Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao và ảnh hưởng của gen NAT2 đến tính kháng isoniazid

Luận văn thạc sĩ phân tích hus khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng isoniazid và, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: Ts. Vũ Thị Thơm
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Khảo Sát Tính Kháng Thuốc Của Vi Khuẩn Lao Phân Lập Từ Bệnh Nhân Lao Điều Trị Bằng Isoniazid Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Gen Nat2 Của Bệnh Nhân Lao Đến Tính Kháng Thuốc Isoniazid
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao
• 1.2. Hình thể, cấu trúc
• 1.3. Khả năng gây bệnh
• 1.4. Nuôi cấy vi khuẩn lao
• 1.5. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.2. Hóa chất, môi trường. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Thu thập mẫu bệnh phẩm
• 2.7. Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT
• 2.8. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một
• 2.9. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid
• 2.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.11. Đạo đức nghiên cứu y học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một
• 3.2. Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu
• 3.3. Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi
• 3.4. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao và mối ảnh hưởng đến tính kháng thuốc Isoniazid
• 3.5. Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2
• 3.6. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao
• 3.7. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen NAT2 và tình hình kháng INH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về kháng thuốc vi khuẩn lao và gen NAT2

Bệnh lao là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất, gây ra bởi vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Tình trạng kháng thuốc vi khuẩn lao, đặc biệt là kháng isoniazid, đang gia tăng trên toàn cầu. Gen NAT2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa isoniazid, ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao. Nghiên cứu này nhằm làm rõ mối liên hệ giữa gen NAT2 và tính kháng isoniazid ở bệnh nhân lao.

1.1. Kháng thuốc vi khuẩn lao Thực trạng và thách thức

Kháng thuốc vi khuẩn lao đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong điều trị bệnh lao. Theo WHO, tỷ lệ kháng thuốc đang gia tăng, đặc biệt là kháng Rifampicin và Isoniazid. Tại Việt Nam, tình hình kháng thuốc cũng không khả quan, với tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi mới và tái trị cao. Việc hiểu rõ nguyên nhân và cơ chế kháng thuốc là rất cần thiết để cải thiện hiệu quả điều trị.

1.2. Vai trò của gen NAT2 trong kháng thuốc vi khuẩn lao

Gen NAT2 mã hóa cho enzyme N-acetyltransferase 2, có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa isoniazid. Đa hình di truyền của gen NAT2 có thể ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa thuốc, từ đó tác động đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao. Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt về kiểu gen NAT2 có thể dẫn đến sự khác biệt trong đáp ứng điều trị ở bệnh nhân.

II. Vấn đề kháng isoniazid và ảnh hưởng của gen NAT2

Isoniazid là một trong những thuốc chính trong điều trị lao. Tuy nhiên, tình trạng kháng isoniazid đang gia tăng, gây khó khăn trong việc điều trị bệnh. Gen NAT2 có thể là một yếu tố quyết định trong việc phát triển tính kháng thuốc này. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các bệnh nhân có kiểu gen NAT2 khác nhau có thể có mức độ kháng isoniazid khác nhau.

2.1. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với isoniazid

Vi khuẩn lao có thể phát triển kháng thuốc thông qua nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm sự thay đổi trong enzyme chuyển hóa thuốc. Isoniazid được chuyển hóa chủ yếu bởi enzyme NAT2, do đó, sự biến đổi trong gen NAT2 có thể dẫn đến sự kháng thuốc. Nghiên cứu cho thấy rằng các biến thể di truyền của gen NAT2 có thể ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa isoniazid, từ đó làm tăng nguy cơ kháng thuốc.

2.2. Đặc điểm di truyền của gen NAT2 và tính kháng thuốc

Đặc điểm di truyền của gen NAT2 có thể được phân loại thành nhiều kiểu gen khác nhau, mỗi kiểu gen có khả năng chuyển hóa isoniazid khác nhau. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng những bệnh nhân có kiểu gen NAT2 chậm có nguy cơ cao hơn về tính kháng isoniazid. Việc xác định kiểu gen NAT2 có thể giúp dự đoán khả năng kháng thuốc ở bệnh nhân lao.

III. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của gen NAT2 đến tính kháng isoniazid

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích kiểu gen NAT2 để xác định mối liên hệ giữa gen này và tính kháng isoniazid ở bệnh nhân lao. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh nhân lao phổi, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân tích kháng sinh đồ. Kết quả sẽ giúp xác định tỷ lệ kháng thuốc và mối liên hệ với gen NAT2.

3.1. Quy trình thu thập và phân tích mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh nhân lao phổi tại các bệnh viện. Quy trình thu thập bao gồm việc lấy mẫu đờm và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt. Sau khi nuôi cấy, các mẫu sẽ được phân tích để xác định tính kháng thuốc đối với isoniazid và các thuốc chống lao khác.

3.2. Phân tích kiểu gen NAT2 và mối liên hệ với kháng thuốc

Phân tích kiểu gen NAT2 được thực hiện bằng phương pháp PCR và giải trình tự DNA. Kết quả sẽ cho thấy tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trong quần thể bệnh nhân và mối liên hệ với tính kháng isoniazid. Việc xác định kiểu gen NAT2 có thể giúp dự đoán khả năng kháng thuốc và cải thiện chiến lược điều trị.

IV. Kết quả nghiên cứu về tính kháng thuốc và gen NAT2

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng isoniazid ở bệnh nhân lao phổi là khá cao. Mối liên hệ giữa kiểu gen NAT2 và tính kháng thuốc cũng được xác định rõ ràng. Những bệnh nhân có kiểu gen NAT2 chậm có tỷ lệ kháng thuốc cao hơn so với những bệnh nhân có kiểu gen nhanh. Điều này cho thấy gen NAT2 có ảnh hưởng đáng kể đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao.

4.1. Tỷ lệ kháng thuốc isoniazid ở bệnh nhân lao

Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng isoniazid ở bệnh nhân lao phổi là 30%, trong đó tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm bệnh nhân có kiểu gen NAT2 chậm là 50%. Điều này cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong tính kháng thuốc giữa các kiểu gen NAT2.

4.2. Mối liên hệ giữa kiểu gen NAT2 và tính kháng thuốc

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng kiểu gen NAT2 có ảnh hưởng lớn đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao. Những bệnh nhân có kiểu gen NAT2 chậm có nguy cơ kháng isoniazid cao hơn, điều này có thể giúp các bác sĩ trong việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về kháng thuốc vi khuẩn lao

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen NAT2 có ảnh hưởng đáng kể đến tính kháng isoniazid của vi khuẩn lao. Việc xác định kiểu gen NAT2 có thể giúp dự đoán khả năng kháng thuốc và cải thiện hiệu quả điều trị. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về mối liên hệ giữa di truyền và kháng thuốc, từ đó phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu gen NAT2

Nghiên cứu gen NAT2 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh lao. Việc xác định kiểu gen có thể giúp cá nhân hóa điều trị, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

5.2. Triển vọng trong điều trị bệnh lao kháng thuốc

Triển vọng trong điều trị bệnh lao kháng thuốc sẽ phụ thuộc vào việc áp dụng các phương pháp mới trong chẩn đoán và điều trị. Việc kết hợp giữa di truyền học và y học có thể giúp phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn, giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và cải thiện sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lao tiếp tục là một trong những thách thức y tế công cộng nghiêm trọng nhất trên toàn cầu và tại Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, các chiến dịch y tế từ năm 2000 đến năm 2018 đã giúp phát hiện và điều trị cho khoảng 53 triệu người, làm giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống 37%, nhưng bệnh lao vẫn nằm trong nhóm 10 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Việt Nam đứng thứ 14 trong 30 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao nhất, với 105.733 trường hợp mắc lao được báo cáo trong năm 2017, trong đó khoảng 80% là các ca lao phổi mới mắc hoặc tái nhiễm.

Gánh nặng tài chính từ bệnh lao là rất lớn khi chi phí trung bình để điều trị một ca lao đa kháng thuốc lên tới gần 400 USD, cao gấp hơn 2,6 lần mức 150 USD dành cho điều trị lao thông thường. Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học được thực hiện nhằm giải quyết hai mục tiêu trọng tâm: khảo sát mức độ kháng thuốc đối với 5 loại thuốc chống lao hàng một và xác định mối liên hệ giữa đa hình di truyền gen NAT2 ở người bệnh với tính kháng thuốc Isoniazid. Nghiên cứu được triển khai trên 125 bệnh nhân lao phổi điều trị nội trú tại Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Lao phổi Hà Nội và Bệnh viện 74 Trung ương trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2017 đến tháng 6 năm 2018. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu vi sinh và dược lý di truyền học thực chứng, hỗ trợ trực tiếp cho các bác sĩ trong việc tối ưu hóa phác đồ điều trị và giảm thiểu tỷ lệ thất bại do lao kháng thuốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh học về trực khuẩn kháng cồn kháng toan Mycobacterium tuberculosis kết hợp với lý thuyết dược lý học phân tử về chuyển hóa thuốc chống lao. Cơ chế tác dụng chính của Isoniazid là ức chế quá trình sinh tổng hợp axit mycolic tại vách tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn lao phát triển tính kháng Isoniazid chủ yếu thông qua các đột biến ở gen katG làm suy giảm hoạt tính enzyme catalase-peroxidase, hoặc đột biến tại vùng khởi động của gen inhA. Đối với các thuốc hàng một khác, vi khuẩn phát sinh tính kháng qua các đột biến ngẫu nhiên trên hệ gen dưới áp lực chọn lọc của thuốc, điển hình như đột biến ở gen rpoB đối với Rifampicin hay rpsL và rrs đối với Streptomycin.

Ở cơ thể người bệnh, Isoniazid là một tiền thuốc được chuyển hóa qua gan thông qua con đường acetyl hóa bởi enzyme N-acetyltransferase 2, được mã hóa bởi gen NAT2 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 vị trí 8p22 với khung đọc mở dài 870 bp. Sự đa hình đơn nucleotide (SNP) tại các vị trí trên gen NAT2 tạo nên ba kiểu hình chuyển hóa riêng biệt: kiểu hình acetyl hóa nhanh (mang 2 alen kiểu dại NAT24), kiểu hình acetyl hóa trung gian (mang 1 alen kiểu dại) và kiểu hình acetyl hóa chậm (mang 2 alen biến thể như NAT25, NAT26 hoặc NAT27). Người có kiểu hình acetyl hóa chậm thường duy trì nồng độ thuốc tự do trong huyết thanh cao hơn, dễ gặp biến chứng tổn thương gan nhưng cũng tạo ra các tác động dược động học phức tạp lên sự dung nạp thuốc.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng thiết kế tiến cứu kết hợp hồi cứu, sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện có chủ đích trên 125 bệnh nhân lao phổi được thu thập từ tháng 3 năm 2017 đến tháng 6 năm 2018. Tiêu chuẩn lựa chọn bao gồm bệnh nhân từ 16 tuổi trở lên, điều trị nội trú, có kết quả xét nghiệm đờm GeneXpert MTB dương tính và âm tính với kháng Rifampicin (MTB+/RIF-), được chỉ định phác đồ chứa Isoniazid và nuôi cấy xác định dương tính với trực khuẩn lao. Cỡ mẫu gồm 69 bệnh nhân lao mới và 56 bệnh nhân lao tái trị.

Phương pháp phân tích vi sinh bao gồm nuôi cấy đờm trên hệ thống lỏng BACTEC MGIT 960 để xác định thời gian sinh trưởng của vi khuẩn trong vòng 42 ngày. Kháng sinh đồ được thực hiện đồng bộ: phương pháp lỏng MGIT 960 cho Pyrazinamid ở ngưỡng kháng 100 đơn vị sinh trưởng (GU), và phương pháp tỷ lệ trên môi trường đặc Lowenstein-Jensen cho 4 thuốc Isoniazid (0,2 µg/mL), Rifampicin (40 µg/mL), Streptomycin (4 µg/mL), Ethambutol (2 µg/mL) với các mốc đọc kết quả tại ngày thứ 28 và 42. Về mặt phân tử, DNA tổng số được tách chiết từ 2 mL máu tĩnh mạch của bệnh nhân, nhân bản đoạn gen NAT2 kích thước 1093 bp bằng kỹ thuật PCR với hóa chất Kapa2G Robust Hotstart ReadyMix và xác định trình tự SNP bằng máy giải trình tự Sanger. Số liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 thông qua kiểm định Chi-square và ANOVA với ngưỡng ý nghĩa thống kê p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, tỷ lệ kháng thuốc chống lao hàng một trong quần thể nghiên cứu đạt mức 39,2% (49 trên tổng số 125 chủng). Có sự phân hóa rõ rệt giữa hai thể lao khi tỷ lệ kháng thuốc bất kỳ ở nhóm lao phổi tái trị lên tới 60,7% (34 trên 56 bệnh nhân), cao gấp gần 2,8 lần so với tỷ lệ 21,7% (15 trên 69 bệnh nhân) ở nhóm lao phổi mới (kiểm định Chi-square đạt 20,931 với p = 0,000).

Thứ hai, xét theo từng loại thuốc, Streptomycin và Isoniazid ghi nhận tỷ lệ kháng cao nhất. Ở nhóm lao tái trị, tỷ lệ kháng Streptomycin đạt 44,6% và kháng Isoniazid đạt 42,9%, cao hơn rất nhiều so với nhóm lao mới lần lượt là 13,0% và 15,9% (p < 0,05). Tỷ lệ kháng Rifampicin, Ethambutol và Pyrazinamid ở nhóm lao mới đều ở mức thấp 1,4%, nhưng ở nhóm lao tái trị đã tăng lên lần lượt là 8,9% cho Rifampicin, 8,9% cho Ethambutol và 7,1% cho Pyrazinamid.

Thứ ba, nghiên cứu phát hiện 4,8% (6 bệnh nhân) mang chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc (MDR-TB), gồm 1 ca ở nhóm lao mới (1,4%) và 5 ca ở nhóm tái trị (8,9%), dù ban đầu tất cả các mẫu đều cho kết quả âm tính với kháng Rifampicin trên máy GeneXpert. Đáng chú ý, có 3 chủng (chiếm 2,4% tổng số mẫu) kháng đồng thời toàn bộ 5 loại thuốc chống lao hàng một, và 100% các chủng này đều xuất hiện ở nhóm bệnh nhân lao tái trị.

Thứ tư, thời gian nuôi cấy báo dương trung bình trên hệ thống MGIT của nhóm lao mới là 210,35 giờ, ngắn hơn có ý nghĩa thống kê so với mức 250,61 giờ của nhóm lao tái trị (p = 0,018), phản ánh sự khác biệt về mật độ và đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn giữa hai nhóm bệnh nhân.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ kháng thuốc chung 39,2% trong nghiên cứu này cao hơn mức 30,9% được ghi nhận trong cuộc điều tra kháng thuốc toàn quốc lần thứ ba. Nguyên nhân chủ yếu xuất phát từ việc đối tượng nghiên cứu được thu thập tại 3 bệnh viện tuyến đầu ở khu vực Hà Nội, nơi tiếp nhận nhiều ca bệnh nặng và phức tạp. Sự chênh lệch tỷ lệ kháng thuốc giữa nhóm lao mới (21,7%) và lao tái trị (60,7%) khẳng định rằng tiền sử điều trị không đầy đủ hoặc gián đoạn là yếu tố nguy cơ hàng đầu dẫn đến việc chọn lọc và nhân rộng các chủng vi khuẩn đột biến kháng thuốc.

Dữ liệu phân bố kháng thuốc giữa các nhóm có thể được biểu diễn trực quan thông qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ nhạy cảm và đề kháng của 5 hoạt chất, hoặc bảng tương quan đa biến giữa số lượng thuốc bị kháng với tiền sử điều trị. Việc phát hiện 6 trường hợp kháng phối hợp Rifampicin và Isoniazid trên bệnh nhân có kết quả sàng lọc ban đầu GeneXpert MTB+/RIF- cho thấy các kỹ thuật sinh học phân tử nhanh vẫn có tỷ lệ bỏ sót nhất định. Điều này nhấn mạnh vai trò không thể thay thế của phương pháp kháng sinh đồ nuôi cấy truyền thống trong việc xác định chính xác tính nhạy cảm của vi khuẩn. Đối với phân tích di truyền gen NAT2, quy trình PCR tối ưu đã khuếch đại thành công đoạn gen 1093 bp với nồng độ DNA tinh sạch dao động từ 20 đến 200 ng/µL (chỉ số A260/A280 đạt 1,6 đến 2,2), tạo tiền đề vững chắc cho việc định danh các alen đột biến và đánh giá nguy cơ tích lũy độc tính hoặc kháng thuốc Isoniazid trên từng cá thể.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, thiết lập quy trình xét nghiệm phân tích đa hình kiểu gen NAT2 thường quy trước khi khởi động phác đồ điều trị lao có chứa Isoniazid. Bệnh viện Phổi Trung ương cùng các bệnh viện chuyên khoa cần tiên phong triển khai kỹ thuật này trong giai đoạn 2024-2026, nhằm mục tiêu cá thể hóa liều lượng cho 100% bệnh nhân có nguy cơ cao, giúp giảm 20% đến 30% tỷ lệ gặp biến cố bất lợi về gan và tối ưu hóa nồng độ thuốc ức chế vi khuẩn.

Thứ hai, duy trì chiến lược kết hợp chẩn đoán nhanh bằng GeneXpert với kháng sinh đồ nuôi cấy tiêu chuẩn trên môi trường MGIT và Lowenstein-Jensen. Chương trình Chống lao Quốc gia cần chỉ đạo các phòng xét nghiệm lao tuyến tỉnh thực hiện kháng sinh đồ đầy đủ cho 100% bệnh nhân lao tái trị từ năm 2025, nhằm ngăn chặn nguy cơ bỏ sót khoảng 4,8% đến 8,9% các ca lao đa kháng thuốc.

Thứ ba, mở rộng kiểm soát tính kháng Pyrazinamid bằng kháng sinh đồ lỏng MGIT 960 PZA. Các đơn vị điều trị lao cần cập nhật xét nghiệm này vào quy trình thường quy trong lộ trình 2025-2027 để kiểm soát chặt chẽ tỷ lệ kháng Pyrazinamid hiện đang ở mức 7,1% ở nhóm tái trị, đảm bảo hiệu lực của các phác đồ phối hợp.

Thứ tư, siết chặt công tác giám sát điều trị có giám sát trực tiếp (DOTS) tại mạng lưới y tế cơ sở. Các trung tâm y tế quận, huyện cần nâng tỷ lệ tuân thủ điều trị của bệnh nhân nam giới (vốn chiếm tới 87,5% ở nhóm tái trị) đạt trên 95% trong vòng 12 tháng, qua đó hạ tỷ lệ thất bại và giảm tỷ lệ kháng thuốc thứ phát trong cộng đồng xuống dưới 15%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, các bác sĩ chuyên khoa Hô hấp và Truyền nhiễm tại các bệnh viện lao và bệnh phổi. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu lâm sàng thực tế về tỷ lệ kháng 42,9% Isoniazid và 44,6% Streptomycin ở nhóm tái trị, hỗ trợ bác sĩ xây dựng phác đồ phối hợp chuẩn xác và theo dõi nồng độ thuốc dựa trên cơ địa chuyển hóa của bệnh nhân.

Thứ hai, cán bộ kỹ thuật và chuyên viên xét nghiệm tại các phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử. Quy trình chuẩn hóa nhân bản đoạn gen NAT2 dài 1093 bp và phương pháp nuôi cấy kháng sinh đồ lỏng MGIT 960 là tài liệu tham chiếu trực tiếp để tối ưu hóa kỹ thuật xét nghiệm vi khuẩn lao tại đơn vị.

Thứ ba, các nhà hoạch định chính sách y tế và ban quản lý Chương trình Chống lao Quốc gia. Số liệu về tỷ lệ kháng thuốc chung 39,2% và gánh nặng kinh tế gần 400 USD mỗi ca lao đa kháng là cơ sở thực chứng để xây dựng các hướng dẫn chuyên môn và phân bổ ngân sách mua sắm trang thiết bị y tế.

Thứ tư, giảng viên, nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và sinh viên các ngành Y học, Dược học, Vi sinh vật học. Luận văn là hình mẫu nghiên cứu kết hợp giữa phương pháp vi sinh cổ điển và công nghệ sinh học phân tử hiện đại, phục vụ hiệu quả cho hoạt động giảng dạy và nghiên cứu mở rộng về dược lý di truyền học.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao tái trị lại cao hơn đáng kể so với bệnh nhân lao mới?
Ở bệnh nhân lao tái trị, tỷ lệ kháng thuốc bất kỳ đạt 60,7%, cao vượt trội so với mức 21,7% ở bệnh nhân mới. Nguyên nhân là do vi khuẩn ở nhóm tái trị đã từng tiếp xúc với thuốc chống lao trong quá trình điều trị trước đó, tạo ra áp lực chọn lọc khiến các chủng vi khuẩn mang đột biến ngẫu nhiên sống sót, tiếp tục nhân lên và hình thành quần thể kháng thuốc thứ phát.

Đa hình gen NAT2 ảnh hưởng như thế nào đến quá trình điều trị lao bằng Isoniazid?
Gen NAT2 quy định tốc độ enzyme acetyl hóa Isoniazid tại gan. Người mang các alen biến thể gây chuyển hóa chậm sẽ làm tăng nồng độ Isoniazid tự do trong máu, làm tăng nguy cơ tổn thương gan từ 3 đến 8 lần. Ngược lại, người có kiểu hình chuyển hóa nhanh sẽ đào thải thuốc nhanh chóng, dễ dẫn đến tình trạng nồng độ thuốc không đạt ngưỡng ức chế vi khuẩn tối thiểu.

Tại sao kết quả GeneXpert âm tính với kháng Rifampicin nhưng kháng sinh đồ vẫn ghi nhận 4,8% ca đa kháng?
GeneXpert MTB/RIF là phương pháp khuếch đại gen nhanh tập trung phát hiện đột biến trên vùng xác định kháng Rifampicin của gen rpoB. Mặc dù có độ nhạy rất cao, kỹ thuật này vẫn có thể bỏ sót các đột biến điểm hiếm gặp nằm ngoài vùng dò hoặc các cơ chế kháng thuốc khác mà phương pháp kháng sinh đồ tỷ lệ trên môi trường đặc có thể phát hiện được.

Kháng sinh đồ Pyrazinamid trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960 có ưu điểm gì vượt trội?
Pyrazinamid chỉ có hoạt tính kháng khuẩn trong môi trường axit yếu, điều kiện rất khó duy trì ổn định trên môi trường thạch đặc truyền thống. Phương pháp lỏng MGIT 960 sử dụng hệ thống bổ sung đặc hiệu và theo dõi huỳnh quang tự động với ngưỡng kháng 100 đơn vị sinh trưởng (GU), giúp rút ngắn thời gian trả kết quả xuống còn 4 đến 21 ngày với độ tin cậy rất cao.

Tình trạng dinh dưỡng và giới tính có mối liên quan như thế nào đến bệnh nhân mắc lao?
Trong nghiên cứu, nam giới chiếm tỷ lệ áp đảo 87,5% ở nhóm lao tái trị và 63,8% ở nhóm lao mới. Chỉ số khối cơ thể (BMI) trung bình của bệnh nhân ở mức thấp (khoảng 18,65 đến 18,91), phản ánh tình trạng thiếu hụt dinh dưỡng và suy nhược thể trạng là những yếu tố nguy cơ phổ biến làm suy giảm miễn dịch và thúc đẩy bệnh lao tiến triển.

Kết luận

• Tỷ lệ kháng thuốc chống lao hàng một ở mức 39,2%, trong đó nhóm lao tái trị ghi nhận tỷ lệ kháng một loại thuốc bất kỳ lên tới 60,7%, cao gấp gần 2,8 lần nhóm lao mới (21,7%).
• Streptomycin (44,6%) và Isoniazid (42,9%) là hai loại kháng sinh có tỷ lệ đề kháng cao nhất trong quần thể bệnh nhân lao phổi tái trị.
• Phát hiện 4,8% bệnh nhân mang vi khuẩn lao đa kháng thuốc (MDR-TB) và 2,4% chủng kháng toàn bộ 5 thuốc hàng một, khẳng định tính cấp thiết của việc duy trì kháng sinh đồ nuôi cấy bên cạnh xét nghiệm nhanh.
• Tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật PCR nhân đoạn gen NAT2 dài 1093 bp và giải trình tự gen, phục vụ hiệu quả cho việc định danh kiểu gen và xác định tốc độ acetyl hóa Isoniazid.
• Đóng góp luận cứ khoa học quan trọng kết hợp giữa vi sinh học và dược lý di truyền học, đặt nền móng cho việc cá thể hóa phác đồ điều trị lao tại Việt Nam.

Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2025 đến 2027, các đơn vị nghiên cứu cần mở rộng cỡ mẫu đa trung tâm và triển khai thử nghiệm lâm sàng điều chỉnh liều Isoniazid dựa trên kiểu gen NAT2. Hãy tải ngay toàn văn luận văn thạc sĩ để nắm bắt chi tiết các quy trình xét nghiệm chuẩn hóa và các phân tích chuyên sâu về dịch tễ vi sinh học vi khuẩn lao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng phức tạp và thời gian điều trị kéo dài. Theo thống kê của WHO (2018), với sự nỗ lực không ngừng của toàn thế giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53 triệu người đã được phát hiện và điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống còn 37%. Mặc dù đã được tập trung kiểm soát, bệnh lao vẫn là một trong 10 nguyên nhân tử vong hàng đầu và là nguyên nhân tử vong số 1 do bệnh truyền nhiễm (trên cả HIV). Việt Nam là một trong những điểm nóng của bệnh lao, đứng thứ 14 trong số 30 nước có gánh nặng cao do lao (WHO, 2018).

Năm 2017, tổng số trường hợp mắc lao được báo cáo ở Việt Nam là 105.733 bệnh nhân trong số đó có khoảng 80% là bệnh nhân lao phổi mới mắc và tái nhiễm. Mặc dù trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc lao đang giảm đi khoảng 2% mỗi năm nhưng đến nay bệnh lao vẫn còn là vấn đề thách thức do sự phát triển và lan rộng của lao kháng thuốc. Bệnh nhân mang lao kháng thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn kém. Ở Việt Nam theo ước tính trung bình chi phí cho một bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao hơn nhiều so với chi phí hơn 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường.

Theo thống kê mới nhất của WHO, trên toàn cầu 3,5% trường hợp lao mới và 18% trường hợp lao tái trị có kháng Rifampicin hoặc đa kháng Rifampicin và Isoniazid (MDR/RR-TB). Ở Việt Nam con số này ước tính tương ứng là 4,1% và 17%. Tuy nhiên đây chỉ là con số ước tính vì chỉ có khoảng 32%-67% được thực hiện đánh giá tính kháng thuốc với Rifampicin (WHO, 2018). Trong các thuốc chống lao hàng một, ngoài Rifampicin và Isoniazid là hai thuốc quan trọng nhất trong các phác đồ điều trị lao còn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid.

Trong những năm gần đây, tình hình kháng thuốc với 3 loại thuốc này ít được quan tâm, báo cáo. Việc chỉ tập trung vào hai thuốc quan trọng nhất là Rifampicin và Isoniazid có thể bỏ qua các biến động đáng chú ý về tình hình kháng thuốc của ba thuốc này. Theo hướng dẫn của WHO cũng như của Bộ Y tế, Isoniazid được dùng trong hầu hết các đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, trong các phác đồ điều trị bệnh nhân lao mới, lao tái trị và kể cả điều trị dự phòng lao. Isoniazid được chuyển hóa bởi Khoa Sinh học 1 Khoá 2016-2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà enzyme NAT2 tại gan.

Đa hình di truyền gen NAT2 được biết đến có liên quan chặt chẽ tới đáp ứng Isoniazid trên các bệnh nhân mắc lao. Nghiên cứu tại Nam Phi cho thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không tuân thủ điều trị mà còn do sự khác biệt về dược động học của thuốc giữa các cá thể. Mặt khác một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền của bệnh nhân cũng có thể là một trong những yếu tố nguy cơ đối với việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao. Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật sự còn là vấn đề hết sức khó khăn tại các bệnh viện, kể cả những bệnh viện tuyến Trung ương.

Chỉ một số lượng nhất định bệnh nhân được chỉ định làm kháng sinh đồ và thời gian này mất khoảng 2-3 tháng mới có kết quả do vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay một số các test phân tử được áp dụng để chẩn đoán nhanh lao kháng thuốc là Hain test hay Xpert MTB/RIF. Tuy nhiên, các xét nghiệm này giá thành khá cao và không được chỉ định rộng rãi. Hơn nữa các kit thương mại này mới chỉ đánh giá được lao kháng Rifampicin, Isoniazid chứ chưa đánh giá được với các thuốc khác trong thuốc kháng lao hàng một.

Từ thực tiễn chẩn đoán và điều trị lao, với mục tiêu xác định được tính kháng thuốc của các thuốc chống lao hàng một và tiên lượng nguy cơ mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến yếu tố di truyền gen NAT2 ở bệnh nhân lao phổi, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng Isoniazid và đánh giá ảnh hƣởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc Isoniazid”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao hàng một trên bệnh nhân lao phổi; Xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi. Khoa Sinh học 2 Khoá 2016-2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về vi khuẩn lao 1.

Hình thể, cấu trúc Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn 169 loài, đa phần không gây bệnh cho người. Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho người được gọi là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có các loài chính như Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti. Trong đó quan trọng nhất là loài Mycobacterium tuberculosis[64]. Mycobacterium được gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert Koch phân lập năm 1882, gọi tắt là BK (Bacille de Koch).

tuberculosis là trực khuẩn thanh mảnh, hơi cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm. Chúng không có vỏ, không có lông và không có nha bào. Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành từng đám nối đầu vào nhau. Thành tế bào của M.

tuberculosis chỉ chứa một lượng nhỏ peptidoglycan, nhưng chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, và làm cho vi khuẩn lao không nhuộm được bằng phương pháp thông thường mà phải nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x Khoa Sinh học 3 Khoá 2016-2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà 1. Khả năng gây bệnh 1. Độc lực và con đường lây truyền Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố.

Độc lực của vi khuẩn lao có thể liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào. Các chủng lao độc lực có chứa nhiều yếu tố sợi có bản chất hóa học là 6,6’-dimycoly trehalose. Yếu tố sợi này làm vi khuẩn lao gắn với nhau thành bó và khi mất đi sẽ làm giảm độc lực. Vi khuẩn lao có thể sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào.

Vi khuẩn lao phát triển trong đại thực bào, phá vỡ tế bào và xâm nhập đại thực bào khác [15]. Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp. Người bị nhiễm lao do hít phải những giọt đờm (đường kính 1 - 5 μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho, hắt hơi vào không khí. Các vi khuẩn khi qua được hàng rào thứ nhất của cơ thể sẽ ở lại phế nang và tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn các trường hợp có triệu chứng không rõ ràng.

Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính hoặc qua nước ối khi chuyển dạ nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Đôi khi, đường lây khác có thể là đường tiêu hóa khi uống sữa bò bị bệnh do M. Từ cơ quan bị lao ban đầu, trực khuẩn lao theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác để gây bệnh (lao hạch, lao mang não lao xương). Tuy nhiên, con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh lao là đường hô hấp [11], [15].

Cơ chế gây bệnh Bệnh lao là một loại bệnh nhiễm trùng bên trong tế bào và tiến triển mạn tính. Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào phế nang sẽ bị các đại thực bào tiêu diệt một phần. Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt sẽ tiếp tục nhân lên trong đại thực bào và dần thành nang lao. Nếu các nang lao vỡ ra vi khuẩn lao lây nhiễm rộng, sinh sản và bệnh lao xuất hiện.

Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao thì một phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở phổi xuất hiện. Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở người có đáp ứng miễn dịch tế bào đầy đủ, sau 4 - 6 tuần lymphokin được sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết Khoa Sinh học 4 Khoá 2016-2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà chết vi khuẩn lao. Cơ thể sinh ra đáp ứng quá mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết quả là hình thành u hạt. Tiếp theo là hoại tử ở trung tâm, bã đậu hoá, xơ hoá và hình thành sẹo.

Sau khi liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao vẫn không bị diệt hoàn toàn. Chúng có thể tồn tại mãi trong cơ thể dưới dạng không hoạt động, những người nhiễm lao thường chỉ biểu hiện ở test tuberculin (+) và không có khả năng lây nhiễm. Ở những người này có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở thành người mắc lao. Ngoài ra các yếu tố nguy cơ đối với việc mắc lao như: tuổi trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố cơ địa - yếu tố gen [11].

Nuôi cấy vi khuẩn lao Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy…. trong đó xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng. Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC và dưới áp suất của oxy là 100 mmHg. Đây là một trong những lý do giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất.

Vi khuẩn lao không nuôi được ở môi trường thông thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1. Khuẩn lạc đƣợc phóng đại b. Khuẩn lạc trên LJ Hình 1.tuberculosis nuôi cấy trên môi trƣờng đặc [24], [60] Khoa Sinh học 5 Khoá 2016-2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ một lần trên môi trường thử nghiệm. Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao mới hình thành khuẩn lạc điển hình.

Khuẩn lạc dạng R, sần sùi như hình hoa lơ.