Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
U sắc bào tuyến thượng thận (bao gồm Pheochromocytomas - PCCs và Paragangliomas - PGLs, gọi chung là PPGLs) là nhóm bệnh lý khối u thần kinh nội tiết hiếm gặp tại Việt Nam. Khối u xuất phát từ các tế bào ưa crôm (chromaffin) ở mào thần kinh, có khả năng sản xuất và phóng thích không kiểm soát các catecholamines (CATE) như epinephrine, norepinephrine và dopamine vào hệ tuần hoàn. Tình trạng tăng tiết hormone kéo dài gây ra các cơn tăng huyết áp kịch phát, rối loạn nhịp tim, phù phổi, suy tim và xuất huyết nội sọ. Nếu không được chẩn đoán và phẫu thuật loại bỏ kịp thời, khối u có nguy cơ di căn và dẫn đến tỷ lệ tử vong tim mạch rất cao.
Về mặt di truyền học, các nghiên cứu quốc tế chỉ ra rằng ít nhất 1/3 (trên 30%) các trường hợp PPGLs mang tính chất gia đình và liên quan đến đột biến dòng mầm (germline mutations) ở một trong 14 gen gây bệnh đã biết, bao gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A. Hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng Hoa Kỳ khuyến cáo tất cả bệnh nhân u tủy thượng thận phát hiện trước 20 tuổi, u hai bên, u đa ổ hoặc có tiền sử gia đình cần được chỉ định xét nghiệm di truyền nhằm phát hiện sớm nguyên nhân đột biến và tiến hành tầm soát cho các thành viên trực hệ.
Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng và thực tiễn chẩn đoán phân tử, đồ án tốt nghiệp thực hiện đề tài "Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình" với 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:
- Giải trình tự 6 exon của gen RET (bao gồm các exon 10, 11, 13, 14, 15, 16).
- Phân tích kết quả giải trình tự gen dựa trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI).
Đối tượng nghiên cứu là chùm ca bệnh gồm các thành viên trong một gia đình có tiền sử mắc u tủy thượng thận hai bên. Mẫu nghiên cứu gồm 5 mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA (ký hiệu từ RET1 đến RET5, gồm 2 chị em gái, 2 người con gái của họ và 1 mẫu đối chứng ngoài gia đình). Nghiên cứu được triển khai tại Trung tâm Y sinh học phân tử – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 02/2017 đến tháng 05/2017.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Đồ án dựa trên khung lý thuyết về bệnh sinh u sắc bào thượng thận và cơ chế phân tử của gen RET. Gen RET nằm trên nhiễm sắc thể số 10 (vị trí 10q11.2), có cấu trúc gồm 20 exon, mã hóa thụ thể xuyên màng Tyrosine Kinase tiếp nhận tín hiệu từ các yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc tế bào đệm (GDNF). Sự nối ghép RNA (alternative splicing) tạo ra 3 dạng đồng phân chính của protein RET gồm RET51, RET43 và RET9. Khi xuất hiện các đột biến điểm dòng mầm, thụ thể RET bị hoạt hóa liên tục không phụ thuộc phối tử, kích hoạt quá trình tự phosphoryl hóa chuỗi dư lượng tyrosine nội bào và truyền tín hiệu phân chia tế bào bất thường. Các đột biến tại exon 10 (codon 609, 611, 618, 620) và exon 11 (codon 630, 634) chiếm tới 95% các trường hợp mắc hội chứng đa u tuyến nội tiết loại 2A (MEN2A); trong khi đột biến tại exon 16 (codon M918T) chiếm 95% trường hợp mắc MEN2B.
Nghiên cứu sử dụng thiết kế mô tả hàng loạt ca (case-series descriptive study) kết hợp thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn hóa qua các giai đoạn:
| Giai đoạn thực nghiệm |
Kỹ thuật / Hóa chất sử dụng |
Thiết bị thực hiện |
Mục đích kỹ thuật |
| Tách chiết DNA bộ gen |
QIAGEN DNA Mini Kit (Proteinase K, Buffer AL, AW1, AW2, AE) |
Máy ly tâm eppendorf 5415 R |
Phá vỡ màng tế bào, ly trích và tinh sạch gDNA từ 200 µl máu toàn phần |
| Đo quang phổ kiểm tra DNA |
Đo mật độ quang tại bước sóng 260 nm và 280 nm |
Máy quang phổ NanoDrop 2000c |
Xác định nồng độ DNA (ng/µl) và độ tinh sạch qua tỷ số OD 260/280 nm (chuẩn 1,7 - 2,0) |
| Khuếch đại PCR 6 exon |
Enzyme Takara Taq Hot Start Polymerase, dNTPs 2,5 mM, đệm 10X, 5 cặp mồi đặc hiệu |
Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 |
Nhân bản chọn lọc các đoạn exon 10, 11, 13, 14-15, 16 của gen RET |
| Điện di kiểm tra sản phẩm PCR |
Gel agarose 2%, đệm TBE 0,5X, chất nhuộm Ethidium Bromide, thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus |
Máy điện di Mupid-EXU, Máy soi gel Printgraph (Atto) |
Phân tách và kiểm tra kích thước phân tử, độ đặc hiệu của các băng sản phẩm PCR |
| Tinh sạch sản phẩm PCR |
Enzyme ExoSap-IT 500 rcn (ủ 37°C trong 15 phút, 80°C trong 15 phút) |
Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 |
Bất hoạt Taq polymerase, thủy phân primer thừa và dNTPs dư |
| Giải trình tự chu kỳ (Cycle Sequencing) |
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (ddNTPs gắn huỳnh quang) |
Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 |
Tổng hợp các đoạn DNA kết thúc chuỗi mang tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu 4 màu |
| Tủa và làm sạch sau cycle |
Dung dịch muối NH4OAc 5M, Ethanol 100%, Ethanol 70%, Hi-Di Formamide |
Máy ly tâm lạnh eppendorf 5415 R |
Loại bỏ thuốc nhuộm BigDye tự do và muối thừa, biến tính mạch đơn chuẩn bị nạp máy |
| Giải trình tự mao quản tự động |
Polymer POP-7, Capillary dài 80 cm, Laser cảm biến quang học |
Máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer |
Ghi nhận biểu đồ sắc phổ tín hiệu huỳnh quang và giải mã trình tự nucleotide |
Dữ liệu trình tự nucleotide thu được từ máy ABI 3500 được xử lý qua phần mềm Genetic Analyzer Collection Software v3 và phân tích so dòng (alignment) bằng phần mềm CLC Main Workbench 5 (CLC Sequence Viewer), đối chiếu trực tiếp với trình tự cDNA chuẩn của gen RET người trên GenBank (mã số truy cập: NG_007489) từ hệ thống cơ sở dữ liệu NCBI.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về bệnh lý u sắc bào tuyến thượng thận, các bất thường di truyền liên quan và nguyên lý các phương pháp giải trình tự DNA. Tác giả tổng hợp đặc điểm dịch tễ học và lâm sàng của u tủy thượng thận, nhấn mạnh "quy luật số 10" (10% ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài tuyến thượng thận, 10% không có chức năng tiết).
Chương này trích dẫn số liệu khảo sát tại Bệnh viện Chợ Rẫy (giai đoạn 2005 - 2010) trên 74 bệnh nhân u sắc bào tủy thượng thận:
- Độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 - 49 tuổi (chiếm tỷ lệ cao nhất 39,2%).
- Vị trí u: 70,3% ở tuyến thượng thận phải, 25,6% ở tuyến trái và 4,1% xuất hiện đồng thời ở cả hai tuyến.
- Kích thước khối u trung bình: 5,86 ± 4,14 cm; nhóm u hai bên có kích thước nhỏ hơn (3,0 ± 0,82 cm) so với u đơn bên (6,02 ± 4,19 cm).
Tác giả phân tích dữ liệu nghiên cứu quốc tế trên 2499 đối tượng PPGLs: tỷ lệ mang tính gia đình chiếm 35,2% (879/2499 ca); trong nhóm 363 ca đột biến đơn lẻ thì đột biến ở hệ gen SDHx chiếm ưu thế (SDHB 37,7%, SDHD 27,5%, SDHC 8,26%, SDHA 0,55%), tiếp đến là gen VHL (17,6%), RET (6,3%) và TMEM127 (1,93%). Về mặt phân tử, chương 1 mô tả chi tiết vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể 10q11.2, cấu trúc protein thụ thể kinase gồm miền ngoại bào giàu cysteine, miền xuyên màng và miền tyrosine kinase nội bào. Đồng thời, tác giả tổng quan các phương pháp giải trình tự từ phương pháp hóa học Maxam-Gilbert (1977), phương pháp enzyme kết thúc chuỗi của Sanger (1977), giải trình tự tự động bằng điện di mao quản phát hiện huỳnh quang, đến kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới 454 Pyrosequencing.
Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp
Chương 2 mô tả chi tiết ca bệnh chỉ điểm (proband), phả hệ gia đình 3 thế hệ, hệ thống trang thiết bị và quy trình thao tác chuẩn (SOP). Ca bệnh là bệnh nhân nữ nhập viện do phát hiện u thượng thận phải, trước đó 2 năm đã phẫu thuật cắt bỏ u thượng thận trái. Tiền sử gia đình có cha lấy 2 người vợ:
- Vợ thứ 1: sinh 8 người con, trong đó 1 con trai đột tử năm 30 tuổi không rõ nguyên nhân, 1 con trai đã mổ u thượng thận 2 bên, 1 con gái mổ u thượng thận trái và tử vong do đột quỵ.
- Vợ thứ 2: sinh 2 con gái gồm bệnh nhân và chị gái (người chị gái cũng đã mổ u thượng thận hai bên và bị đột quỵ sau phẫu thuật).
Kết quả cận lâm sàng của bệnh nhân: Catecholamines niệu 24 giờ cho thấy nồng độ Noradrenalin tăng cao đạt 199 µg (bình thường <90 µg), Metanephrine máu đạt 758 pg/ml (bình thường <90 pg/ml), Adrenalin 7,6 µg (bình thường <20 µg), Dopamin 278,3 µg (bình thường <600 µg), Calcitonin máu bình thường (4,25 pg/ml), CT scan ghi nhận khối u thượng thận phải kích thước 5x5 cm. Kết quả giải phẫu bệnh sau mổ xác định là Pheochromocytomas.
Tác giả cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết của 5 cặp mồi khuếch đại gen RET:
| Tên mồi |
Chiều mồi |
Trình tự nucleotide (5' - 3') |
Kích thước sản phẩm (bp) |
Nhiệt độ bắt cặp Tm (°C) |
| RET - 10 |
Xuôi (F)
Ngược (R) |
TATGCTTGCGACACCAGTTG
TTCTGGCCTGTCCATCATAG |
452 bp |
56 °C |
| RET - 11 |
Xuôi (F)
Ngược (R) |
TGAGCCTCTGTCTCCATCTG
CCGTTCCCATCTAGGTGAGA |
699 bp |
56 °C |
| RET - 13 |
Xuôi (F)
Ngược (R) |
GGCCTCTCTGTCTGAACTTG
GATGGAAAGTGACCACTCAG |
420 bp |
56 °C |
| RET - 14/15 |
Xuôi (F)
Ngược (R) |
GAGAAAGCTGAGGCTTCAAG
CTTTCCTAGGCTTCCCAAGG |
948 bp |
56 °C |
| RET - 16 |
Xuôi (F)
Ngược (R) |
GATGTGTGTGGCCAGTTCTG
AGTGCAATTCCCTGGCCAAG |
324 bp |
56 °C |
Chu trình luân nhiệt PCR thực hiện trên máy Mastercycler Pro AG 6325 gồm: Biến tính ban đầu 98°C trong 3 phút; 35 chu kỳ luân nhiệt (98°C trong 10 giây, gắn mồi 56°C trong 20 giây, kéo dài 72°C trong 40 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 2 phút và giữ ở 4°C.
Chương 3: Kết quả – Bàn luận
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được từ mẫu máu ngoại vi của 5 đối tượng nghiên cứu:
Kết quả tách chiết và đo quang phổ NanoDrop 2000c:
Quá trình ly trích DNA bằng bộ kit QIAGEN thu được sản phẩm DNA bộ gen đạt độ tinh sạch cao, không bị tạp nhiễm protein hay dung môi hữu cơ:
| Ký hiệu mẫu |
Giá trị độ hấp thụ OD (260nm / 280nm) |
Nồng độ DNA thu nhận (ng/µl) |
| RET1 |
1,94 |
40,8 |
| RET2 |
1,98 |
14,7 |
| RET3 |
1,92 |
21,0 |
| RET4 |
1,88 |
24,7 |
| RET5 |
1,98 |
19,8 |
Tất cả các mẫu đều có tỷ số OD 260/280 nằm trong ngưỡng chuẩn 1,7 - 2,0, nồng độ dao động từ 14,7 ng/µl đến 40,8 ng/µl, đáp ứng yêu cầu cho phản ứng PCR.
Kết quả PCR và điện di kiểm tra sản phẩm:
Điện di trên gel agarose 2% cho thấy 5 cặp mồi khuếch đại thành công 6 exon của gen RET. Tất cả các giếng nạp sản phẩm đều xuất hiện một băng DNA sáng rõ, kích thước vạch hoàn toàn trùng khớp với kích thước lý thuyết:
- Exon 10: vạch nằm giữa 400 bp và 500 bp (chuẩn 452 bp).
- Exon 11: vạch nằm sát vạch 700 bp (chuẩn 699 bp).
- Exon 13: vạch nằm giữa 400 bp và 450 bp (chuẩn 420 bp).
- Exon 14 - 15: vạch nằm giữa 900 bp và 1000 bp (chuẩn 948 bp).
- Exon 16: vạch nằm giữa 300 bp và 400 bp (chuẩn 324 bp).
- Các giếng chứng âm (chứa nước cất thay thế khuôn DNA) hoàn toàn không xuất hiện băng vạch, xác nhận hệ thống phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm.
Tác giả thảo luận về tính ưu việt của enzyme Takara Taq Hot Start Polymerase nhờ hoạt tính 5' - 3' exonuclease và 5' - 3' polymerase giúp hạn chế hiện tượng bắt cặp mồi không đặc hiệu ở nhiệt độ phòng, tạo sản phẩm khuếch đại đồng nhất phục vụ cho giải trình tự.
Kết quả tinh sạch, phản ứng cycle sequencing và giải trình tự:
Sau khi tinh sạch bằng ExoSap-IT nhằm loại bỏ dNTPs và mồi dư thừa, phản ứng cycle sequencing được tiến hành với BigDye Terminator theo cả hai chiều mồi xuôi và mồi ngược. Quy trình tủa bằng NH4OAc 5M và Ethanol 100%, rửa bằng Ethanol 70% và biến tính trong Hi-Di Formamide ở 96°C trong 2 phút giúp đưa DNA về dạng mạch đơn cố định trước khi đưa vào mao quản máy ABI 3500. Kết quả phân tích điện sắc đồ (electropherogram) bằng phần mềm CLC Main Workbench 5 so với trình tự chuẩn NG_007489 đã phát hiện các điểm đa hình nucleotide đơn (SNP) tại exon 11 và exon 13, đồng thời xác định đột biến c.Cys634Arg tại exon 11 trên bệnh nhân u sắc bào thượng thận mang tính gia đình.
Chương 4: Kết luận – Kiến nghị
Tác giả tổng kết các kết quả đạt được về quy trình kỹ thuật khuếch đại, tinh sạch và giải trình tự 6 exon gen RET trên hệ máy ABI 3500. Đồng thời, tác giả đưa ra các kiến nghị:
- Tiếp tục mở rộng xét nghiệm sàng lọc di truyền gen RET cho toàn bộ các thành viên trực hệ còn lại trong phả hệ gia đình bệnh nhân.
- Kết hợp tầm soát thêm các gen gây bệnh PPGLs phổ biến khác (VHL, SDHB, SDHD) đối với các trường hợp có biểu hiện lâm sàng tăng tiết catecholamines nhưng không mang đột biến gen RET.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu đạt được các kết quả cụ thể có số liệu trong văn bản:
- Chuẩn hóa thành công quy trình tách chiết DNA bộ gen từ 5 mẫu máu ngoại vi bằng kit QIAGEN, đạt nồng độ từ 14,7 ng/µl đến 40,8 ng/µl với độ tinh sạch OD 260/280 nm đạt từ 1,88 đến 1,98.
- Thiết lập điều kiện luân nhiệt PCR tối ưu cho 5 cặp mồi đặc hiệu, khuếch đại chính xác 6 exon của gen RET với kích thước băng điện di đặc hiệu: exon 10 (452 bp), exon 11 (699 bp), exon 13 (420 bp), exon 14-15 (948 bp) và exon 16 (324 bp).
- Thực hiện thành công quy trình tinh sạch ExoSap-IT, phản ứng giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator và đọc trình tự chuỗi trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer.
- Phát hiện các điểm biến đổi trình tự SNP tại exon 11, exon 13 và xác định đột biến c.Cys634Arg ở exon 11 của gen RET trên ca lâm sàng u tủy thượng thận hai bên có tính chất gia đình.
Đóng góp của đề tài:
- Về mặt lâm sàng và di truyền học: Khóa luận cung cấp bằng chứng di truyền phân tử trực tiếp giải thích căn nguyên gây bệnh u sắc bào thượng thận đa ổ mang tính gia đình trên ca lâm sàng cụ thể tại Việt Nam, minh chứng rằng bệnh nhân mang đột biến c.Cys634Arg của hội chứng MEN2A dù chưa có biểu hiện lâm sàng ung thư giáp dạng tủy tại thời điểm khảo sát.
- Về mặt kỹ thuật: Xây dựng và hoàn thiện quy trình thực nghiệm đồng bộ từ khâu xử lý mẫu máu, khuếch đại PCR, tinh sạch enzyme đến giải trình tự Sanger tự động, làm tài liệu tham khảo quy chuẩn cho các xét nghiệm di truyền gen RET.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Dựa trên phạm vi và nội dung trình bày trong văn bản, nghiên cứu có các hạn chế:
- Phạm vi khảo sát giới hạn trên 6 exon trọng điểm (exon 10, 11, 13, 14, 15, 16) thay vì toàn bộ 20 exon của gen RET.
- Dung lượng mẫu nghiên cứu tập trung trên 1 chùm ca bệnh gia đình (5 mẫu máu ngoại vi), chưa mở rộng trên quy mô đoàn hệ lớn bệnh nhân PPGLs.
Hướng nghiên cứu tiếp được tác giả đề xuất:
- Tiến hành thu thập mẫu và làm xét nghiệm tầm soát di truyền cho các thành viên trực hệ còn lại trong phả hệ của gia đình bệnh nhân.
- Mở rộng phạm vi phân tích sang các gen ức chế khối u và sinh ung thư khác liên quan đến u tủy thượng thận như VHL, NF1, SDHB, SDHD, SDHC.
Giá trị tham khảo
Đồ án là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Y sinh học phân tử, Di truyền học và các bác sĩ chuyên khoa Nội tiết, Ung bướu.
Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:
- Bảng trình tự các cặp mồi đặc hiệu và thông số chu trình nhiệt PCR khuếch đại 6 exon gen RET (exon 10, 11, 13, 14-15, 16).
- Quy trình xử lý mẫu sau PCR bằng enzyme ExoSap-IT và kỹ thuật tủa BigDye bằng muối NH4OAc/Ethanol phục vụ giải trình tự mao quản trên máy ABI 3500.
- Phương pháp phân tích, gióng hàng và đọc điện sắc đồ phát hiện đột biến điểm/SNP bằng phần mềm chuyên dụng CLC Main Workbench đối chiếu với mã số GenBank
NG_007489.
Câu hỏi thường gặp
1. Tiền sử gia đình của ca bệnh chỉ điểm trong nghiên cứu có những yếu tố bất thường nào?
Ca bệnh là bệnh nhân nữ mắc u tủy thượng thận hai bên. Phả hệ 3 thế hệ cho thấy cha bệnh nhân có hai người vợ: người vợ đầu sinh 8 người con (1 con trai đột tử năm 30 tuổi, 1 con trai mổ u thượng thận 2 bên, 1 con gái mổ u thượng thận trái tử vong do đột quỵ); người vợ thứ hai sinh 2 con gái gồm bệnh nhân và chị gái (người chị gái cũng đã mổ u thượng thận 2 bên và bị đột quỵ sau phẫu thuật). Đây là tiền sử gia đình điển hình của u sắc bào tuyến thượng thận di truyền trội.
2. Tại sao nghiên cứu lựa chọn khảo sát 6 exon cụ thể (10, 11, 13, 14, 15, 16) trong tổng số 20 exon của gen RET?
Theo các y văn được tác giả trích dẫn, khoảng 95% đột biến liên quan đến hội chứng MEN2A tập trung tại exon 10 (các codon 609, 611, 618, 620) và exon 11 (codon 630, 634); 95% đột biến gây hội chứng MEN2B nằm tại exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F). Do đó, việc tập trung vào 6 exon (10, 11, 13, 14, 15, 16) giúp tối ưu hóa chi phí và thời gian xét nghiệm nhưng vẫn bao phủ được các điểm nóng đột biến phổ biến nhất của gen RET.
3. Kích thước các đoạn khuếch đại PCR của 6 exon gen RET được xác định là bao nhiêu?
Theo thiết kế mồi của nghiên cứu, kích thước lý thuyết và thực tế điện di của các đoạn khuếch đại lần lượt là: exon 10 đạt 452 bp; exon 11 đạt 699 bp; exon 13 đạt 420 bp; đoạn chứa exon 14 và 15 đạt 948 bp; exon 16 đạt 324 bp.
4. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết từ 5 mẫu máu đạt tiêu chuẩn như thế nào?
Cả 5 mẫu máu (RET1 đến RET5) sau khi tách chiết bằng kit QIAGEN đều đạt độ tinh sạch theo tỷ số OD 260/280 nm trong khoảng 1,88 - 1,98 (nằm trong giới hạn chuẩn 1,7 - 2,0, không bị tạp nhiễm protein). Nồng độ DNA thu được dao động từ 14,7 ng/µl (mẫu RET2) đến 40,8 ng/µl (mẫu RET1).
5. Vai trò của việc xử lý ExoSap-IT và tủa BigDye trước khi đưa mẫu vào máy ABI 3500 là gì?
Xử lý bằng enzyme ExoSap-IT ở hai mức nhiệt độ (37°C trong 15 phút để tiêu hóa primer dư và dephosphorylate dNTPs thừa; 80°C trong 15 phút để bất hoạt enzyme) giúp làm sạch sản phẩm PCR. Sau phản ứng cycle sequencing, bước tủa bằng NH4OAc và Ethanol giúp loại bỏ hoàn toàn các phân tử ddNTP gắn huỳnh quang tự do dư thừa, ngăn ngừa hiện tượng nhiễu tín hiệu nền (dye blobs) khi đọc trên máy ABI 3500.
Kết luận
Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Hiền đã chuẩn hóa và thực hiện thành công quy trình sinh học phân tử từ tách chiết DNA, khuếch đại PCR đến giải trình tự Sanger tự động 6 exon của gen RET trên hệ máy ABI 3500. Nghiên cứu đã xác định được bất thường di truyền c.Cys634Arg tại exon 11 trên bệnh nhân u sắc bào tuyến thượng thận hai bên có tiền sử gia đình phức tạp, cung cấp cơ sở khoa học chính xác hỗ trợ chẩn đoán hội chứng đa u tuyến nội tiết MEN2A. Kết quả của đồ án đóng góp quy trình thực nghiệm hoàn chỉnh và dữ liệu di truyền giá trị cho công tác chẩn đoán phân tử bệnh lý u nội tiết mang tính gia đình tại Việt Nam.
