CHƯƠNG 1 HOẠT CHÁT KHÁNG VI SINH VẬT 1. Hoạt chất kháng khuẩn Penicillin, được phát hiện bới Fleming vào năm 1928, được tiếp tục nghiên cứu hoạt tính bởi Chain và công sự (1940) như một chất hóa trị liệu. Cùng năm đó, Waksman đã bắt đầu sàng lọc các chất kháng khuẩn do xạ khuấn trong đất tạo ra, và phát hiện ra các xạ khuẩn có khá năng sản sinh các hoạt chất chống khối u. Sau khi nhiều loại kháng sinh có tác dụng tốt về mặt lâm sàng như streptomycin, chloramphenicol (Chloromycetin), chlortetracycline (aureomycin), neomycin, oxytetracycline (terramycin), erythromycin,.
được phát hiện, hầu hết các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn dường như đã được giải quyết. Với liệu pháp kháng sinh, các bệnh nhiễm trùng huyết do nhiễm Streptococcus hoặc Staphylococcus hoặc nhiễm trùng đường ruột nặng do vi khuấn Gram âm gây ra đã giảm đáng ke, và tuôi thọ trung binh cùa Mở Hà Nội Tuy nhiên, khoảng 10 nãm sau khi liệu pháp kháng sinh được sử dụng phổ biến trên thế giới, một số loài vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus, Mycobacterium và vi khuấn đường ruột Gram âm đã xuất hiện khá năng kháng lại một số loại thuốc kháng sinh. Sau đó, các chúng vi khuẩn kháng thuốc được sử dụng làm sinh vật thử nghiệm đe phát triển được các loại kháng sinh hữu hiệu mới. Sau khi các cơ chế kháng kháng sinh ờ vi khuấn như biến đổi enzyme, giảm tính thấm của tế bào, hoặc giảm ái lực của ribosome được làm sáng tỏ, nhiều dần xuất cúa kháng sinh đã được nghiên cứu về mặt hóa học hoặc sinh học dựa trên nền tảng các thông tin về cơ chế kháng thuốc.
Các chiến lược về phương pháp sàng lọc kháng sinh hữu ích cũng được điều chỉnh. Các kết quả của những nghiên cứu cơ bản về cơ chế hoạt động cùa kháng sinh đã được áp dụng cho các phương pháp sàng lọc, độc tính chọn 5 lọc của hoạt chất điều trị phải vượt trội hơn các tác dụng phụ. Từ quan điếm này, một số loại kháng sinh yỡ-lactam và chất ức chế sinh tồng hợp thành tế bào vi khuẩn đã được phát hiện bàng các phương pháp sàng lọc khác nhau. Tuy nhiên, tại các bệnh viện vẫn xảy ra vấn đề nhiễm trùng cơ hội của bệnh nhân sau khi mổ, một phần do suy giám miễn dịch chống lại các mầm bệnh khác nhau, ngay cả với những mầm bệnh yếu.
Những bệnh nhiễm trùng cơ hội chú yếu do các vi khuẩn Gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus sp. và Serratia marcescens gây ra. Ngày nay, một số những nỗ lực to lớn trong việc tạo ra các loại kháng sinh kháng khuấn mới đã được thực hiện, chúng vượt trội hơn về độc tính chọn lọc, về đặc tính dược động học và trong điều trị các bệnh nhiễm trùng phức tạp gồm cả những bệnh nhiễm trùng cơ hội. Để khám phá ra những loại kháng sinh mới có hiệu quả, có hai đối tượng cần được nghiên cứu mà không thế bị tách rời.
Một là "phát hiện" các chất chuyền hóa và hai là "sân xuất" các chất chuyển hóa có hoạt tính, vấn đề đầu tiên bao gồm cách phát hiện ra các vi sinh vật mới và cách để các vi sinh vật sán xuất ra các chất chuyến hóa mới khác nhau, vấn đề thứ hai là cần phát hiện hiệu lực và hiệu quả các hoạt tính của các chất chuyển hóa. Các phương pháp sàng lọc hoạt chất kháng khuân được điều chinh phù hợp với các các đặc điểm gây bệnh của các tác nhân vi sinh vật và cơ chế hoạt động của kháng sinh. Theo truyền thống, các hoạt tính kháng khuẩn được phát hiện bằng phương pháp khuếch tán trên thạch sứ dụng một số chủng vi khuấn gram dương và gram âm làm sinh vật thừ nghiệm. Từ những năm 1970, các phương pháp này đã được thay thế thành công bằng cách phát hiện dựa trên các thay đổi hình thái của các sinh vật thử nghiệm, sử dụng các thế đột biến siêu nhạy, ức chế hoạt tính enzyme cùa vi khuấn, hoặc ứng dụng các kháng thể đơn dòng trong thử nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme.
6 Phương pháp thử nghiệm khuếch tán thạch sử dụng một số vi khuẩn làm sinh vật thử nghiệm là giải pháp đơn giản và dỗ sử dụng trong việc sàng lọc các loài vi sinh vật sán sinh các hoạt chất có hoạt tính kháng khuấn. Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế trong việc xác định một chất hoặc các nhóm chất có cùng hoạt tính kháng khuẩn trong một mẫu vi khuẩn mục tiêu. Hiện nay, công nghệ sinh học hiện đại đã cho phép sử dụng nhiều phương pháp đế sàng lọc hiệu quá các hoạt chất kháng khuấn. Sử dụng các thể đột biến kháng kháng sinh Sự phát triển của các tác nhân gây bệnh có khả năng kháng kháng sinh đã thúc đay các nỗ lực tìm kiếm các loại thuốc kháng sinh mới có hoạt tính chống lại các vi khuân kháng thuốc.
Theo đó, các thể đột biến kháng thuốc được sừ dụng trong các quy trình sàng lọc các chùng kháng thuốc theo cơ chế ức chế enzyme hoặc ức chế các hệ thống vận chuyền qua màng tế bào. Trong các quy trình sàng lọc gần đây, để tim ra kháng sinh mới ngiowf ta đã sử dụng chủng đột biến kháng kháng sinh Staphylococcus aureus 4R (có nguồn gốc từ chủng s. aureus FDA 209P), chủng này có đặc điểm đột biến kháng tetracycline, erythromycin, chloramphenicol và streptomycin. Đe tìm ra kháng sinh mới nhạy cảm với chùng Staphylococcus aureus 4R, khoảng 2.000 chủng xạ khuẩn đã được sử dụng, từ đó phát hiện loại kháng sinh có bán chất dipeptide có tên là alahopcin.
Thuốc kháng sinh này được cho là chất ức chế tống hợp thành tế bào vi khuấn, vì nó ức chế sự liên kết của axit [3H] diaminopimelic trong Escherichia coli. Alahopcin cũng cho thấy khả năng liên kết với erythromycin chống lại vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là các loài vi khuấn kháng macrolid. Trong một quy trình sàng lọc khác đế phát hiện ra các kháng sinh có bản chất oligopeptide, chủng đột biến kháng thuốc là Bacillus suhtilis SRY-7 đã được sử dụng làm vi sinh vật thử nghiệm. Sử dụng chủng vi sinh vật đột biến siêu nhạy vói kháng sinh 7 Để trực tiếp phát hiện một lượng nhó kháng sinh được tạo ra trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuếch tán thạch truyền thống, người ta đã sử dụng một the đột biến siêu nhạy của một sinh vật thử nghiệm thông thường.
Trong phần lớn các nghiên cứu sàng lọc hoạt chất kháng khuẩn, các chủng đột biến nhạy với nhiều loại thuốc thường được sử dụng, tuy nhiên, trong các trường họp đặc biệt, với lượng nhó kháng sinh được tạo ra thi các chùng đột biến siêu nhạy với một loại kháng sinh cụ thề được ưu tiên nghiên cứu sứ dụng. Kháng sinh mới pyrrole-amidine TAN-868 A có hoạt tính chống lại vi khuẩn, nấm và động vật nguyên sinh có nguồn gốc từ xạ khưấn Streptomyces idiomorphus đã được phát hiện thông qua chúng vi khuấn Micrococcus flavus siêu nhạy. Sử dụng vi khuẩn kỵ khí và thủ' nghiệm trong điều kiện kỵ khí Các bệnh nhiễm trùng cơ hội do một số vi khuân kỵ khí có khả năng gây tý lệ từ vong cao. Đổ tìm kiếm các kháng sinh mới chống lại các vi khuẩn kỵ khí, các loài Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Peptococcus, các vi khuấn kỵ khí khác được sử dụng làm sinh vật thử nghiệm.
Một trong số đó là Clostridium difficile, tác nhân gây bệnh chính gây bệnh viêm đại tràng màng giả là loài vi khuấn kỵ khí nghiêm ngặt. Để nuôi cấy Clostridium difficile, đĩa thạch hai lóp được chuẩn bị, trong đó, vi khuẩn được cấy ở bề mặt cúa lớp thạch bên dưới và lóp thạch phía trên có vai trò ngăn oxy và cung cấp chất dinh dưỡng. Bằng phương pháp này, một số kháng sinh thiotetromycin, luminamicin, lustromycin, và closetomicin A, B|, B2, c, và D đã được tìm thấy. Từ những năm 1987- 1988, một số nhà khoa học đã mô tá phương pháp việc phát hiện abbeymycin, coloradocin (luminamicin), tirandalydigin bằng kỹ thuật nuôi yếm khí.
Người ta thay rằng hoạt tính kháng khuẩn của fosfomycin trong điều kiện kỵ khí mạnh hơn trong điều kiện hiếu khí, dựa trên thực tế này, việc sàng lọc các kháng sinh có hoạt tính mạnh hơn trong điều kiện kỵ khí được ưu tiên hơn so với trong điều kiện hiếu khí. Trong số 8 một vài các kháng sinh được lựa chọn trong hệ thống sàng lọc này, một kháng sinh mới SF-2312, axit l,5-dihydroxy-2-oxopyrrolidin-3-yl-phosphonic đã được tìm thấy. Phát hiện khả năng liên họp Trong lĩnh vực lâm sàng, việc sử dụng kết hợp hai hoặc nhiều các hoạt chất kháng khuẩn đề điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn nghiêm trọng là cần thiết. Cách tiếp cận này dựa trên cơ sở là các hoạt chất có the hoạt động phối hợp với nhau trong cơ thể sống (in vivo).
Thử nghiệm sàng lọc các kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuấn chống lại vi khuẩn E. coli khi được thử nghiệm cùng với spiramycin- một loại kháng sinh không có hiệu quả trong việc chống lại vi khuan gram âm. Hoạt chất kháng khuẩn trong dịch lên men các chủng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa giấy sử dụng vi khuẩn E. coli ATCC 26 làm sinh vật thử nghiệm, liều của spiramycin là 40 pg/ml.
Nghiên cứu này đã phát hiện được một loại kháng sinh mới ký hiệu là CV-1. Mặc dù hoạt tinh kháng khuấn của CV-1 rất yếu, nhưng nó cho tác dụng chống lại vi khuẩn E. coli khi kết hợp với spiramycin. CV-1 có công thức là 1,2-diamino-l, 2-N, N'-carbonyl-l, 2-didcoxy-a-D- glucose hydrat dường như hoạt động theo cơ chế sự ức chế tổng hợp lipopolysaccharide.
Lipopolysaccharide màng của vi khuẩn có vai trò như một hàng rào vận chuyển, sự kết hợp của CV-1 với màng này dường như tạo khả năng xâm nhập cùa spiramycin vào các tế bào của vi khuẩn E. coli và tiêu diệt chúng. Thú' nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết vói enzyme và miễn dịch phóng xạ Các thử nghiệm miền dịch với nhiều loại khác nhau đã được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm lâm sàng đế phát hiện và phân tích định lượng các kháng thể, hormones và thuốc trong dịch cơ thế. Trong các phòng thí nghiệm vi sinh hoặc nông nghiệp, các thí nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) đã được áp dụng đế phát hiện và định lượng nhanh 9 các độc tố nấm mốc.
Một số nghiên cứu đã thực hiện phát triển ELISA đế phát hiện kháng sinh aminoglycoside trong các sinh khối lên men các chủng vi sinh vật, các kháng sinh dần xuất của erythromycin, hoạt chất chống nấm da được phát hiện bàng kỹ thuật này.1 Xác định các kháng sinh đã biết Việc phát hiện ra các kháng sinh mới ngày càng trở nên khó khăn hon, nên các thử nghiệm cần phái tăng độ nhạy với thời gian thử nghiệm ngắn hon.