao, sẵn sàng cho các phân tách tiếp theo.

1.2. Phân đoạn Diaion HP 20 và vị trí của phân đoạn Et40

Sắc ký cột chất hấp phụ Diaion HP-20 giữ vai trò loại đường tự do và muối khoáng. Cột được nạp cao chiết methanol. Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi ethanol - nước với tỷ lệ ethanol tăng dần từ 20% đến 100%. Cuối cùng, cột được xả sạch bằng acetone. Quá trình này tạo ra sáu phân đoạn chính. Phân đoạn Et20 đạt 54,30 g. Phân đoạn Et40 đạt 65,33 g. Phân đoạn Et60 đạt 84,06 g. Phân đoạn Et80 đạt 45,47 g. Phân đoạn Et96 đạt 45,47 g và phân đoạn acetone đạt 1,96 g. Phân đoạn Et40 sở hữu hàm lượng chất tương đối lớn. Thành phần trong Et40 gồm nhiều hợp chất glycoside phân cực trung bình. Đây là tiền đề trực tiếp để cô lập phân đoạn nhỏ Et40.7.

II. Phân tích thách thức tinh sạch phân đoạn Et40

Phân đoạn Et40.7 sở hữu hệ hợp chất tự nhiên rất phức tạp. Thành phần chủ yếu gồm các saponin triterpenoid có phân tử khối lớn. Các chất này mang khung oleanolic acid liên kết với nhiều mạch đường rhamnose và glucose. Độ phân cực giữa các đồng phân rất gần nhau. Giá trị hệ số lưu giữ Rf trên bản mỏng silica gel thường trùng lặp. Hiện tượng kéo vệt xảy ra phổ biến trên bản mỏng do tính phân cực mạnh và độ nhớt cao của saponin. Việc tách riêng từng chất đòi hỏi chọn lựa hệ dung môi giải ly khắt khe. Ngoài ra, quá trình điều chế thủ công thường gặp sự cố nhiễm bẩn silica gel. Khi cạo vệt trên bản sắc ký mỏng điều chế, bụi silica bị cặn lại trong sản phẩm. Điều này tạo ra sai lệch lớn về khối lượng thực tế của chất. Khối lượng mẫu thô thường cao giả tạo. Sau khi lọc qua dung môi hữu cơ tinh khiết, khối lượng chất tinh khiết giảm sút mạnh. Thách thức này buộc kỹ thuật viên phải kết hợp nhiều phương pháp sắc ký bổ trợ.

2.1. Độ tương đồng cấu trúc và hiện tượng trùng vết sắc ký

Nhiều saponin trong phân đoạn Et40.7 có khung triterpenoid giống nhau. Sự khác biệt chỉ nằm ở số lượng hoặc vị trí liên kết của gốc đường. Do đó, các chất thể hiện tính phân cực gần như tương đương. Bản sắc ký lớp mỏng pha thường thường ghi nhận một vệt đơn lẻ. Mẫu thử phân đoạn Et40.PD2 từng chỉ cho một vết duy nhất trên bản mỏng. Hiện tượng này dễ gây nhầm lẫn là phân đoạn đã sạch một chất. Tuy nhiên, khi thay đổi hệ dung môi phân cực như chloroform, methanol, nước và acid formic, hỗn hợp lập tức bộc lộ hai vệt tách rời. Sự đồng giải ly đòi hỏi kỹ thuật phân tích có độ chọn lọc cao hơn.

2.2. Vấn đề lẫn tạp silica gel từ sắc ký bản mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế (prep-TLC) là phương pháp phân lập thủ công thông dụng. Người làm thí nghiệm cạo phần chất hấp phụ chứa dải chất mục tiêu. Nếu thao tác chiết và lọc không triệt để, bột silica gel mịn sẽ hòa lẫn vào dịch chiết. Sau khi làm bay hơi dung môi, cắn mẫu chứa một lượng lớn tạp chất vô cơ này. Hiện tượng này dẫn đến việc ước tính sai khối lượng mẫu thu nhận. Thực tế khảo sát ghi nhận khối lượng phân đoạn giảm sút nghiêm trọng sau khi tinh sạch hoàn toàn. Việc rửa giải mẫu bằng dung môi chọn lọc và lọc qua màng vi lọc là bắt buộc để loại bỏ triệt để silica gel dư.

III. Phương pháp cô lập hợp chất từ phân đoạn Et40

Quy trình tinh sạch các chất tinh khiết đòi hỏi sự kết hợp đồng bộ nhiều kỹ thuật sắc ký. Phân đoạn Et40.7 được phân tách sơ bộ trên sắc ký cột silica gel pha thường. Hệ dung môi giải ly gồm dichloromethane và methanol biến thiên tỷ lệ phân cực. Tiếp theo, các phân đoạn phụ được kiểm tra kỹ lưỡng bằng sắc ký lớp mỏng phân tích. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế (prep-TLC) hỗ trợ cô lập các phân đoạn có độ tinh khiết sơ bộ. Đối với các hợp chất có cùng hệ số dịch chuyển Rf, sắc ký lọc gel trên chất hấp phụ Sephadex LH-20 là giải pháp quyết định. Gel Sephadex LH-20 phân tách dựa trên kích thước phân tử và tương tác hấp phụ. Hệ dung môi giải ly là methanol tinh khiết 100%. Quá trình này giúp loại bỏ hoàn toàn các vết đồng hành và tạp chất polymer. Tám hợp chất tinh khiết đã được thu hồi thành công. Nhóm chất này gồm OIPD4.3 với 20,3 mg, OI1 với 61,7 mg, OI3 với 4,7 mg, OI4 với 4,9 mg, OI5 với 13,0 mg và OI6 với 9,3 mg.

3.1. Ứng dụng sắc ký lọc gel Sephadex LH 20 trong tinh sạch

Sắc ký lọc gel Sephadex LH-20 đóng vai trò thiết yếu khi xử lý phân đoạn Et40.PD2 có khối lượng 20 mg. Cột gel sử dụng dung môi rửa giải hoàn toàn là methanol nguyên chất. Các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn qua mạng lưới hạt gel. Ngược lại, các hợp chất nhỏ hơn thâm nhập sâu vào các lỗ xốp nên rửa giải chậm hơn. Quá trình theo dõi dịch ly giải thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly bốn cấu tử chloroform, methanol, nước và acid formic theo tỷ lệ 7:3:3:0,5. Kết quả giúp tách thành công hai thành phần riêng biệt có cùng giá trị Rf ban đầu.

3.2. Phương pháp xác định cấu trúc phân tử bằng phổ NMR và MS

Sau khi đạt độ tinh khiết cao, các hợp chất được đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS). Phổ 1H-NMR cung cấp tín hiệu về số lượng và môi trường hóa học của các proton. Phổ 13C-NMR xác định số nguyên tử carbon trong bộ khung triterpene và mạch đường. Các kỹ thuật phổ hai chiều như HSQC, HMBC, COSY và NOESY thiết lập mối liên kết không gian và vị trí gắn các gốc đường glycoside. Khối phổ phân giải cao (HR-ESI-MS) xác định chính xác công thức phân tử và khối lượng ion phân tử. Dữ liệu phổ đối chiếu với tài liệu khoa học giúp định danh chuẩn xác cấu trúc hóa học của các hoạt chất mới.

IV. Kết luận cấu trúc và ứng dụng phân đoạn Et40

Quá trình nghiên cứu phân đoạn Et40.7 từ rễ cây Dương đầu đã xác định thành công hai hợp chất saponin mới. Chất thứ nhất mang mã hiệu OI1 là 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-beta-D-glucopyranosyl-(1→3)-beta-D-glucopyranosyloleanolic acid. Hợp chất OI1 có khối lượng tinh khiết đạt 61,7 mg. Chất thứ hai mang mã hiệu OI5 là 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-beta-D-glucopyranosyl-(1→3)-beta-D-glucopyranosyloleanolic acid 28-O-beta-D-glucopyranosyl ester với khối lượng 13 mg. Cả hai phân tử đều thuộc nhóm saponin triterpenoid có khung oleanane hiếm gặp trong chi Olax. Đây là phát hiện khoa học đầu tiên khẳng định sự hiện diện của hai chất này trong tự nhiên. Các công trình trước đây về chi Olax ghi nhận khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và ức chế nấm gây hại vượt trội. Kết quả nghiên cứu bổ sung dữ liệu hóa thực vật giá trị cho loài Olax imbricata tại Việt Nam. Phát hiện cấu trúc mới này mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn trong nghiên cứu dược phẩm mới và bào chế thuốc chống viêm tự nhiên.

4.1. Cấu trúc hóa học chi tiết của hai hợp chất mới OI1 và OI5

Hai saponin mới cô lập thành công đều mang khung aglycone oleanolic acid đặc trưng. Hợp chất OI1 gắn bốn đơn vị đường gồm hai phân tử rhamnose và hai phân tử glucose tại vị trí C-3. Hợp chất OI5 chứa tới năm phân tử đường. Bốn gốc đường gắn theo chuỗi tại vị trí carbon C-3 tương tự OI1 nhưng khác biệt về trật tự liên kết glycoside. Ngoài ra, phân tử OI5 gắn thêm một gốc glucose tại vị trí ester C-28. Cấu trúc phức tạp này được làm sáng tỏ trọn vẹn nhờ hệ phổ NMR đa chiều kết hợp phổ MS. Bộ dữ liệu cung cấp bằng chứng hóa học mới cho hệ thống phân loại học loài Olax imbricata.

4.2. Tiềm năng ứng dụng sinh học và phát triển dược liệu

Nhiều nghiên cứu quốc tế đã chứng minh các loài cùng chi như Olax subscorpioidea hay Olax scandens có hoạt tính sinh học xuất sắc. Dịch chiết từ các loài này thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và nấm gây bệnh. Saponin triterpenoid từ rễ Olax imbricata được kỳ vọng sở hữu hoạt tính kháng viêm mạnh mẽ. Ngoài ra, cấu trúc khung oleanolic acid glycoside thường có triển vọng ngăn ngừa tế bào ung thư và chống oxy hóa. Việc xác định thành phần hóa học phân đoạn Et40.7 tạo tiền đề quan trọng cho các thử nghiệm sàng lọc dược lý in vitro tiếp theo. Kết quả nghiên cứu thúc đẩy tiềm năng bảo tồn và khai thác cây dược liệu Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Y học cổ truyền đóng vai trò nền tảng trong hệ thống chăm sóc sức khỏe ban đầu tại các quốc gia đang phát triển. Theo số liệu từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) được tác giả trích dẫn, khoảng 80% dân số ở những khu vực này vẫn dựa vào các bài thuốc từ thảo dược tự nhiên. Xu hướng nghiên cứu dược học hiện đại đòi hỏi sự chuyển dịch từ việc ứng dụng dược liệu thô sang phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của từng hoạt chất tinh khiết, làm cơ sở khoa học cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học và phát triển thuốc mới.

Tại Việt Nam, nguồn tài nguyên thực vật ghi nhận sự hiện diện của cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.), loài thực vật thuộc họ Dương đầu (Olacaceae). Trong kinh nghiệm dân gian, loài này được dùng để hỗ trợ điều trị các chứng bệnh liên quan đến viêm nhiễm và nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học của cây Dương đầu tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Tiếp nối các nghiên cứu trước đó của nhóm nghiên cứu về các phân đoạn ít phân cực, khóa luận này tập trung vào các phân đoạn có độ phân cực cao nhằm khai thác nhóm hợp chất saponin triterpenoid. Đề tài "Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Et40.7 điều chế từ cao chiết methanol từ rễ cây Dương đầu, Olax imbricata" được thực hiện nhằm bổ sung dữ liệu hóa thực vật cho loài cây này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

1. Vận dụng các phương pháp thực nghiệm để khảo sát thành phần hóa học của cao phân đoạn Et40.7 điều chế từ cao chiết methanol từ rễ cây Dương đầu (Olax imbricata).
2. Triển khai quy trình phân tách, tinh sạch để thu nhận các hợp chất tinh khiết từ các tiểu phân đoạn.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết phân lập được thông qua các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (phổ NMR và MS).
4. Tạo dựng cơ sở dữ liệu làm tiền đề cho các định hướng đánh giá hoạt tính sinh học tiếp theo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Phân đoạn Et40.7 điều chế từ cao chiết methanol của phần rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.). Mẫu thực vật thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020, được giám định bởi chuyên gia thực vật và lưu giữ tiêu bản ký hiệu UTE-A002 tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi nghiên cứu: Toàn bộ quá trình thực nghiệm chiết tách, sắc ký tinh sạch và cô lập hợp chất được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh; các phép đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) thực hiện tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; phân tích khối phổ phân giải cao (HRESIMS) thực hiện tại Viện Công nghệ Tiên tiến. Khóa luận được hoàn thiện vào tháng 7 năm 2025.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Cơ sở lý thuyết và đối tượng hóa thực vật

Cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.) thuộc chi Olax, họ Olacaceae, bộ Santalales. Chi Olax trên thế giới có khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Úc. Các nghiên cứu hóa thực vật trước đây trên các loài thuộc chi này cho thấy sự hiện diện của các nhóm hợp chất: hợp chất béo, polyphenol, flavonoid glycoside, alkaloid và saponin triterpenoid.

Nhóm hợp chất saponin triterpenoid ở chi Olax phần lớn sở hữu khung aglycone dạng oleanane (điển hình là acid oleanolic hoặc hederagenin), liên kết với các mạch đường tại vị trí C-3 hoặc cả hai vị trí C-3 và C-28 (bidesmosidic saponin). Khóa luận kế thừa cơ sở lý thuyết này để định hướng phân lập các saponin phân cực trong rễ cây Olax imbricata.

Phương pháp nghiên cứu chiết tách và phân lập

Quy trình thực nghiệm kết hợp nhiều kỹ thuật sắc ký phân tách từ quy mô cột lớn đến tinh chế vi lượng:

• Chiết xuất hồi lưu: Chiết hồi lưu bột rễ bằng dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ cao để thu hồi cao tổng EtOH.
• Chiết phân bố lỏng - lỏng: Phân tán cao EtOH lần lượt vào hai dung môi có độ phân cực khác nhau là n-hexane và methanol, thu được cao n-hexane (chứa các chất kém phân cực) và cao methanol (tập trung các hợp chất phân cực trung bình đến cao).
• Sắc ký cột chất hấp phụ Diaion HP-20: Phân tách cao methanol bằng cột Diaion HP-20, rửa giải bằng hệ dung môi ethanol - nước với tỷ lệ ethanol tăng dần từ 20% đến 96%, sau đó rửa cột bằng acetone.
• Sắc ký cột silica gel pha thường (Column Chromatography): Sử dụng silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm làm pha tĩnh, pha động là các hệ dung môi hữu cơ có độ phân cực thay đổi (ethyl acetate - methanol, chloroform - methanol, chloroform - methanol - nước).
• Sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 nhôm (độ dày 250 μm), soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện vết bằng dung dịch thuốc thử vanillin - sulfuric acid kèm gia nhiệt.
• Sắc ký lớp mỏng điều chế (Prep-TLC): Áp dụng để phân tách các phân đoạn có khối lượng nhỏ và khó tách trên cột silica gel thông thường.
• Sắc ký lọc gel trên Sephadex LH-20: Sử dụng pha động 100% methanol để tinh sạch vết cuối cùng dựa trên kích thước phân tử và loại bỏ triệt để lượng silica gel tan lẫn trong dung môi sau quá trình chạy prep-TLC.

Phương pháp phân tích xác định cấu trúc hóa học

• Khối phổ phân giải cao (HRESIMS): Ghi trên hệ thống X500R QTOF (Sciex) nhằm xác định chính xác khối lượng phân tử phân giải cao, từ đó thiết lập công thức phân tử thực nghiệm của hợp chất.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1D-NMR): Ghi phổ 1H-NMR ở tần số 600 MHz và phổ 13C-NMR ở tần số 125 MHz trên thiết bị AVANCE III HD (Bruker) để xác định độ dịch chuyển hóa học ($\delta$), độ tích hợp tín hiệu, hằng số ghép spin ($J$) và trạng thái lai hóa của các nguyên tử carbon, proton.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR): Sử dụng các kỹ thuật phổ tương tác proton - proton COSY, phổ tương quan dị nhân qua một liên kết HSQC và phổ tương quan dị nhân qua nhiều liên kết HMBC nhằm kết nối khung aglycone và xác định trật tự liên kết của các đơn vị đường pyranose.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về cây Dương đầu, Olax imbricata Roxb.

Chương này tổng thuật toàn diện các dữ liệu khoa học về loài nghiên cứu:

• Vị trí phân loại học và hình thái thực vật: Xác lập vị trí của loài trong hệ thống thực vật (Giới Plantae, Ngành Tracheophyta, Lớp Magnoliopsida, Bộ Santalales, Họ Olacaceae, Chi Olax, Loài Olax imbricata Roxb.). Mô tả chi tiết hình thái cây thường xanh cao 3 – 8 m, dạng bụi đứng hoặc thân leo; cành xám không lông; lá bầu dục 7 – 10 cm x 2,5 – 3,5 cm; hoa trắng lưỡng tính mọc thành chùm 3 – 7 hoa; quả hạch hình cầu/trứng ngược 2,5 – 3 cm; hệ rễ cọc kết hợp rễ nhánh dày đặc màu nâu nhạt.
• Thành phần hóa học chi Olax: Tổng kết các công trình trước đây: các acid béo phân lập từ rễ O. imbricata bởi Võ Thị Ngà và cộng sự (2018); 6 dẫn xuất polyphenol phân lập năm 2019; các flavonoid glycoside của kaempferol trong O. mannii và O. nana; các acid hữu cơ (syringic, caffeic, rosmarinic...); các hợp chất triterpenoid saponin dạng olaxoside và saponin oleanane từ O. wildemanii, O. subscorpioidea; các amino acid và dẫn xuất nitrogen như S-ethenylcysteine trong O. phyllanthi.
• Hoạt tính sinh học: Trình bày các nghiên cứu đã công bố về hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn (Usman 2008; Ajali & Okoye 2009; Abdul 2020); hoạt tính kháng viêm và giảm đau (Ishola 2023); hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình chuột (Ezeani 2024); đặc biệt là nghiên cứu năm 2018 của Võ Thị Ngà và cộng sự chứng minh cao chiết rễ cây Dương đầu tại Phú Yên có khả năng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase liên quan đến chuyển hóa đường huyết.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Nội dung chương trình bày chi tiết danh mục hóa chất, nguồn gốc thiết bị và chuỗi quy trình thực nghiệm điều chế:

• Xử lý mẫu ban đầu: 50 kg rễ tươi sau khi làm sạch, sấy ở 60 – 70 ℃ và xay nhỏ thu được 7 kg bột nguyên liệu khô. Bột rễ được trích nóng hồi lưu với ethanol 96%, cô hồi lưu thu được 1,5 kg cao thô EtOH. Chiết phân bố cao thô EtOH bằng n-hexane thu 600 g cao n-hexane và phần cắn được hòa tan trong methanol thu 750 g cao MeOH.
• Phân tách trên Diaion HP-20: 600,0 g cao MeOH được nạp lên cột Diaion HP-20, rửa giải bằng ethanol - nước thu được các phân đoạn: Et20 (54,30 g), Et40 (65,33 g), Et60 (84,06 g), Et80 (35,53 g / 45,47 g), Et96 (45,47 g) và acetone (1,69 g).
• Phân tách phân đoạn Et40: Cao Et40 (65,33 g) qua sắc ký cột silica gel pha thường với hệ chloroform - methanol thu các phân đoạn nhỏ; trong đó phân đoạn Et40.2 tiếp tục tách ra 6 phân đoạn và phân đoạn Et40.6 tách thành 12 phân đoạn nhỏ.
• Quy trình khảo sát hai phân đoạn Et40.4 và Et40.7: Thiết lập các sơ đồ chiết tách chi tiết cho phân đoạn Et40.4 (1,5618 g) và Et40.7 (12 g) thông qua sắc ký cột silica gel, sắc ký cột chân không, prep-TLC và lọc gel Sephadex LH-20.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương tập trung báo cáo kết quả thực nghiệm cô lập và giải cấu trúc các hợp chất:

• Phân lập từ phân đoạn Et40.4:
  • Sắc ký cột phân đoạn Et40.4 bằng hệ ethyl acetate - methanol (70:30 $\rightarrow$ 0:100) thu 4 phân đoạn; phân đoạn Et40.3 được chọn để chạy cột tiếp bằng hệ chloroform - methanol - nước (10:5:1), thu 7 phân đoạn nhỏ (Et40.PD1 đến Et40.PD7).
  • Phân đoạn Et40.PD4 (138 mg) qua 3 lần sắc ký cột silica gel và tinh sạch qua Sephadex LH-20 bằng MeOH 100% thu được hợp chất OI1 (23,3 mg).
  • Phân đoạn gộp Et40.PD5 và Et40.4 (111,5 mg): Thử nghiệm cho thấy hệ chloroform - methanol - nước - formic acid (10:5:1:5 giọt) cho khả năng tách tốt. Nhằm tránh acid làm hư hỏng chất trên cột silica gel lớn, phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (prep-TLC) được lựa chọn. Thực nghiệm khảo sát số lần giải ly chứng minh việc khai triển 2 lần là tối ưu; giải ly 1 lần vết chưa tách rời, trong khi giải ly 3 lần làm hệ số $R_f$ tăng quá cao sát mép bản mỏng gây thất thoát mẫu. Sau 5 lần chạy prep-TLC và tinh sạch bằng Sephadex LH-20 loại bỏ silica gel dư, thu được OI3 (4,7 mg) và OI4 (4,9 mg).
  • Phân đoạn Et40.PD2 và Et40.PD6 qua cột Sephadex LH-20 thu được OIPD4.3 (20,3 mg).
• Phân lập từ phân đoạn Et40.7:
  • 12 g cao Et40.7 qua sắc ký cột chân không với hệ ethyl acetate - methanol thu 5 phân đoạn. Phân đoạn Et40.EA80 được sắc ký cột silica gel thu 18 phân đoạn nhỏ.
  • Phân đoạn Et40.10 qua sắc ký cột và lọc gel Sephadex LH-20 thu thêm 38,4 mg OI1 (nâng tổng lượng OI1 thu được lên 61,7 mg).
  • Phân đoạn Et40.16 qua cột silica gel và Sephadex LH-20 thu được OI5 (13 mg) và OI6 (9,3 mg).
• Xác định cấu trúc hóa học hai hợp chất saponin mới:
  • Dựa trên phân tích tương quan 1D-NMR, 2D-NMR (HSQC, HMBC, COSY) và HRESIMS:
    • Hợp chất OI1: Xác định có khung aglycone là acid oleanolic kết hợp chuỗi tetrasaccharide gắn tại vị trí C-3: 3-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic acid.
    • Hợp chất OI5: Xác định là một saponin bidesmosidic với khung oleanolic acid, mang chuỗi tetrasaccharide tại C-3 và một đơn vị đường đơn tại C-28 dạng ester: 3-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic acid 28-O-$\beta$-D-glucopyranosyl ester.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã hoàn thành quy trình thực nghiệm chiết tách từ nguyên liệu thô đến việc cô lập thành công các hợp chất tinh khiết có độ phân cực cao.

Ký hiệu hợp chất / phân đoạn	Khối lượng tinh sạch (mg)	Phân đoạn nguồn	Kỹ thuật tinh sạch cuối cùng	Tình trạng xác định cấu trúc
OI1	61,7	Et40.4 và Et40.7	Sephadex LH-20 (100% MeOH)	Đã giải cấu trúc (Saponin mới)
OI5	13,0	Et40.7	Sephadex LH-20 (100% MeOH)	Đã giải cấu trúc (Saponin mới)
OI6	9,3	Et40.7	Sephadex LH-20 (100% MeOH)	Đang chờ phân tích phổ
OI3	4,7	Et40.4	Prep-TLC + Sephadex LH-20	Đang chờ phân tích phổ
OI4	4,9	Et40.4	Prep-TLC + Sephadex LH-20	Đang chờ phân tích phổ
OIPD4.3	20,3	Et40.4	Sephadex LH-20 (100% MeOH)	Đang chờ phân tích phổ

Khóa luận đóng góp trực tiếp vào lĩnh vực hóa thực vật hai phát hiện cấu trúc mới:

1. Hợp chất OI1: Khối lượng 61,7 mg, tên khoa học: 3-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic acid.
2. Hợp chất OI5: Khối lượng 13,0 mg, tên khoa học: 3-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic acid 28-O-$\beta$-D-glucopyranosyl ester.

Tác giả khẳng định OI1 và OI5 là hai hợp chất hoàn toàn mới, lần đầu tiên được phát hiện và phân lập từ loài Olax imbricata. Công trình cung cấp bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR, HSQC, HMBC, COSY) và phổ khối HRESIMS nguyên vẹn của hai phân tử này. Kết quả này bổ sung minh chứng thực nghiệm về sự đa dạng của các saponin triterpenoid khung oleanane trong họ Olacaceae.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế kỹ thuật và phạm vi thực nghiệm:

• Trong tổng số tám hợp chất/phân đoạn tinh khiết được phân lập (bao gồm OI1, OI3, OI4, OI5, OI6, OIPD4.3...), công trình mới chỉ hoàn thành việc đo đạc và giải mã cấu trúc hoàn chỉnh cho 2 hợp chất (OI1 và OI5). Các hợp chất còn lại chưa kịp xác định cấu trúc do hạn chế về thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp.
• Khối lượng một số chất thu nhận được sau quá trình tinh chế qua nhiều bước còn rất thấp (như OI3 đạt 4,7 mg; OI4 đạt 4,9 mg), do hiện tượng thất thoát mẫu và lẫn silica gel qua bản prep-TLC.
• Đề tài chỉ dừng lại ở bước phân lập hóa học và giải phổ cấu trúc, chưa tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (kháng khuẩn, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase...) trực tiếp trên các chất tinh khiết thu được.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tiếp tục phân tích dữ liệu phổ NMR và MS để giải đoán cấu trúc cho các chất còn lại (OI3, OI4, OI6, OIPD4.3).
• Mở rộng quy mô chiết tách để thu hồi lượng lớn hơn các hợp chất OI1 và OI5 nhằm phục vụ cho các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính dược lý chuyên sâu, đặc biệt là hoạt tính kiểm soát đường huyết và kháng viêm.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Công nghệ Kỹ thuật Hóa học:

• Giá trị quy trình thực nghiệm: Cung cấp thông số vận hành thực tế cho quy trình phân tách các hỗn hợp saponin phân cực cao. Tài liệu chỉ rõ cách thức kết hợp linh hoạt giữa sắc ký cột silica gel, sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 và sắc ký lớp mỏng điều chế (prep-TLC).
• Giá trị xử lý kỹ thuật: Cung cấp giải pháp xử lý mẫu khi hệ dung môi giải ly bắt buộc phải chứa chất biến tính là acid formic (nhằm chống kéo đuôi cho saponin acid) thông qua việc sử dụng prep-TLC giải ly lặp lại 2 lần, sau đó lọc gel để loại bỏ hoàn toàn silica gel bị bong tróc.
• Giá trị dữ liệu phổ: Phần biện luận cấu trúc hóa học của OI1 và OI5 là tài liệu tham khảo điển hình về kỹ thuật phân tích phổ NMR 2 chiều đối với các phân tử glycoside phức tạp chứa nhiều đơn vị đường pyranose (xác định vị trí liên kết glycosidic qua tương quan HMBC giữa proton anomer của đường với carbon aglycone hoặc carbon của đường kế cận).

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nguyên liệu rễ cây Dương đầu được thu hái tại đâu và quy trình điều chế cao thô ban đầu diễn ra như thế nào?
Rễ cây Dương đầu được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020, được giám định tên khoa học là Olax imbricata Roxb. bởi ông Hoàng Xuân Lâm (Trung tâm Nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung). 50 kg rễ tươi sau khi làm sạch, sấy ở 60 – 70 ℃ thu được 7 kg bột khô. Bột này được trích nóng hồi lưu với ethanol 96%, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được 1,5 kg cao thô EtOH. Cao EtOH tiếp tục hòa tan phân bố lỏng - lỏng thu 600 g cao n-hexane và 750 g cao MeOH.

2. Sắc ký cột Diaion HP-20 đã phân tách 600 g cao MeOH thành các phân đoạn nào?
Quá trình sắc ký cột trên chất hấp phụ Diaion HP-20 giải ly bằng hệ ethanol - nước có độ phân cực giảm dần thu được 6 phân đoạn: Et20 (54,30 g), Et40 (65,33 g), Et60 (84,06 g), Et80 (35,53 g / 45,47 g), Et96 (45,47 g) và phân đoạn xả cột bằng acetone (1,69 g).

3. Tại sao tác giả phải chuyển sang kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế (prep-TLC) đối với phân đoạn gộp Et40.PD5 và Et40.4?
Khi khảo sát hệ dung môi giải ly, hệ chloroform - methanol - nước (10:6:1 và 10:5:1) không đạt yêu cầu phân tách, trong khi hệ có bổ sung formic acid (10:5:1:5 giọt) cho vết sắc nét và tách biệt rõ rệt. Tuy nhiên, việc đưa formic acid vào sắc ký cột silica gel truyền thống có nguy cơ làm hư hại chất hấp phụ và gây thủy phân các liên kết glycoside của saponin. Do đó, tác giả chuyển sang prep-TLC để kiểm soát thời gian tiếp xúc của acid, bảo toàn cấu trúc hợp chất và dễ thu hồi dải vết.

4. Hai hợp chất mới được xác định cấu trúc trong khóa luận có đặc điểm hóa học là gì?
Hai hợp chất mới đều là saponin triterpenoid có khung aglycone là acid oleanolic:

• Hợp chất OI1 (61,7 mg): Là monodesmosidic saponin, mang chuỗi 4 đơn vị đường liên kết tại C-3: 3-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic acid.
• Hợp chất OI5 (13,0 mg): Là bidesmosidic saponin, mang chuỗi 4 đơn vị đường tại C-3 và 1 đơn vị đường $\beta$-D-glucopyranosyl gắn tại nhóm carboxyl C-28 qua liên kết ester: 3-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic acid 28-O-$\beta$-D-glucopyranosyl ester.

5. Vì sao khối lượng phân đoạn Et40.3 bị giảm mạnh sau bước sắc ký lọc gel Sephadex LH-20?
Khối lượng ghi nhận ban đầu của phân đoạn thu từ prep-TLC có lẫn một lượng lớn chất hấp phụ silica gel bị cạo kèm từ bản mỏng. Khi hòa tan mẫu và nạp qua cột lọc gel Sephadex LH-20 với dung môi methanol 100%, chỉ có các hợp chất hữu cơ tan và đi qua cột, còn lượng silica gel không tan bị giữ lại và loại bỏ hoàn toàn, dẫn đến khối lượng thực tế của hoạt chất tinh khiết thấp hơn đáng kể so với khối lượng thô ban đầu.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Kim Duyên và Hoàng Trọng Bảo Phúc đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học phân đoạn Et40.7 từ cao chiết methanol của rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.). Thông qua việc phối hợp các kỹ thuật sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20, đề tài đã phân lập được 8 hợp chất và phân đoạn tinh khiết. Dữ liệu phổ nghiệm NMR và HRESIMS đã giải mã thành công cấu trúc của hai saponin triterpenoid mới là OI1 và OI5, góp phần mở rộng đáng kể hiểu biết khoa học về nguồn tài nguyên dược liệu chi Olax tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯƠNG ĐẦU, Olax imbricata Roxb. Giới thiệu về cây Dương đầu, Olax imbricata Roxb. Phân loại khoa học và phân bố Cây Dương Đầu là loại thực vật nằm trong họ Dương đầu, Olacaceae; thuộc chi Olax.

Loại cây này có tên khoa học là Olax imbricata Roxb. Đồng thời, cây còn có các tên thông thường khác: Dương đầu kết lợp, cây cát lộ, cây mao trật. Phân loại khoa học của cây Dương đầu [3] Phân loại khoa học Giới Plantae Ngành Tracheophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Santalaes Họ Olacaceae Chi Olax Loài Olax imbricata Họ Olacaceae, thuộc bộ Santalales là một nhóm thực vật có hoa, bao gồm khoảng 25 chi và 250 loài. Các loài trong họ này thường là cây gỗ, cây bụi hoặc dây leo, một số loài có tính chất bán ký sinh trên rễ.

Họ này phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới trên toàn thế giới, chủ yếu tập trung ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới – đặc biệt là ở những khu vực rừng rậm tại châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Điển hình, chi Olax có khoảng 40 loài phân bố ở châu Phi và châu Á nhiệt đới, trong khi chi Heisteria với khoảng 33 loài được tìm thấy ở vùng nhiệt đới châu Mỹ và châu Phi. Theo dữ liệu từ GBIF [4], có tổng cộng 23.477 mẫu ghi nhận về họ này, trong đó có 10.098 mẫu có hình ảnh và 10.228 mẫu có thông tin địa lý. 1 Chi Olax được mô tả lần đầu tiên vào năm 1818 bởi Robert Brown trong tác phẩm "Narrative of an Expedition to Explore the River Zaire in South Africa in 1816” [5].

Chi Olax có khoảng 40 loài phân bố rải rác ở châu Á, châu Phi và châu Úc thường mọc trong rừng gió mùa và rừng mưa trên cao với phạm vi độ cao từ gần mực nước biển đến 500 m. Tại châu Á, chúng xuất hiện ở các quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia và Indonesia. Ở châu Phi, các chi Olax phân bố rộng rãi từ khu vực Tây Phi đến Đông Phi và Nam Phi. Tại châu Úc, chúng được ghi nhận ở miền bắc và miền đông của lục địa này.

Còn ở tại Việt Nam, cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.) được tìm thấy đầu tiên ở vùng núi Đakrông, thuộc khu bảo tồn thiên nhiên Đakrông nằm trong địa phận tỉnh Quảng Trị. Cây Dương Đầu phân bố đồng đều từ Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng tới Phú Yên. Hiện tại, cây Olax imbricata Roxb. đang được trồng và chăm sóc tại tỉnh Phú Yên.

Mô tả thực vật Cây Olax imbricata Roxb. là một chi của cây thường xanh cao khoảng 3 – 8 m, dạng cây bụi đứng, thân gỗ, nhánh mọc xà, đôi khi có thể tìm thấy ở dạng dây leo phân bố rộng rãi ở vùng rừng nhiệt đới thường xanh. Thân cây màu nâu, trong khi các cành non thường mang sắc xám không lông, cho thấy đặc tính của cây gỗ non. Lá của cây Olax imbricata Roxb.

được xếp thành hai dãy đối so le. Lá có phiến bầu dục tròn dài, dài 7 - 10 cm, chiều rộng từ 2,5 đến 3,5 cm, với 6 – 9 cặp gân lá đối xứng tạo nên vẻ đẹp hình học tự nhiên, không lông, dai. Cả hai mặt lá đều nhẵn, trong đó mặt trên có màu lục bóng và mặt dưới có màu nhạt hơn; cuống lá ngắn cỡ 6 – 8 mm, tròn và không quá nổi bật. [2],[6] Hoa của cây mọc thành chùm nhỏ ở kẽ lá hoặc đầu cành.

Chúng mang tính lưỡng tính và đối xứng, với cánh hoa thuôn dài khoảng 8 – 10 mm, màu trắng, khi khô cánh hoa hơi ngả vàng. Kích thước của mỗi bông hoa dao động từ 1,5 đến 2,5 cm, với cấu trúc gồm một bầu nhụy, hai thùy và các chỉ nhị (trong đó nhị chính thường ngắn và có thêm các nhị lép bên ngoài). Cuống hoa có độ dài 1 – 3 mm và các bông hoa thường xuất hiện 2 thành cụm từ 3 đến 7 bông, không phân nhánh. Mỗi cụm hoa có nhiều hoa và đài hoa rất nhỏ.

Quả của Olax imbricata Roxb. có dạng hạch, thường có hình cầu hoặc trứng ngược, có đường kính khoảng 2,5 – 3 cm. Quả được bao bọc một phần bởi đài hoa – phần còn lại của hoa sau khi ra quả vẫn còn tồn tại. Bên trong chứa một hạt khoảng 1,8 x 1,8 cm với phôi nhỏ nằm gần đỉnh của hạt.

Phôi nhỏ, dài khoảng 2 mm, phồng lên ở giữa. Bộ rễ của cây Olax imbricata có hệ thống rễ cọc kết hợp với các rễ nhánh phát triển mạnh. Rễ chính lớn nằm ở trung tâm, đóng vai trò trụ cột, từ đó phân tỏa ra nhiều rễ phụ xung quanh. Các rễ phụ có kích thước nhỏ hơn nhưng dài và chắc chắn, tạo thành một mạng lưới dày đặc, giúp cây bám đất tốt và hấp thu dinh dưỡng hiệu quả.

Bộ rễ có màu nâu nhạt với bề mặt sần sùi, đặc trưng cho cây rừng nhiệt đới. Kiểu rễ cho thấy sự thích nghi vượt trội của cây trong điều kiện môi trường đất rừng thường xanh, giúp cây ổn định và phát triển tốt trên các loại đất khác nhau. Cây ra hoa chủ yếu từ tháng 4 đến tháng 10, tạo nên một khoảng thời gian sinh trưởng kéo dài trong năm. Hình ảnh cây Dương đầu 3 A B C D Hình 1.

Hình ảảnh các bộộ phận ậ củaủ cây Dương đầu [3],[7] ương đầ A –– thân cây; B –– hoa; C –– rễ ể cây; D –– lá và quả ả 1. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học Từ thập niên 20, các nhà nghiên cứu hóa học đã có sự chú ý đến chi Olax với một số loài điển hình như Olax andronensis, Olax glabriflora, Olax puttacorum, Olax phyllanthi và Olax mannii. Gần đây, đã có thêm một vài tài liệu nghiên cứu về cây Olax imbricata. Mặc dù, cây dương đầu là nguồn dược liệu triển vọng phù hợp với thổ nhưỡng Việt Nam nhưng vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.

Từ các nghiên cứu về chi Olax nói chung và Olax imbricata Roxb. nói riêng đã xác nhận sự hiện diện của các hợp chất như phenolic, flavonoid glycoside, saponin, alkaloid và anthraquinone. Hợp chất béo Ở Việt Nam, năm 2018, từ cao chiết ethyl acetate của rễ cây Olax imbricata, Võ Thị Ngà và cộng sự đã phân lập được ba hợp chất béo (E)-henicos-7-en-9-ynoic acid (1), 4 (E)-henicos-7-en-9-ynoylglycerol (2) và 6,7,8,9-tetrahydroxyhexadeca-4,10-diynoic acid (3). Hợp chất polyphenol Vào năm 2019, Võ Thị Ngà cùng nhóm nghiên cứu của mình đã phân lập các hợp chất phenolic gồm 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-8-(3-hydroxy-4-O-β-D- glucopyranosylphenyl)octan-5-ol-4-one (7); (4E)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-4-(3- hydroxy-4-O-β-D-glucopyranosylphenyl)hept-4-en-6-ol-3-one (8); 1-O-(4-hydroxy- 2,6-dimethoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranose (9); 1-O-(4-hydroxy-2-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D- glucopyranose (10); leonuriside A (11); vanillic acid (12).

[10] 5 (7) (8) STT R 9 H 10 OCH3 (12) (11) 6 Riêng về phần hợp chất nhóm flavonoid thì được tìm thấy đặc biệt nhiều trong chi Olax. Các hợp chất nhóm flavonoid thường chỉ hiện diện trong phần lá và trái của những cây thuộc chi Olax. Vào năm 1983, Kimiko Nakano và các cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất kaempferol 3-O-α-L-arabinofuranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (13), kaempferol 3-O-β-D- xylopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (14). Okoye và cộng sự nghiên cứu dịch chiết của methanol của lá cây Olax mannii thu hái ở Zaria phía bắc Nigeria, đã phân lập được ba hợp chất mới là kaempferol-3-O-[α-D-apiofuranosyl-(1→2)-α-L- arabinofuranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside (26), kaempferol 3-O-[β-D- glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinofuranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside (27), kaempferol-3-O-[β-D-arabinopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside]-7-O-α-L- rhamnopyranoside (28).

Okoye và cộng sự lại tiếp tục nghiên cứu từ phân đoạn butanol của dịch chiết methanol lá cây Olax mannii Oliv, đã phân lập được tiếp hai hợp chất mới là kaempferol 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2) α-L-arabinofuranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside (29) và kaempferol 3-O-[α-L- apiofuranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside (30). Một nhóm khoa học ở Pakistan do M. Ovais nghiên cứu về chiết xuất methanol của lá cây loài Olax nana đã cho thấy sự hiện diện hàm lượng lớn các dẫn xuất acid hữu cơ, còn lại là các hợp chất phenolic như vanillic acid (35), p-hydroxybenzoic acid (36), caftaric acid (37), isovitexin-4-O-glucoside (38), kaempferol-7-O-glucoside (39) và chicoric acid (40). [21] (34) (35) (36) (37) (38) 8 (13 – 33 và 39) STT R1 R2 R3 R4 R5 R6 STT R1 R2 R3 R4 R5 R6 13 Ara OH H H Rhm H 24 Xyl OH H H H H 14 H OH H H Rhm H 25 Xyl OH H OH H H 15 Glu OH H H H H 26 Api- OH H H Rhm H (1→2)- Ara 16 Rhm OH H H Rhm H 27 Glu- OH H H Rhm H (1→2)- Ara 17 Gal OH OH H H H 28 Ara- OH H H Rhm H (1→4)- Rhm 18 Glu- OH H H Rhm H 29 Rhm- OH H H Rhm H (1→4)- (1→2)- Rhm Ara 19 Rhm OH OH H Rhm H 30 Api- OH H H Rhm H (1→2)- Gal 20 Xyl OH H H Rhm H 31 Rhm- OH H H H OH (1→6)- Glu 21 Rhm OH H H H H 32 H OH H OH H H 22 Xyl OH OH H H H 33 H OH H H H OH 23 Rhm OH H OH H H 39 H OH H H Glu H Ghi chú: Api: α-D-apiofuranosyl; Ara: α-L-arabinofuranoside; Gal: β-D-galactopyranoside; Glu: β-D-glucopyranosyl; Rhm: α-L-rhamnopyranosyl; Xyl: β-D-xylopyranoside 9 1.

Hợp chất acid hữu cơ Năm 2018, nhóm khoa học do M. Ovais nghiên cứu chiết xuất MeOH của lá và thân cây Olax nana sử dụng phương pháp HPLC xác định sự tồn tại của một số acid: syringic acid (40), caffeic acid (41), chicoric acid (42), rosmarinic acid (43), caftaric acid (44), caffeoylmalic acid (45). Sule đã phân lập từ cao chiết ether dầu hỏa lá cây Olax mannii được hợp chất (2E)-3-methyl-5-phenyl-2-pentenoic acid (46). Hợp chất triterpenoid Năm 1985, Forgacs và Provost đã nghiên cứu dịch chiết methanol từ lá, rễ và vỏ của các loài Olax andronensis, Olax glabriflora và Olax puttacorum, qua đó phát hiện và mô tả một hợp chất saponin được gọi là olaxoside hay 28-β-D-Glucopyranosyl 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolate (47) [23].

Năm 2013, Wie Jong KWAK và cộng sự đã nghiên cứu loài Lonicera japonica và phân lập được hợp chất triterpenoid là loniceroside C hay este 3-O-β-D-glucopyranosyl hederagenin 28-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl(1→6)]-β-D- glucopyranosyl (48) [24] Đến năm 2011, M. Sule cùng cộng sự tiến hành nghiên cứu dịch chiết acetone từ lá cây Olax mannii, đã phân lập được hai hợp chất triterpenoid là glutinol (49) và rhoiptelenol (50) [22]. Không chỉ thế vào năm 2020, từ dịch chiết methanol của lá cây Olax psittacorum, R. Majumder và cộng sự đã tìm thấy một diterpenoid là β-sitosterol (51) đã được xác định.

[25] Vào năm 2018, Pertuit cùng các cộng sự đã nghiên cứu các thành phần hóa học từ vỏ và rễ của loài Olax wildemanii và Olax subscorpioidea. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được bốn hợp chất saponin triterpenoid có khung oleanane, 3-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic acid (52), 3-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D- 11 glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (53), 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β- D-glucuronopyranosyloleanolic acid (54) và 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D- glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucuronopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (55). Các hợp chất này đã góp phần làm sáng tỏ sự đa dạng cấu trúc saponin trong loài Olax wildemanii và Olax subscorpioidea. Đặc điểm của các saponin ở chi Olax Các loại STT Loài Aglycon Vị trí glycosyl hóa đường O.glabriflora oleanolate 3-O-Rhm-(1→4)-Glu Glu O.puttacorum Glu, Lonicera 3-O-Glu 48 hederagenin Rhm, japonica 28-O-Rhm-(1→2)-[Xyl-(1→6)]-Glu Xyl O.