Đồ án tốt nghiệp khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

Bài viết khảo sát đột biến gen RET trong u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình, cung cấp thông tin chi tiết về nghiên cứu lâm sàng và ứng dụng thực tiễn.

Chuyên ngành

Công nghệ Sinh học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

đồ án tốt nghiệp

2017

62
5
0

Phí lưu trữ

30 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. U sắc bào tuyến thượng thận

1.2. Xét nghiệm chẩn đoán

1.3. Bất thường di truyền

1.4. Các bệnh và hội chứng liên quan

1.4.1. Hội chứng NF1

1.4.2. Hội chứng VHL

1.4.3. Hội chứng MEN

1.5. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET

1.6. Các phương pháp giải trình tự

1.6.1. Phương pháp hóa học

1.6.2. Phương pháp enzyme

1.6.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)

1.6.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing

1.7. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide

1.7.1. Cơ sở dữ liệu

1.7.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide

2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1. Thiết kế nghiên cứu

2.2. Đối tượng nghiên cứu

2.3. Dụng cụ và thiết bị

2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện

2.5. Thuyết minh quy trình

2.5.1. Quy trình tách chiết DNA

2.5.2. Các bước thực hiện

2.5.3. Quy trình PCR gen RET

2.5.4. Các bước thực hiện

2.5.5. Điện di sản phẩm PCR

2.5.6. Các bước thực hiện

2.5.7. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR

2.5.8. Các bước thực hiện

2.5.9. Quy trình cycle sequencing

2.5.10. Các bước thực hiện

2.5.11. Quy trình tủa sản phẩm cycle

2.5.12. Các bước thực hiện

2.5.13. Giải trình tự bằng máy ABI 3500

2.5.14. Đọc trình tự chuỗi DNA

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết

3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu

3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR

3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự

4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

4.1. Kiến nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đột biến gen RET và u sắc bào tuyến thượng thận gia đình

Đột biến gen RET là một trong những nguyên nhân chính gây ra u sắc bào tuyến thượng thận gia đình. Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các đột biến gen RET trong các trường hợp lâm sàng liên quan đến bệnh di truyền. U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh lý hiếm gặp, thường liên quan đến các khối u tiết catecholamines, gây ra các triệu chứng như tăng huyết áp, đánh trống ngực và nhức đầu. Việc xác định đột biến di truyền trong gen RET giúp chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả, đặc biệt trong các trường hợp có tính chất gia đình.

1.1. Vai trò của gen RET trong bệnh lý tuyến thượng thận

Gen RET đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và chức năng của tuyến thượng thận. Các đột biến gây bệnh trong gen này có thể dẫn đến sự hình thành các khối u, đặc biệt là ung thư tuyến thượng thận. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định các đột biến tại các exon 10, 11, 13, 14, 15 và 16 của gen RET. Kết quả cho thấy, các đột biến này có liên quan mật thiết đến bệnh gia đình, đặc biệt là trong các hội chứng như MEN2A và MEN2B.

1.2. Phương pháp khảo sát gen RET

Phương pháp khảo sát gen được áp dụng trong nghiên cứu bao gồm tách chiết DNA, PCR và giải trình tự bằng máy ABI 3500. Các kỹ thuật này cho phép xác định chính xác các đột biến di truyền trong gen RET. Kết quả giải trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định các đột biến có ý nghĩa lâm sàng. Phương pháp này không chỉ hỗ trợ chẩn đoán gen mà còn giúp tư vấn di truyền cho các thành viên trong gia đình có nguy cơ mắc bệnh.

II. Bệnh lý tuyến thượng thận và các hội chứng liên quan

Bệnh lý tuyến thượng thận bao gồm các khối u lành tính và ác tính, trong đó u sắc bào tuyến thượng thận là một trong những bệnh lý phức tạp nhất. Các khối u này có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc có tính chất gia đình, liên quan đến các đột biến di truyền trong gen RET, VHL và NF1. Nghiên cứu này cũng đề cập đến các hội chứng như hội chứng MEN, hội chứng VHLhội chứng NF1, những hội chứng này thường đi kèm với u sắc bào tuyến thượng thận và có liên quan đến các đột biến gen cụ thể.

2.1. Hội chứng MEN và đột biến gen RET

Hội chứng MEN (Multiple Endocrine Neoplasia) là một nhóm các rối loạn di truyền liên quan đến sự phát triển của các khối u trong hệ thống nội tiết. Trong đó, hội chứng MEN2A và MEN2B có liên quan mật thiết đến đột biến gen RET. Các đột biến tại các codon 609, 611, 618, 620, 630 và 634 của gen RET làm tăng nguy cơ mắc u sắc bào tuyến thượng thậnung thư tuyến giáp dạng tủy. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sàng lọc gen RET trong các gia đình có tiền sử mắc hội chứng MEN.

2.2. Hội chứng VHL và NF1

Hội chứng VHLhội chứng NF1 là hai hội chứng di truyền khác có liên quan đến u sắc bào tuyến thượng thận. Hội chứng VHL thường liên quan đến các đột biến gen VHL, trong khi hội chứng NF1 liên quan đến đột biến gen NF1. Cả hai hội chứng này đều có thể dẫn đến sự hình thành các khối u trong tuyến thượng thận và các cơ quan khác. Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn tổng quan về các đột biến gen liên quan và phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

III. Ứng dụng thực tiễn và kết luận

Nghiên cứu về đột biến gen RET trong u sắc bào tuyến thượng thận gia đình có ý nghĩa quan trọng trong y học di truyền. Việc xác định các đột biến gen giúp chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời và tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ mắc bệnh. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới, nhắm vào các đột biến gen cụ thể, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

3.1. Giá trị của nghiên cứu trong chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu này cung cấp các dữ liệu quan trọng về đột biến gen RET và mối liên hệ của chúng với u sắc bào tuyến thượng thận. Các phương pháp khảo sát gen và giải trình tự được sử dụng trong nghiên cứu có thể áp dụng rộng rãi trong lâm sàng để chẩn đoán và điều trị các bệnh lý di truyền. Đặc biệt, việc xác định các đột biến gen giúp tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ cao, từ đó giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh trong tương lai.

3.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu về đột biến gen RET cần được mở rộng để bao phủ các gen khác liên quan đến bệnh lý tuyến thượng thận. Việc kết hợp các phương pháp giải trình tự thế hệ mới và phân tích dữ liệu lớn sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh và phát triển các liệu pháp điều trị cá nhân hóa. Ngoài ra, các nghiên cứu về bệnh gia đình cần được thúc đẩy để cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

12/02/2025

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đồ án tốt nghiệp 1. U sắc bào tuyến thượng thận 1. Giới thiệu Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine. Khoảng 80-85% các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9].

Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm. Neuroblastoma (u nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất phát sinh từ tủy thượng thận. Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17]. U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận.

Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết. Ung thư thượng thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1]. Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng hormones. Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú nói chung dao động từ 0,2 - 0,6%.

Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của PPGLs là khoảng 1,7%. Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu. Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]. PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE.

Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh. Ngoài ra, PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin, 2 Đồ án tốt nghiệp calcitonin, oxytocin và vasopressin. Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11]. PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine neoplasma- MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội chứng Von Hippel-Lindau (VHL).

Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn lại là lành tính [21]. Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa CATE trong nước tiểu. Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định. Nguyên nhân U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường.

Những bất thường di truyền phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1. Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2 bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u tủy thượng thận hay u cận hạch [22]. Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim. Trong tế bào ưa crôm, norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và metanephrine.

Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao 3 Đồ án tốt nghiệp hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]. Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng rượu bia trong thời gian dài,… cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận. Biểu hiện - Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu 94%). - Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ.

Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp. Tăng tiết CATE làm cho bệnh nhân loạn nhịp tim. Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]. Xét nghiệm chẩn đoán Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo: - Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện hóa.

Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]. - Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F- fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]. - Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả [9]. Điều trị - Cắt bỏ hoàn toàn khối u.

- Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ khối u. Bất thường di truyền Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9] Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1, MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney (u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney- Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]. Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL. Phát hiện đột biến gen NF1 rất phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12].

Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều có đặc điểm tương đồng [4, 6]. Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc 5 Đồ án tốt nghiệp điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL. Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình. *Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ [16] Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611, 618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11.

Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc trưng của RET. Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo độ tuổi. Song, bệnh nhân mắc bệnh PCCs lại chiểm tỷ lệ thấp hơn khi bị đột biến exon 10. Tỷ lệ như sau: · Codon 609 – 4 → 26%.

Nhóm bệnh MEN2B Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình. Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F). Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30. Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm 6 Đồ án tốt nghiệp lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhận thấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%).

Đặc điểm thường gặp ở các khối u được thống kê như sau: · U có ở 2 tuyến: 4,1% · U ở 1 tuyến phải: 70,3% · U ở 1 tuyến trái: 25,6% Kích thước trung bình của khối u: 5,86 ± 4,14 cm · Kích thước thường gặp: 3 → 5 cm (37,3%) · U bên trái: 7,79 → 5,11 cm · U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm · U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02 ± 4,19 cm) Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy: - Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có 1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình [5].

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Bài viết "Khảo sát đột biến gen RET trong u sắc bào tuyến thượng thận gia đình" tập trung vào việc nghiên cứu các đột biến gen RET, một yếu tố quan trọng liên quan đến bệnh u sắc bào tuyến thượng thận gia đình. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế di truyền của bệnh mà còn mở ra hướng tiếp cận mới trong chẩn đoán và điều trị. Đối với độc giả, bài viết mang lại giá trị thực tiễn cao, giúp hiểu rõ hơn về vai trò của gen RET trong bệnh lý này và cách ứng dụng kiến thức này vào y học lâm sàng.

Để mở rộng kiến thức về các nghiên cứu liên quan đến di truyền và bệnh lý, bạn có thể tham khảo bài viết Khóa luận tốt nghiệp khảo sát nồng độ thyroglobulin anti thyroglobulin ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa sau phẫu thuật trước điều trị i131 tại bệnh viện bạch mai năm 2022, nghiên cứu về các chỉ số sinh học trong ung thư tuyến giáp. Ngoài ra, bài viết Luận án tiến sĩ nghiên cứu chỉ số tim cổ chân nồng độ homocystein huyết tương ở bệnh nhân đái tháo đường típ 2 có loét bàn chân cung cấp thêm góc nhìn về các chỉ số sinh học trong bệnh lý mãn tính. Cuối cùng, bài viết Luận án tiến sĩ nghiên cứu giải phẫu động mạch vành trên hình ảnh cắt lớp vi tính 64 lớp so với hình ảnh chụp mạch qua da sẽ giúp bạn hiểu rõ hơn về ứng dụng công nghệ trong chẩn đoán y khoa. Mỗi bài viết là một cơ hội để khám phá sâu hơn các chủ đề liên quan, từ đó mở rộng kiến thức và góc nhìn của bạn.