Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và dược học, thực vật từ lâu đã là nguồn cung cấp dược liệu quan trọng phục vụ điều trị và chăm sóc sức khỏe. Sự gia tăng các tác dụng phụ từ thuốc tổng hợp cùng vấn đề dược phẩm giả, kém chất lượng trên thị trường thúc đẩy xu hướng nghiên cứu, khai thác các hoạt chất sinh học tự nhiên. Việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ các loài thực vật chưa qua nghiên cứu là bước đi nền tảng nhằm đánh giá tiềm năng dược lý và cung cấp cơ sở dữ liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm.

Chi Trà (Camellia), thuộc họ Chè (Theaceae), là một chi thực vật lớn với giá trị kinh tế và y học cao. Nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã ghi nhận các thành phần hóa thực vật trong chi này sở hữu hoạt tính sinh học đa dạng như chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, bảo vệ hệ thần kinh và ngăn ngừa ung thư. Năm 2024, loài trà mới Camellia hoaana H. (Trà hòa) lần đầu tiên được phát hiện và công bố khoa học tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước. Do đây là loài đặc hữu mới được ghi nhận, các dữ liệu về thành phần hóa học của cây vẫn còn là một khoảng trống nghiên cứu.

Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học (chuyên ngành Hóa hữu cơ) tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh do sinh viên Nguyễn Phú Nghĩa và Nguyễn Thị Tuyết Phương thực hiện, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Linh Nhâm, đã đặt ra 3 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Điều chế cao phân đoạn Me20 từ cao chiết ethanol của thân cây Trà hòa (Camellia hoaana).
  2. Phân lập các hợp chất hóa học tinh khiết từ phân đoạn Me20 bằng các kỹ thuật sắc ký.
  3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết được phân lập thông qua các phương pháp phổ nghiệm hiện đại.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Bộ phận thân của cây Trà hòa (Camellia hoaana), mẫu thực vật do ThS. Khương Hữu Thắng và cộng sự định danh.
  • Phạm vi không gian: Mẫu nghiên cứu được thu hái tại sinh cảnh tự nhiên thuộc Vườn Quốc gia Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước, Việt Nam. Toàn bộ quá trình thực nghiệm chiết tách, phân lập và xử lý dữ liệu được tiến hành tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được giao thực hiện từ ngày 20/09/2024 đến ngày 30/06/2025, hoàn thiện báo cáo và bảo vệ hội đồng vào tháng 08/2025.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận tiếp cận đối tượng nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên (phytochemistry), tập trung vào các nhóm chuyển hóa thứ cấp đặc trưng của chi Camellia như triterpenoid saponin, flavonoid, anthocyanin, lignan và alkaloid. Hệ thống phân loại chi Camellia được tác giả đối chiếu theo hệ thống của Ming và Bartholomew (2007) trong Flora of China, chia chi này thành 14 phân chi.

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm chiết tách và làm sạch nhiều giai đoạn kết hợp các kỹ thuật phân tích phổ cấu trúc:

  • Phương pháp chiết xuất: Mẫu bột thân cây khô được chiết ngấm kiệt bằng dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ phòng để thu hồi dịch chiết cao tổng, sau đó cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm.
  • Phương pháp sắc ký hấp phụ và phân đoạn:
    • Cao tổng ethanol được phân tách sơ bộ qua sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ nhựa xốp Diaion HP-20, rửa giải phân đoạn bằng hệ dung môi gradient nước - methanol thu được các phân đoạn: Me20 (rửa giải bằng 20% methanol/nước), Me40, Me60, Me80 và acetone.
    • Phân đoạn Me20 tiếp tục được phân tách qua sắc ký cột pha đảo RP-18 (ODS/C18), rửa giải bằng các tỷ lệ dung môi methanol - nước khác nhau, thu được 5 phân đoạn thứ cấp: Me20-Me10, Me20-Me30, Me20-Me50, Me20-Me70 và Me20-MeOH.
  • Phương pháp tinh chế: Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC) và sắc ký cột lặp lại từ phân đoạn Me20-Me10; kiểm tra độ tinh sạch của các chất phân lập bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích (Analytical HPLC) với các đầu dò quang phổ thích hợp.
  • Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc:
    • Phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) để xác định khối lượng phân tử và mảnh ion đặc trưng.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1D và 2D NMR): bao gồm phổ $^1\text{H}$-NMR (đo ở tần số 600 MHz), $^{13}\text{C}$-NMR (tần số 150 MHz), phổ tương quan proton-proton ($^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY), phổ tương quan trực tiếp hạt nhân đơn dị nguyên tử (HSQC) và phổ tương quan dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC). Toàn bộ phổ NMR được đo trong dung môi dimethyl sulfoxide đánh dấu deuterium ($\text{DMSO-}d_6$).
  • Phương pháp xử lý dữ liệu: Xử lý và phân tích tín hiệu phổ NMR trên phần mềm MestReNova; biểu diễn cấu trúc hóa học và sơ đồ phản ứng qua phần mềm ChemDraw; thống kê, quản lý các thông số thực nghiệm bằng Microsoft Excel 2019.

Nội dung chính theo từng chương

Bản khóa luận gồm 90–105 trang, được cấu trúc thành 3 chương nội dung chính cùng hệ thống phụ lục bảng phổ chi tiết.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các tài liệu học thuật về chi Camellia và loài nghiên cứu Camellia hoaana:

  • Phân loại và phân bố: Trình bày hệ thống phân loại 14 phân chi thuộc chi Camellia theo Ming và Bartholomew (2007). Chi Camellia hiện có hơn 325 loài trên thế giới, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Á và Đông Nam Á. Tại Việt Nam, chi này phân bố rộng rãi với khoảng 113 loài (tính đến năm 2024), trong đó miền Bắc (34 loài) và tỉnh Lâm Đồng (26 loài) là hai trung tâm đa dạng lớn nhất. Bảng tổng hợp của chương thống kê 23 loài đặc hữu tiêu biểu tại Việt Nam như C. bugiamapensis, C. capitata, C. cattienensis, C. dalatensis, C. vuquangensis.
  • Đặc điểm loài Camellia hoaana: Mô tả chi tiết hình thái thực vật của loài theo công bố của Yang và cộng sự (2024): cây bụi cao 3–7 m, cành non màu nâu có lông tơ; phiến lá hình elip đến bầu dục elip, dài 9–11 cm, rộng 5–6 cm; hoa mọc đơn hoặc thành chùm ở nách lá/ngọn, đường kính 1,4–1,7 cm, cánh hoa màu trắng; quả nang hình cầu, 3–4 ô, rộng 2,6–3,5 cm, vỏ quả dày 3–4,5 mm khi tươi.
  • Thành phần hóa học chi Camellia: Tổng quan cấu trúc và phân loại các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong chi: saponin triterpenoid loại oleanane (như assamsaponin, floraassamsaponin, foliatheasaponin), anthocyanin (các dẫn xuất glycoside của cyanidin, delphinidin, pelargonidin...), flavonoid (catechin, epicatechin, kaempferol, quercetin), lignan (pinoresinol, secoisolariciresinol) và purine alkaloid (caffeine, theobromine, theophylline).
  • Hoạt tính sinh học: Tổng hợp các dữ liệu dược lý đã được chứng minh của các loài trong chi: khả năng ức chế tế bào ung thư (ung thư phổi, ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư da); hoạt tính chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH (chiết xuất methanol lá trà C. sinensis thể hiện giá trị $\text{IC}{50} = 69{,}51\ \mu\text{g/mL}$ so với acid ascorbic có $\text{IC}{50} = 10{,}70\ \mu\text{g/mL}$); hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, B. cereus...).

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết các bước xử lý mẫu, điều kiện hóa chất, thiết bị và thông số vận hành:

  • Xử lý nguyên liệu: Thân cây Trà hòa khô được nghiền nhỏ, chiết ngấm kiệt nhiều lần với dung môi ethanol 70% nhằm thu hồi cao toàn phần.
  • Quy trình tách phân đoạn:
    • Chạy sắc ký cột Diaion HP-20 để thu phân đoạn Me20.
    • Phân đoạn Me20 được nạp lên cột sắc ký pha đảo RP-18, rửa giải bậc thang bằng dung môi MeOH/$\text{H}_2\text{O}$ tạo ra 5 phân đoạn nhỏ (từ Me20-Me10 đến Me20-MeOH).
  • Quy trình phân lập trên máy HPLC điều chế: Phân đoạn Me20-Me10 được phân tách trên hệ thống Prep-HPLC với chương trình rửa giải pha động kiểm soát chặt chẽ, thu các phân đoạn tinh khiết PD7 và PD8. Các phân đoạn này tiếp tục được phân tích bằng HPLC phân tích để kiểm tra độ đồng nhất và độ tinh sạch của pic sắc ký trước khi đo phổ.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 tập trung phân tích kết quả sắc ký và giải đoán cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ phân đoạn Me20-Me10:

  • Kết quả phân lập sắc ký: Quá trình tinh chế qua HPLC điều chế đối với phân đoạn Me20-Me10 đã tách thành công các hợp chất tinh khiết có độ tinh sạch cao.
  • Giải đoán cấu trúc hợp chất 1 (Ký hiệu: CH1):
    • Được xác định là 4-(1-hydroxy-2'-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-propyl)-2,6-dimethoxyphenol, một dẫn xuất phenol glycoside mới.
    • Dữ liệu phổ $^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR (đo trong $\text{DMSO-}d_6$) kết hợp phổ HMBC cho thấy sự hiện diện của một vòng benzen đối xứng với 2 nhóm methoxy ở vị trí C-2 và C-6, một mạch propyl mang nhóm hydroxy và liên kết glycoside tại vị trí C-2' với một đơn vị đường $\beta$-D-glucopyranose. Hằng số ghép cặp ($J$) của proton anomer khẳng định cấu hình $\beta$ của gốc đường.
  • Giải đoán cấu trúc hợp chất 2 (Ký hiệu: CH2):
    • Được xác định là (E)-3-((9-(4'-hydroxystyroxy)carbonyl)-9-carboxy-ethyl)-3-hydroxy-1-N-$\beta$-D-glucopyranosyl-indolin-2-one, một dẫn xuất oxindole alkaloid gắn gốc đường và mạch styroxy ester chưa từng công bố trước đây.
    • Cấu trúc khung oxindole được đối chiếu tương quan với dữ liệu phổ của hợp chất đối chứng 3-hydroxy-3-methyloxindole. Phổ HMBC xác nhận tương tác liên kết giữa proton anomer của gốc $\beta$-D-glucopyranose trực tiếp với nguyên tử nitơ của vòng indolin-2-one (liên kết $N$-glycoside) và các tương tác ghép cặp của mạch thế dicarboxylic ester gắn nhánh styroxy.
  • Xử lý tạp chất ngoại nhiễm: Trong quá trình thực nghiệm ban đầu, một hợp chất ký hiệu CH4 từng được tách ra và nhận định là bis(2-ethylhexyl) terephthalate (DEHT). Sau khi hội đồng phản biện chỉ ra đây là chất hóa dẻo tổng hợp phổ biến trong bao bì nhựa PVC ngoại nhiễm vào mẫu chiết chứ không phải hợp chất tự nhiên, nhóm tác giả đã xác minh lại và loại bỏ hợp chất này ra khỏi báo cáo thành phần hoạt chất tự nhiên.

Kết quả và đóng góp

Thông số / Hạng mục Dữ liệu ghi nhận trong văn bản
Loài thực vật nghiên cứu Camellia hoaana H. (Trà hòa), họ Chè (Theaceae)
Nguồn mẫu thực vật Thu hái tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước
Dung môi chiết tổng Ethanol 70% (phương pháp chiết ngấm kiệt)
Hệ thống phân đoạn chính Cột Diaion HP-20 $\rightarrow$ Phân đoạn Me20 $\rightarrow$ Cột pha đảo RP-18 $\rightarrow$ Phân đoạn Me20-Me10
Thiết bị và từ trường phổ NMR Máy phổ NMR: $^1\text{H}$-NMR (600 MHz), $^{13}\text{C}$-NMR (150 MHz) đo trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$
Số lượng hợp chất tinh khiết mới phân lập 02 hợp chất mới (tra cứu kiểm tra trên hệ thống SciFinder tháng 06/2025)
Tên khoa học hợp chất 1 (CH1) 4-(1-hydroxy-2'-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-propyl)-2,6-dimethoxyphenol
Tên khoa học hợp chất 2 (CH2) (E)-3-((9-(4'-hydroxystyroxy)carbonyl)-9-carboxy-ethyl)-3-hydroxy-1-N-$\beta$-D-glucopyranosyl-indolin-2-one
Chất ngoại nhiễm đã loại bỏ Bis(2-ethylhexyl) terephthalate (DEHT - chất hóa dẻo từ vật liệu nhựa)
Chỉ số trùng lặp văn bản (Turnitin) 6% toàn bộ nội dung; 2% từ một nguồn cao nhất (tổng số từ kiểm tra: 19.488 từ)

Đóng góp khoa học của đề tài:

  • Khóa luận là công trình nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về thành phần hóa thực vật của loài Camellia hoaana kể từ khi loài này được định danh và công bố khoa học vào năm 2024.
  • Đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên thế giới 2 hợp chất mới chưa từng được phân lập từ thực vật: một dẫn xuất phenol glycoside (CH1) và một dẫn xuất indolin-2-one $N$-glucoside phức tạp (CH2).
  • Thiết lập quy trình sắc ký kết hợp (sắc ký cột Diaion HP-20, RP-18 và HPLC điều chế) hiệu quả để làm giàu và tách các phân đoạn phân cực trung bình - cao từ thân cây Camellia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận:

  • Do giới hạn về thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học và khối lượng mẫu tinh khiết phân lập được còn nhỏ, nghiên cứu chưa tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học (in vitro hoặc in vivo) của 2 hợp chất mới phân lập (như thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa, độc tế bào ung thư hay kháng khuẩn).
  • Nghiên cứu mới chỉ tập trung xử lý một tiểu phân đoạn nhỏ (Me20-Me10) thuộc phân đoạn Me20; các phân đoạn còn lại từ cột Diaion (Me40, Me60, Me80, acetone) và các tiểu phân đoạn khác của cột RP-18 vẫn chưa được khảo sát thành phần hóa học.
  • Quá trình phân tích phổ ban đầu còn xuất hiện một số sai lệch kỹ thuật nhỏ đã được cán bộ phản biện chỉ ra: nhầm lẫn dạng tín hiệu phân tách pic phổ NMR ($J$ coupling) của một số proton (bảng 3.8), sự lệch giá trị dịch chuyển hóa học giữa đoạn biện luận và bảng liệt kê phổ, và sự xuất hiện của chất hóa dẻo ngoại nhiễm DEHT trong mẫu phân đoạn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Tiếp tục mở rộng phân lập các hợp chất tự nhiên từ các phân đoạn dung môi còn lại của cao thân cây Camellia hoaana.
  • Triển khai các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học đối với 2 hợp chất mới (1 và 2), đặc biệt là thử nghiệm hoạt tính dọn gốc tự do, kháng viêm và độc tính tế bào ung thư để định hướng ứng dụng trong dược học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu học thuật có giá trị tham khảo cụ thể cho:

  • Sinh viên và học viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Tham khảo quy trình phân tách sắc ký phân đoạn từ dịch chiết thực vật phân cực bằng nhựa hấp phụ Diaion HP-20 và cột pha đảo RP-18; cách thức vận hành HPLC điều chế để tinh sạch mẫu.
  • Người làm nghiên cứu về phổ nghiệm cấu trúc hữu cơ: Toàn bộ dữ liệu phổ nghiệm 1D ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$) và 2D NMR (COSY, HSQC, HMBC) của hai hợp chất mới được biện luận chi tiết trong văn bản là nguồn dữ liệu chuẩn để tra cứu, đối chiếu khi xác định cấu trúc các khung dẫn xuất phenol glycoside và indole/oxindole glycoside tương tự.
  • Các nhà thực vật học và dược liệu học quan tâm đến chi Camellia: Cung cấp dữ kiện hóa thực vật đầu tiên về loài đặc hữu Camellia hoaana tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập, bổ sung vào cơ sở dữ liệu hóa phân loại học (chemotaxonomy) của họ Theaceae tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao hợp chất bis(2-ethylhexyl) terephthalate (DEHT) ban đầu được nhóm nghiên cứu ghi nhận nhưng sau đó lại bị loại bỏ khỏi kết quả khóa luận?

Trong quá trình chạy sắc ký, nhóm nghiên cứu đã phân lập được một chất ký hiệu là CH4 và ban đầu nhận định đây là chất tự nhiên (do một số tài liệu từng ghi nhận chất này tách từ Capparis spinosa). Tuy nhiên, Tiến sĩ phản biện Trần Thu Phương đã chỉ ra rằng DEHT là chất hóa dẻo công nghiệp tổng hợp, thường có mặt trong các vật liệu nhựa PVC (như ống dẫn, bao bì đựng mẫu hoặc nút đậy). Đây là tạp chất ngoại nhiễm vào dịch chiết trong quá trình thao tác thí nghiệm. Tác giả đã tiếp thu và loại bỏ hoàn toàn hợp chất này khỏi báo cáo kết quả hóa thực vật của cây Trà hòa.

2. Hai hợp chất mới được phân lập từ thân cây Camellia hoaana có tên khoa học và đặc điểm cấu trúc chính là gì?

Hai hợp chất mới bao gồm:

  • Hợp chất 1 (CH1): 4-(1-hydroxy-2'-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-propyl)-2,6-dimethoxyphenol. Cấu trúc gồm một vòng phenol mang hai nhóm thế methoxy ở vị trí C-2 và C-6, nối với một mạch propyl có nhóm hydroxy và một gốc đường $\beta$-D-glucopyranosyl gắn qua liên kết ether tại vị trí C-2'.
  • Hợp chất 2 (CH2): (E)-3-((9-(4'-hydroxystyroxy)carbonyl)-9-carboxy-ethyl)-3-hydroxy-1-N-$\beta$-D-glucopyranosyl-indolin-2-one. Cấu trúc mang khung chính là nhân 3-hydroxyindolin-2-one, trong đó gốc đường $\beta$-D-glucopyranosyl liên kết trực tiếp với nguyên tử nitơ ($N$-glycoside) và vị trí C-3 liên kết với chuỗi carboxylate ester gắn nhóm thế styroxy.

3. Quy trình sắc ký phân tách từ cao chiết tổng đến các hợp chất tinh khiết được tiến hành qua những bước nào?

Bột thân cây khô được chiết ngấm kiệt bằng ethanol 70% thu cao tổng. Cao tổng được đưa qua sắc ký cột Diaion HP-20, rửa giải bằng dung môi MeOH/$\text{H}_2\text{O}$ thu các phân đoạn từ Me20 đến Me80 và acetone. Phân đoạn Me20 được nạp lên sắc ký cột pha đảo RP-18, rửa giải thu 5 tiểu phân đoạn (Me20-Me10 đến Me20-MeOH). Tiểu phân đoạn Me20-Me10 sau đó được phân tách và làm sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC) để thu các hợp chất tinh khiết CH1 và CH2, với độ tinh sạch được kiểm tra lại qua HPLC phân tích.

4. Bằng chứng nào chứng minh tính mới của hai hợp chất CH1 và CH2 trong khóa luận?

Tính mới của hai hợp chất được nhóm tác giả và cán bộ hướng dẫn xác nhận thông qua việc tra cứu cấu trúc hóa học trên cơ sở dữ liệu chuyên ngành quốc tế SciFinder vào tháng 06/2025. Kết quả tra cứu khẳng định cấu trúc của 4-(1-hydroxy-2'-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-propyl)-2,6-dimethoxyphenol và (E)-3-((9-(4'-hydroxystyroxy)carbonyl)-9-carboxy-ethyl)-3-hydroxy-1-N-$\beta$-D-glucopyranosyl-indolin-2-one chưa từng được công bố trong bất kỳ loài thực vật nào trước thời điểm nghiên cứu.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Phú Nghĩa và Nguyễn Thị Tuyết Phương đã thực hiện thành công việc điều chế cao phân đoạn Me20 từ thân cây Trà hòa (Camellia hoaana), một loài thực vật mới được công bố tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập. Bằng quy trình sắc ký kết hợp giữa nhựa hấp phụ Diaion HP-20, pha đảo RP-18 và HPLC điều chế, đề tài đã phân lập và xác định cấu trúc đầy đủ của 2 hợp chất tinh khiết mới là dẫn xuất phenol glycoside và oxindole $N$-glucoside. Công trình cung cấp những dẫn liệu hóa thực vật đầu tiên và chính xác cho loài Camellia hoaana, tạo nền tảng trực tiếp cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo về hoạt tính sinh học và ứng dụng dược lý của loài trà đặc hữu này.