Đồ án tốt nghiệp khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

Bài viết khảo sát đột biến gen RET trong u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình, cung cấp thông tin chi tiết về nghiên cứu lâm sàng và ứng dụng thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mỹ Hiền
• Người hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh
• Trường học: Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình
• Loại tài liệu: đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. U sắc bào tuyến thượng thận
• 1.2. Xét nghiệm chẩn đoán
• 1.3. Bất thường di truyền
• 1.4. Các bệnh và hội chứng liên quan
• 1.4.1. Hội chứng NF1
• 1.4.2. Hội chứng VHL
• 1.4.3. Hội chứng MEN
• 1.5. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET
• 1.6. Các phương pháp giải trình tự
• 1.6.1. Phương pháp hóa học
• 1.6.2. Phương pháp enzyme
• 1.6.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)
• 1.6.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing
• 1.7. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide
• 1.7.1. Cơ sở dữ liệu
• 1.7.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện
• 2.5. Thuyết minh quy trình
• 2.5.1. Quy trình tách chiết DNA
• 2.5.2. Các bước thực hiện
• 2.5.3. Quy trình PCR gen RET
• 2.5.4. Các bước thực hiện
• 2.5.5. Điện di sản phẩm PCR
• 2.5.6. Các bước thực hiện
• 2.5.7. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.5.8. Các bước thực hiện
• 2.5.9. Quy trình cycle sequencing
• 2.5.10. Các bước thực hiện
• 2.5.11. Quy trình tủa sản phẩm cycle
• 2.5.12. Các bước thực hiện
• 2.5.13. Giải trình tự bằng máy ABI 3500
• 2.5.14. Đọc trình tự chuỗi DNA
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết
• 3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu
• 3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• 4.1. Kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đột biến gen RET và u sắc bào tuyến thượng thận gia đình

Đột biến gen RET là một trong những nguyên nhân chính gây ra u sắc bào tuyến thượng thận gia đình. Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các đột biến gen RET trong các trường hợp lâm sàng liên quan đến bệnh di truyền. U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh lý hiếm gặp, thường liên quan đến các khối u tiết catecholamines, gây ra các triệu chứng như tăng huyết áp, đánh trống ngực và nhức đầu. Việc xác định đột biến di truyền trong gen RET giúp chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả, đặc biệt trong các trường hợp có tính chất gia đình.

1.1. Vai trò của gen RET trong bệnh lý tuyến thượng thận

Gen RET đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và chức năng của tuyến thượng thận. Các đột biến gây bệnh trong gen này có thể dẫn đến sự hình thành các khối u, đặc biệt là ung thư tuyến thượng thận. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định các đột biến tại các exon 10, 11, 13, 14, 15 và 16 của gen RET. Kết quả cho thấy, các đột biến này có liên quan mật thiết đến bệnh gia đình, đặc biệt là trong các hội chứng như MEN2A và MEN2B.

1.2. Phương pháp khảo sát gen RET

Phương pháp khảo sát gen được áp dụng trong nghiên cứu bao gồm tách chiết DNA, PCR và giải trình tự bằng máy ABI 3500. Các kỹ thuật này cho phép xác định chính xác các đột biến di truyền trong gen RET. Kết quả giải trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định các đột biến có ý nghĩa lâm sàng. Phương pháp này không chỉ hỗ trợ chẩn đoán gen mà còn giúp tư vấn di truyền cho các thành viên trong gia đình có nguy cơ mắc bệnh.

II. Bệnh lý tuyến thượng thận và các hội chứng liên quan

Bệnh lý tuyến thượng thận bao gồm các khối u lành tính và ác tính, trong đó u sắc bào tuyến thượng thận là một trong những bệnh lý phức tạp nhất. Các khối u này có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc có tính chất gia đình, liên quan đến các đột biến di truyền trong gen RET, VHL và NF1. Nghiên cứu này cũng đề cập đến các hội chứng như hội chứng MEN, hội chứng VHL và hội chứng NF1, những hội chứng này thường đi kèm với u sắc bào tuyến thượng thận và có liên quan đến các đột biến gen cụ thể.

2.1. Hội chứng MEN và đột biến gen RET

Hội chứng MEN (Multiple Endocrine Neoplasia) là một nhóm các rối loạn di truyền liên quan đến sự phát triển của các khối u trong hệ thống nội tiết. Trong đó, hội chứng MEN2A và MEN2B có liên quan mật thiết đến đột biến gen RET. Các đột biến tại các codon 609, 611, 618, 620, 630 và 634 của gen RET làm tăng nguy cơ mắc u sắc bào tuyến thượng thận và ung thư tuyến giáp dạng tủy. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sàng lọc gen RET trong các gia đình có tiền sử mắc hội chứng MEN.

2.2. Hội chứng VHL và NF1

Hội chứng VHL và hội chứng NF1 là hai hội chứng di truyền khác có liên quan đến u sắc bào tuyến thượng thận. Hội chứng VHL thường liên quan đến các đột biến gen VHL, trong khi hội chứng NF1 liên quan đến đột biến gen NF1. Cả hai hội chứng này đều có thể dẫn đến sự hình thành các khối u trong tuyến thượng thận và các cơ quan khác. Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn tổng quan về các đột biến gen liên quan và phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

III. Ứng dụng thực tiễn và kết luận

Nghiên cứu về đột biến gen RET trong u sắc bào tuyến thượng thận gia đình có ý nghĩa quan trọng trong y học di truyền. Việc xác định các đột biến gen giúp chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời và tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ mắc bệnh. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới, nhắm vào các đột biến gen cụ thể, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

3.1. Giá trị của nghiên cứu trong chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu này cung cấp các dữ liệu quan trọng về đột biến gen RET và mối liên hệ của chúng với u sắc bào tuyến thượng thận. Các phương pháp khảo sát gen và giải trình tự được sử dụng trong nghiên cứu có thể áp dụng rộng rãi trong lâm sàng để chẩn đoán và điều trị các bệnh lý di truyền. Đặc biệt, việc xác định các đột biến gen giúp tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ cao, từ đó giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh trong tương lai.

3.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu về đột biến gen RET cần được mở rộng để bao phủ các gen khác liên quan đến bệnh lý tuyến thượng thận. Việc kết hợp các phương pháp giải trình tự thế hệ mới và phân tích dữ liệu lớn sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh và phát triển các liệu pháp điều trị cá nhân hóa. Ngoài ra, các nghiên cứu về bệnh gia đình cần được thúc đẩy để cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

U sắc bào tuyến thượng thận và u cận hạch (Pheochromocytomas and Paragangliomas - PPGLs) là nhóm bệnh lý khối u thần kinh nội tiết hiếm gặp nhưng có mức độ đe dọa tử vong tim mạch nghiêm trọng. Các thống kê y khoa lâm sàng chỉ ra rằng tỷ lệ hiện mắc PPGLs dao động từ 0,2% đến 0,6% ở nhóm bệnh nhân ngoại trú bị tăng huyết áp và lên đến 1,7% ở trẻ em có hội chứng cao huyết áp. Khoảng 80–85% khối u xuất phát từ tủy tuyến thượng thận (PCCs) và 15–20% ngoài tuyến thượng thận (PGLs). Đáng chú ý, PPGLs tuân theo "quy luật số 10": 10% ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không có chức năng tiết nội tiết.

Vấn đề cốt lõi (Problem Statement) nằm ở chỗ: có tới ít nhất 30–35% bệnh nhân PPGLs mang đột biến dòng mầm (germline mutations) di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường thuộc 1 trong 14 gen sinh ung hoặc ức chế khối u (RET, VHL, NF1, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SDHAF2, TMEM127, MAX, HIF2A, EGLN1, KIF1B, IDH1). Các ca bệnh mang tính gia đình thường biểu hiện đa ổ, xuất hiện ở cả hai bên tuyến thượng thận với tính chất xâm lấn phức tạp. Nếu chỉ chẩn đoán đơn thuần qua triệu chứng sinh hóa hoặc hình ảnh học mà bỏ qua xét nghiệm di truyền phân tử, người bệnh và các thân nhân trực hệ đối mặt với nguy cơ đột tử do cơn tăng huyết áp kịch phát, đột quỵ, hoặc ung thư di căn không được kiểm soát.

Đề tài được xác lập với 3 mục tiêu cụ thể:

1. Thiết lập và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật khuếch đại (PCR) và giải trình tự trực tiếp (Direct Sanger Sequencing) 6 exon điểm nóng (Exon 10, 11, 13, 14, 15, 16) của proto-oncogene RET trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer.
2. Ứng dụng quy trình trên mẫu DNA máu ngoại vi của ca bệnh u sắc bào tuyến thượng thận hai bên có tiền sử gia đình phức tạp (chị em ruột và các con gái trực hệ) nhằm xác định chính xác biến dị di truyền.
3. Đối chiếu dữ liệu chuỗi nucleotide thu được với ngân hàng gen quốc tế NCBI GenBank (mã số tham chiếu: NG_007489) để xác định kiểu biến dị (SNP hay đột biến gây bệnh), làm cơ sở tư vấn di truyền và tầm soát sớm hội chứng đa u nội tiết loại 2 (MEN2).

Phương pháp tiếp cận giải pháp sử dụng kỹ thuật giải trình tự Sanger tự động bằng điện di mao quản kết hợp hóa chất huỳnh quang BigDye Terminator. Phương pháp này mang lại độ chính xác trên 99,9%, là tiêu chuẩn vàng (Gold Standard) trong chẩn đoán đột biến điểm (point mutation) và đa hình đơn nucleotide (SNP).

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào 6 exon điểm nóng của gen RET trên hệ phả hệ 5 thành viên (ký hiệu RET1 đến RET5), không mở rộng sang giải toàn bộ bộ gen (WGS) hay phân tích toàn bộ 14 gen PPGLs nhằm tối ưu hóa chi phí và thời gian can thiệp lâm sàng cấp bách.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trước khi sinh học phân tử được ứng dụng sâu rộng, chẩn đoán PPGLs phụ thuộc chủ yếu vào xét nghiệm sinh hóa đo nồng độ Catecholamines (CATE: Epinephrine, Norepinephrine, Dopamine) niệu 24h, Metanephrine huyết tương kết hợp kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh (CT Scan, MRI, xạ hình MIBG).

Phương pháp chẩn đoán	Ưu điểm	Nhược điểm / Rủi ro	Chi phí & Thời gian
Định lượng Catecholamines & Metanephrines	Độ nhạy cao (91–94%), phản ánh trực tiếp hoạt động tăng tiết của khối u	Không xác định được nguyên nhân di truyền, âm tính giả ở u không tiết	Thấp; trả kết quả trong 24–48h
Chẩn đoán hình ảnh (CT / MRI / 123I-MIBG)	Định vị chính xác vị trí, kích thước khối u (3–5 cm), phát hiện xâm lấn	Chỉ phát hiện khi khối u đã hình thành cấu trúc; không dự báo nguy cơ thế hệ sau	Trung bình - Cao; phụ thuộc máy móc
Giải trình tự Sanger tự động (Đề tài)	Độ chính xác >99,9%, phát hiện đột biến mầm điểm, tầm soát sớm người mang gen	Cần trang thiết bị phân tử chuyên biệt, chỉ quét các exon mục tiêu	Trung bình; 3–5 ngày quy trình
Giải trình tự thế hệ mới (NGS - Next Gen)	Khảo sát đồng thời hàng trăm gen, phát hiện đột biến mới toàn diện	Chi phí rất cao, quy trình xử lý dữ liệu tin sinh phức tạp	Rất cao; 2–4 tuần

Áp dụng mô hình phân loại yêu cầu MoSCoW cho hệ thống kỹ thuật:

• Must have (Bắt buộc): Chiết tách DNA bộ gen đạt độ sạch $OD_{260/280} = 1,7 - 2,0$; phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu 6 exon; tinh sạch hoàn toàn dNTP/mồi thừa bằng ExoSAP-IT; giải trình tự 2 chiều (Forward/Reverse).
• Should have (Nên có): Tự động hóa gióng hàng trình tự với cơ sở dữ liệu NCBI bằng phần mềm chuyên dụng (CLC Main Workbench).
• Could have (Có thể mở rộng): Phân tích mất đoạn lớn thông qua kỹ thuật MLPA cho các gen liên quan như VHL, SDHB.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Giải trình tự toàn bộ 20 exon của RET hoặc giải trình tự toàn bộ hệ exome (WES).

Thiết kế hệ thống

Toàn bộ hệ thống kỹ thuật phân tích đột biến phân tử được chuẩn hóa với các thông số vật lý và sinh học:

• Bộ kit tách chiết: QIAGEN DNeasy/QIAamp DNA Mini Kit (Cột silica membrane, ly giải proteinase K).
• Hóa chất khuếch đại: Takara Taq™ Hot Start Version (Takara Bio, 5 U/µL), dung dịch đệm 10X PCR Buffer (chứa 15 mM $MgCl_2$), hỗn hợp dNTPs (2,5 mM mỗi loại).
• Thiết bị luân nhiệt: Mastercycler Pro AG 6325 (Eppendorf, Đức).
• Hệ thống giải trình tự: ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ) sử dụng mao quản 80 cm, chất nền điện di Polymer POP-7™, dung dịch đệm biến tính Hi-Di™ Formamide.
• Hệ cơ sở dữ liệu và công cụ phân tích: GenBank RefSeq NG_007489.5, cơ sở dữ liệu dbSNP của NCBI, phần mềm phân tích sắc ký đồ Genetic Analyzer Collection Software v3 và CLC Main Workbench v5.0.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca (Case-series descriptive study) kết hợp thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn hóa:

• Milestone 1 (Tuần 1 - 2): Thu thập bệnh phẩm máu ngoại vi, lập phả hệ di truyền 3 thế hệ, ly trích và kiểm định chất lượng genomic DNA (gDNA) bằng NanoDrop 2000c.
• Milestone 2 (Tuần 3 - 5): Tối ưu hóa điều kiện luân nhiệt phản ứng PCR cho 5 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 6 exon mục tiêu, kiểm tra bằng điện di gel Agarose 2%.
• Milestone 3 (Tuần 6 - 8): Tinh sạch enzyme bằng ExoSAP-IT, thực hiện phản ứng Cycle Sequencing với chất kết thúc chuỗi huỳnh quang dideoxynucleotide (ddNTP - BigDye).
• Milestone 4 (Tuần 9 - 10): Tủa tinh sạch loại bỏ dư lượng huỳnh quang bằng ammonium acetate ($NH_4OAc$) và ethanol tuyệt đối, chạy điện di mao quản trên máy ABI 3500.
• Milestone 5 (Tuần 11 - 12): Gióng hàng chuỗi, phân tích sắc ký đồ (electropherogram), xác định đột biến và lập báo cáo tham vấn di truyền.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình triển khai kỹ thuật tuân thủ nghiêm ngặt các quy chuẩn phòng xét nghiệm sinh học phân tử lâm sàng.

Gen RET (Nhiễm sắc thể 10q11.2) - Chiều dài 20 Exon
   Exon 10        Exon 11        Exon 13        Exon 14-15       Exon 16
 [Codon 609,    [Codon 630,    [Codon 768,     [Codon 883,       [Codon 918,
  611,618,620]      634]           790]         891, 905]            922]

Thiết kế mồi được tối ưu hóa với các thông số vật lý nhằm đảm bảo tính đặc hiệu tuyệt đối: chiều dài mồi cố định 20 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy $T_m = 56^\circ\text{C}$, tỷ lệ GC/AT cân bằng (10:10 hoặc tối đa 12:8), đầu 3' ưu tiên nucleotide A hoặc G và cách ranh giới exon-intron tối thiểu 100 bp.

Ký hiệu mồi	Trình tự Oligonucleotide ($5' \rightarrow 3'$)	Kích thước đoạn khuếch đại	$T_m$ ($^\circ\text{C}$)	Exon đích
RET – 10F RET – 10R	TATGCTTGCGACACCAGTTG TTCTGGCCTGTCCATCATAG	452 bp	56	Exon 10
RET – 11F RET – 11R	TGAGCCTCTGTCTCCATCTG CCGTTCCCATCTAGGTGAGA	699 bp	56	Exon 11
RET – 13F RET – 13R	GGCCTCTCTGTCTGAACTTG GATGGAAAGTGACCACTCAG	420 bp	56	Exon 13
RET – 14F RET – 15R	GAGAAAGCTGAGGCTTCAAG CTTTCCTAGGCTTCCCAAGG	948 bp	56	Exon 14 - 15
RET – 16F RET – 16R	GATGTGTGTGGCCAGTTCTG AGTGCAATTCCCTGGCCAAG	324 bp	56	Exon 16

Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích $15,\mu\text{L}$ được phối trộn:

• $1,5,\mu\text{L}$ 10X PCR Buffer (chứa $15,\text{mM } MgCl_2$)
• $1,5,\mu\text{L}$ dNTP mixture ($2,5,\mu\text{M}$)
• $0,75,\mu\text{L}$ Primer Forward ($10,\mu\text{M}$)
• $0,75,\mu\text{L}$ Primer Reverse ($10,\mu\text{M}$)
• $0,1,\mu\text{L}$ Takara Taq™ Hot Start Polymerase ($1,25,\text{U}/\mu\text{L}$)
• $8,9,\mu\text{L}$ Nước cất khử ion ($ddH_2O$)
• $1,5,\mu\text{L}$ Khuôn mẫu Genomic DNA

Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng enzyme kép ExoSAP-IT (Exonuclease I phân giải mồi đơn thừa và Shrimp Alkaline Phosphatase bất hoạt dNTPs tự do): $3,\mu\text{L}$ sản phẩm PCR $+ 1,\mu\text{L}$ ExoSAP-IT $+ 1,\mu\text{L } H_2O$, ủ $37^\circ\text{C}$ trong 15 phút, sau đó bất hoạt enzyme ở $80^\circ\text{C}$ trong 15 phút.

Phản ứng Cycle Sequencing được thiết lập với tổng thể tích $8,5,\mu\text{L}$ gồm: $0,5,\mu\text{L}$ BigDye Terminator, $1,5,\mu\text{L}$ 1X Sequencing Buffer, $1,0,\mu\text{L}$ Mồi ($1,6,\mu\text{M}$), $1,0,\mu\text{L}$ DNA đã tinh sạch, $4,5,\mu\text{L } ddH_2O$. Chu trình nhiệt: $96^\circ\text{C}$ (1 phút); 25 chu kỳ gồm $[96^\circ\text{C}/10\text{s} \rightarrow 50^\circ\text{C}/5\text{s} \rightarrow 60^\circ\text{C}/4\text{ phút}]$; giữ mẫu ở $4^\circ\text{C}$.

Testing và validation

Đo quang phổ nồng độ và độ tinh sạch nucleic acid trên máy NanoDrop 2000c cho thấy toàn bộ các mẫu đều đạt chuẩn tách chiết tinh sạch cao:

Ký hiệu mẫu	Giá trị $OD_{260}/OD_{280}$	Nồng độ gDNA ($\text{ng}/\mu\text{L}$)	Đánh giá chất lượng
RET1	1,94	40,8	Đạt chuẩn, không nhiễm tạp protein
RET2	1,98	14,7	Đạt chuẩn, đủ nồng độ khuôn PCR
RET3	1,92	21,0	Đạt chuẩn
RET4	1,88	24,7	Đạt chuẩn
RET5	1,98	19,8	Đạt chuẩn

Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 2% với thang chuẩn DNA GeneRuler™ 1 kb Plus khẳng định:

• Giếng 1 (Exon 10): 1 băng duy nhất đúng kích thước 452 bp.
• Giếng 3 (Exon 11): 1 băng duy nhất đúng kích thước 699 bp.
• Giếng 5 (Exon 13): 1 băng duy nhất đúng kích thước 420 bp.
• Giếng 7 (Exon 14-15): 1 băng duy nhất đúng kích thước 948 bp.
• Giếng 9 (Exon 16): 1 băng duy nhất đúng kích thước 324 bp.
• Các giếng chứng âm (NTC - giếng 2, 4, 6, 8, 10) hoàn toàn không xuất hiện vạch primer-dimer hay băng tạp nhiễm.

Trình tự chuẩn Exon 11 (Codon 634):    5' - T G C - 3'  --> Mã hóa: Cysteine
Sắc ký đồ mẫu bệnh nhân (Dị hợp tử): 5' - [T/C] G C - 3' 
Trình tự đột biến gây bệnh:            5' - C G C - 3'  --> Mã hóa: Arginine (c.Cys634Arg)

           A (Green)       C (Blue)        G (Black)       T (Red)

Kết quả đạt được

Giải trình tự điện di mao quản ABI 3500 kết hợp phân tích trên phần mềm CLC Main Workbench phát hiện:

1. Ca bệnh chỉ số (Proband) và người chị gái mang đột biến dị hợp tử thay thế nucleotide tại exon 11, vị trí codon 634: TGC chuyển thành CGC (c.Cys634Arg hay C634R). Đột biến này làm thay đổi acid amin Cysteine thành Arginine trong vùng giàu Cysteine (Cysteine-rich domain) ở phần ngoại bào của thụ thể RET Tyrosine Kinase.
2. Tại Exon 13, phát hiện điểm đa hình nucleotide đơn SNP đồng nghĩa (Silent mutation/polymorphism) tại codon 769 (CTT $\rightarrow$ CTG, giữ nguyên mã hóa amino acid Leucine - p.Leu769Leu), không gây biến đổi chức năng protein.
3. Không phát hiện đột biến tại các exon 10, 14, 15 và 16 ở các mẫu khảo sát.

---

Đổi mới và đóng góp

• Tối ưu hóa thiết kế mồi gộp exon 14–15 (948 bp): Thay vì sử dụng 2 phản ứng khuếch đại riêng biệt cho từng exon, nghiên cứu đã thiết kế cặp mồi RET-14F và RET-15R khuếch đại liên tục một đoạn 948 bp chứa cả exon 14 và exon 15. Cải tiến này giúp tiết kiệm 30% lượng hóa chất Taq Polymerase và rút ngắn 25% tổng thời gian thao tác luân nhiệt.
• Quy trình tủa loại bỏ BigDye hiệu suất cao: Áp dụng kết hợp muối $5\text{M } NH_4OAc$ và Ethanol tuyệt đối, làm khô ở $48^\circ\text{C}$ và hòa tan trong formamide biến tính Hi-Di™ ($96^\circ\text{C}$ trong 2 phút rồi sốc lạnh ngay ở $0^\circ\text{C}$ trong 5 phút). Kỹ thuật này loại bỏ hoàn toàn hiện tượng "Dye Blob" (vết loang huỳnh quang gây nhiễu tín hiệu ở 100 nucleotide đầu), nâng cao tỷ lệ đọc chính xác của phần mềm base-calling lên 99,98%.
• Ý nghĩa lâm sàng và đóng góp thực tiễn: Khẳng định ca u sắc bào thượng thận này nằm trong bệnh cảnh Hội chứng Đa u tuyến nội tiết loại 2A (MEN2A) có tính chất gia đình di truyền trội. Đột biến c.Cys634Arg làm thụ thể RET dimer hóa tự phát mà không cần phối tử GDNF, kích hoạt liên tục chuỗi truyền tín hiệu tăng sinh tế bào. Phát hiện này cung cấp chứng cứ khoa học quyết định để:
  • Chỉ định cắt bỏ tuyến giáp dự phòng (prophylactic thyroidectomy) cho bệnh nhân nhằm ngăn chặn Ung thư tuyến giáp dạng tủy (MTC - Medullary Thyroid Carcinoma) có thể khởi phát sau đó.
  • Sàng lọc sớm bằng xét nghiệm gen cho 2 người con gái trong phả hệ, cho phép phát hiện sớm trước khi u thượng thận tái phát gây biến chứng tử vong.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Quy trình giải trình tự gen RET chuẩn hóa trong đề tài có khả năng chuyển giao và áp dụng trực tiếp tại các trung tâm sinh học phân tử lâm sàng, bệnh viện chuyên khoa nội tiết, ung bướu và các phòng xét nghiệm di truyền:

[Khoa Khám Bệnh / Lâm Sàng]
                                  [Quy trình Chuẩn Phân tử]
                                  - Tách chiết DNA (1h)
                                  - PCR Exon 10-16 (2.5h)
                                  - ExoSAP-IT & BigDye (3h)
                                  - ABI 3500 Sequencing (2h)
                                  [Phân tích CLC Workbench]

• Kịch bản ứng dụng lâm sàng: Bệnh nhân trẻ tuổi (<40 tuổi) hoặc bệnh nhân u thượng thận 2 bên, đa ổ, có tiền căn gia đình đột tử/tai biến mạch máu não sẽ được chỉ định lấy $2,\text{mL}$ máu EDTA làm xét nghiệm phân tử.
• Yêu cầu hạ tầng triển khai: Phòng sạch đạt chuẩn an toàn sinh học cấp II, trang bị hệ thống luân nhiệt PCR (Eppendorf Mastercycler hoặc tương đương), máy quang phổ NanoDrop, máy giải trình tự tự động ABI 3500 (16 mao quản hoặc 24 mao quản) và phần mềm CLC Sequence Viewer.
• Hiệu quả kinh tế - xã hội: Chi phí thực hiện một quy trình giải trình tự 6 exon trực tiếp ước tính khoảng 1.500.000 – 2.000.000 VNĐ/mẫu. So với chi phí điều trị cấp cứu đột quỵ hoặc phẫu thuật cấp tính u di căn giai đoạn muộn (lên đến hàng trăm triệu đồng), việc tầm soát sớm giúp tiết kiệm hơn 85% chi phí y tế dài hạn cho gia đình bệnh nhân.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật hiện tại:
  • Kỹ thuật giải trình tự Sanger chỉ tập trung vào 6 exon điểm nóng của gen RET, chưa bao quát toàn bộ 20 exon cũng như các đột biến dạng mất/lặp đoạn lớn (Large genomic rearrangements).
  • Chưa mở rộng sàng lọc đồng thời các gen ức chế khối u khác như VHL, NF1, SDHB, SDHD trong cùng một lượt chạy do hạn chế về công nghệ đơn gen.
• Hướng phát triển:
  • Thiết kế bộ mồi multiplex PCR kết hợp công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Targeted NGS Panel) bao phủ toàn bộ 14 gen gây bệnh PPGLs.
  • Ứng dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) để phát hiện các biến dị tái cấu trúc số lượng bản sao gen (CNV).
  • Xây dựng ngân hàng dữ liệu số quốc gia về các biến thể đột biến gen RET trên quần thể bệnh nhân u thần kinh nội tiết người Việt Nam.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học / Y sinh học: Cung cấp tài liệu nghiên cứu chuẩn mực về quy trình chẩn đoán phân tử từ tách chiết, thiết kế mồi PCR đến phân tích dữ liệu sắc ký đồ giải trình tự Sanger.
• Kỹ thuật viên & Bác sĩ xét nghiệm di truyền: Cung cấp các thông số kỹ thuật chuẩn hóa (thành phần phản ứng, chu trình nhiệt, mẹo tinh sạch tủa formamide tránh Dye Blob) để triển khai trực tiếp trên hệ thống máy ABI 3500.
• Bác sĩ Nội tiết & Ngoại ung bướu: Cung cấp cơ sở khoa học chính xác để phân loại hội chứng MEN2A, lựa chọn phác đồ điều trị phẫu thuật triệt để và chỉ định cắt tuyến giáp phòng ngừa.
• Bệnh nhân và gia đình người bệnh: Được phát hiện bản chất di truyền của bệnh lý, từ đó người thân trực hệ được tầm soát miễn dịch/di truyền chủ động, nâng cao tỷ lệ sống còn trên 95%.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật và điều kiện phòng xét nghiệm để triển khai quy trình này là gì?

Phòng xét nghiệm cần đạt chuẩn phòng sạch sinh học phân tử với 3 khu vực độc lập một chiều (Khu vực chuẩn bị hóa chất/Pha mồi $\rightarrow$ Khu vực nạp mẫu/Tách chiết $\rightarrow$ Khu vực PCR/Giải trình tự sau khuếch đại). Trang thiết bị bắt buộc gồm: máy ly tâm lạnh $14.000,\text{vòng/phút}$, tủ ấm $37^\circ\text{C} - 80^\circ\text{C}$, máy đo quang phổ vi tích NanoDrop, máy luân nhiệt PCR và hệ thống máy giải trình tự điện di mao quản ABI 3500.

2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger có giới hạn độ nhạy như thế nào so với NGS?

Giải trình tự Sanger có độ chính xác nhận diện nucleotide $>99,9%$, rất tối ưu cho đột biến dòng mầm (dị hợp tử $50%$ hoặc đồng hợp tử $100%$). Tuy nhiên, giới hạn phát hiện (LOD) của Sanger đối với đột biến khảm (mosaicism) hoặc đột biến tế bào soma trong mô u chỉ ở mức $15–20%$. Nếu mẫu có tỷ lệ đột biến dưới $10%$, cần sử dụng Next-Generation Sequencing (NGS) với độ sâu đọc cao (Deep sequencing).

3. Quy trình xử lý mẫu để tránh hiện tượng Dye Blob trên biểu đồ ABI 3500?

Dye Blob sinh ra do các dideoxynucleotide (ddNTP) gắn huỳnh quang BigDye dư thừa chưa kết hợp không được rửa sạch. Để khắc phục, quy trình bắt buộc: (1) Bổ sung muối $5\text{M } NH_4OAc$ đúng tỷ lệ thể tích; (2) Ly tâm lạnh ở $4^\circ\text{C}$ với tốc độ tối thiểu $13.200,\text{vòng/phút}$ trong 20 phút; (3) Hút triệt để dịch nổi mà không chạm vào hạt tủa; (4) Làm khô tủa hoàn toàn ở $48^\circ\text{C}$ trước khi hoàn nguyên bằng formamide Hi-Di.

4. Tại sao bệnh nhân có u thượng thận lại được khuyến cáo cắt bỏ tuyến giáp dự phòng khi có đột biến codon 634?

Đột biến c.Cys634Arg tại exon 11 của gen RET là chỉ dấu đặc trưng cho hội chứng MEN2A. Hơn 95% bệnh nhân mang đột biến codon 634 sẽ phát triển ung thư tuyến giáp dạng tủy (MTC - Medullary Thyroid Carcinoma) có tính chất xâm lấn rất sớm trong cuộc đời. Do đó, khuyến cáo lâm sàng quốc tế (Hiệp hội Tuyến giáp Hoa Kỳ - ATA) yêu cầu chỉ định cắt tuyến giáp toàn phần phòng ngừa ngay khi phát hiện đột biến này.

5. Chi phí và thời gian trả kết quả của quy trình xét nghiệm này là bao lâu?

Thời gian thực hiện quy trình kỹ thuật phòng lab mất từ 24 đến 36 giờ làm việc (bao gồm các bước kiểm tra QC). Thời gian trả kết quả lâm sàng tiêu chuẩn từ 3 đến 5 ngày. Chi phí hóa chất tiêu hao cho mỗi ca bệnh (khảo sát 6 exon hai chiều) dao động từ 1.200.000 đến 1.800.000 VNĐ, tối ưu hóa hơn nhiều so với chi phí gửi mẫu ra nước ngoài hoặc làm NGS toàn diện.

---

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình sinh học phân tử chẩn đoán đột biến 6 exon điểm nóng của proto-oncogene RET bằng phương pháp khuếch đại PCR và giải trình tự trực tiếp Sanger trên máy ABI 3500. Việc xác định thành công đột biến dòng mầm c.Cys634Arg tại Exon 11 trên ca bệnh u sắc bào tuyến thượng thận hai bên có tính chất gia đình đã minh chứng vai trò tối quan trọng của kỹ thuật di truyền phân tử trong việc định danh hội chứng MEN2A. Kết quả nghiên cứu không chỉ mang lại giá trị học thuật chuyên sâu về công nghệ sinh học y dược mà còn mở ra hướng tiếp cận chuẩn xác cho công tác chẩn đoán sớm, can thiệp phẫu thuật phòng ngừa và bảo vệ sức khỏe cho các thế hệ trong gia đình người bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đồ án tốt nghiệp 1. U sắc bào tuyến thượng thận 1. Giới thiệu Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine. Khoảng 80-85% các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9].

Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm. Neuroblastoma (u nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất phát sinh từ tủy thượng thận. Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17]. U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận.

Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết. Ung thư thượng thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1]. Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng hormones. Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú nói chung dao động từ 0,2 - 0,6%.

Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của PPGLs là khoảng 1,7%. Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu. Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]. PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE.

Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh. Ngoài ra, PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin, 2 Đồ án tốt nghiệp calcitonin, oxytocin và vasopressin. Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11]. PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine neoplasma- MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội chứng Von Hippel-Lindau (VHL).

Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn lại là lành tính [21]. Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa CATE trong nước tiểu. Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định. Nguyên nhân U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường.

Những bất thường di truyền phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1. Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2 bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u tủy thượng thận hay u cận hạch [22]. Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim. Trong tế bào ưa crôm, norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và metanephrine.

Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao 3 Đồ án tốt nghiệp hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]. Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng rượu bia trong thời gian dài,… cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận. Biểu hiện - Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu 94%). - Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ.

Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp. Tăng tiết CATE làm cho bệnh nhân loạn nhịp tim. Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]. Xét nghiệm chẩn đoán Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo: - Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện hóa.

Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]. - Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F- fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]. - Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả [9]. Điều trị - Cắt bỏ hoàn toàn khối u.

- Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ khối u. Bất thường di truyền Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9] Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1, MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney (u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney- Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]. Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL. Phát hiện đột biến gen NF1 rất phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12].

Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều có đặc điểm tương đồng [4, 6]. Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc 5 Đồ án tốt nghiệp điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL. Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình. *Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ [16] Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611, 618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11.

Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc trưng của RET. Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo độ tuổi. Song, bệnh nhân mắc bệnh PCCs lại chiểm tỷ lệ thấp hơn khi bị đột biến exon 10. Tỷ lệ như sau: · Codon 609 – 4 → 26%.

Nhóm bệnh MEN2B Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình. Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F). Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30. Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm 6 Đồ án tốt nghiệp lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhận thấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%).

Đặc điểm thường gặp ở các khối u được thống kê như sau: · U có ở 2 tuyến: 4,1% · U ở 1 tuyến phải: 70,3% · U ở 1 tuyến trái: 25,6% Kích thước trung bình của khối u: 5,86 ± 4,14 cm · Kích thước thường gặp: 3 → 5 cm (37,3%) · U bên trái: 7,79 → 5,11 cm · U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm · U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02 ± 4,19 cm) Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy: - Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có 1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình [5].