CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU Trong những thập niên gần đây, thế giới luôn cảnh báo về nguồn nhiên liệu hóa thạch đang dan cạn kiệt. Trước tình hình đó, con người càng quan tâm đến những nguồn năng lượng mới, đặc biệt là nhiên liệu sinh học. Tiêu biểu nhất là sử dụng vi sinh vật để sản xuất ethanol từ các nguồn sinh khối lignocellulose rẻ tiền và phố biến ở khắp moi nơi.
Tuy nhiên, quá trình xử lý sinh khối trong quy trình sản xuất ethanol sẽ tạo nên những thành phần không mong muốn cho quá trình lên men tiếp theo, cụ thể là sự hình thành các acid yếu (acid acetic, acid formic, acid levulinic), furfural, 5-hydroxymethyl-2-furfural và các hợp chat phenolic. Những hop chat nay ức chế nắm men giống làm cho thời gian lên men kéo dai và nông độ ethanol thu được trong dung dịch lên men bị giảm, từ đó làm tăng giá thành sản phẩm (Orts và cộng sự, 2008). Acid acetic được xem là một chất ức chế nắm men mạnh mẽ. Các nghiên cứu VỀ CƠ chế gây độc của acid acetic với nắm men đã được khảo sát (Giannattasio và cộng su, 2013).
Acid acetic có thé khuếch tán qua mang tế bao va gây ra su acid hóa tế bao chất làm vô hoạt enzyme, kết quả là tế bào sẽ bị thiếu năng lượng để duy trì hoạt động trao đôi chất (Kitanovic và cộng sự, 2012). Acid acetic còn gây ra sự tích tụ các phân tử hóa hoc chứa oxy có kha năng phản ứng (Reactive oxygen speicies) có thé gây stress oxy hóa cho tế bảo, thậm chi gây chết cho tế bảo (Giannattasio va cộng sự, 2013). Dé sản xuất ethanol ở quy mô công nghiệp từ nguồn sinh khói lignocellulose, việc phát triển các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hoặc chịu được chất ức chế nông độ cao sau quá trình tiền xử lý nguyên liệu thực vật đã trở thành điều kiện tiên quyết (Persson và cộng sự, 2002). Một trong những giải pháp được đưa ra là cô định tế bao trong chất mang.
Khi đó chất mang sẽ “bảo vệ” tế bảo và làm tăng khả năng chịu ức chế của tế bào khi môi trường lên men có các chất ức chế (Taherzadeh và cộng sự, 2001). Trong số các phương pháp cố định khác nhau, bao gói tế bào được xem là một phương pháp đầy hứa hẹn vì có nhiều ưu điểm so với các phương pháp có định khác (Park và cộng sự, 2000). Kluyveromyces marxianus là một loài nam men được nghiên cứu nhiều trong thời gian gần đây dé lên men ethanol do có khả năng lên men được nhiều loại đường khác nhau, chịu được nhiệt độ cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Tuy nhiên, ảnh hưởng của acid acetic đến quá trình lên men ethanol bởi tế bào K.
marxianus tự do và cỗ định đến nay vẫn chưa được công bô. Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát khả năng sinh trưởng và lên men ethanol của nam men Kluyveromyces marxianus cô định trong môi trường có chứa acid acetic. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiép theo đê có thê sử dụng K. marxianus cô định trong sản xuất ethanol ở quy mô công nghiệp.
Nam men Kluyverromyces marxianus 2. Đặc điểm sinh học Đến nay đã có khá nhiều kết quả nghiên cứu liên quan đến Kiyverromyces marxianus được công bỗ. Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu này thường tập trung vào mục tiêu chính là các ứng dụng K. marxianus trong công nghiệp mà không chú trọng vào các nghiên cứu về đặc tính sinh lý cũng như quá trình trao đôi chất ở mức độ tế bào của chúng.
Hau như các đặc điểm sinh học tế bào của K. marxianus đều được suy đoán từ một họ hàng gần phổ biến của chúng là K/zyverromyces lactis (Lane và cộng sự, 2010) (Hình 2. Lactose Glucose Maximum assimilation Inulinase lừng fermentation temperature Saccharomyces cerevisiae - - 0.37 + 35'C Kluyveromyces aestaurii - - nla + 35°C Kluyveromyces nonfermenians - - nia - 42°C Kluyveromyces wikerhamii - - 0.60 + 52°C Kluyveromyces dobzhanskii - - nia + 35°C Hình 2. Mối liên hệ giữa Kluyveromyces marxianus va Kluyveromyces lactis (Lane va cong su, 2010) Gozalez — Siso và cộng sự (2000) cho răng K.
marxianus là một loài nam men lên men ethanol ki khí điển hình. Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận K. marxianus có khả năng sử dụng các loại đường khác nhau như xylose, glucose, fructose, saccharose, maltose, lactose, cellobiose (Christensen và cộng sự, 2010; Fonseca va cộng sự, 1991; Fonseca va cộng su, 2007). Thậm chi, trong một số nghiên cứu các tác giả con cho thay K.
marxianus còn có 3 khả năng lên men lactose với nồng độ đường rat cao có thé lên đến 200 g/L (Hoang va cộng sự, 2013). Bên cạnh đó, khả năng lên men ethanol ở nhiệt độ cao của K. marxianus là một ưu điểm nổi bật so với loài nam men lên men ethanol phố biến hiện nay là Saccharomyces cerevisiae. Hầu hết các nghiên cứu cho thay K.
marxianus có khả năng lên men tốt trong khoảng nhiệt độ từ 37°C đến 42°C và có thể tồn tại ở khoảng nhiệt độ 45°C — 52°C (Lane và cộng su, 2010 - 2011; Hoang và cộng sự, 2013; Fonseca và cộng sự, 2008; Christensen và cộng sự, 2010). Một điều cần lưu ý về khả năng sinh trưởng của K. marxianus là sự khác nhau đáng kế về các thông số tăng trưởng của chúng như tốc độ sinh trưởng riêng cực đại (max) và tốc độ sinh trưởng trung bình giữa những chủng khác nhau trong cùng một loài hay thậm chí là cùng một chủng nhưng được kiểm tra trong những điều kiện thực hiện thí nghiệm khác nhau (Fonseca G. và cộng sự, 2007).
Tuy nhiên, các nghiên cứu đều kết luận K. marxianus có thời gian thé hệ tương đối ngắn vả chi xap xi 70 phút (Fonseca và cộng sự, 2007) 2. Khả năng ứng dụng của Kluyverromyces marxianus cỗ định trong quá trình lên men ethanol Với các đặc điểm sinh học lý tưởng cho qua trình lên men ethanol, đặc biệt là qua trình lên men ethanol từ nguồn sinh khối lignocellulose, K. marxianus trở thành loài nam men được quan tâm hàng đầu trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng (Bảng 2.
Tuy nhiên, việc sử dụng trực tiếp tế bào K. marxianus tự do để lên men sinh khối lignocellulose có nhiều bat lợi vì thành phan môi trường có nhiều hợp chất có khả năng ức chế nam men. Vì vậy, nhiều giải pháp đã được đưa ra nhằm cải thiện kha năng lên men của nam men trong quy trình sản xuất ethanol từ lignocellulose. Các giải pháp phô biến là cải tạo gen của nam men, loại bỏ độc tố trong môi trường lên men và cố định tế bao nam men.
Đến nay, các nghiên cứu về sử dụng tế bào K. marxianus cỗ định để lên men ethanol từ lignocellulose vần còn hạn chê. Một số nghiên cứu ứng dụng K/uyveromyces marxianus dé lên men ethanol từ các nguồn sinh khối lignocellulose : Hàm Nguon „ „ Nhiệt độ Giông nam Phương lượng sinh lên men Tác giả , men phap ethanol khoi (°C) (g/ L) Vỏquả Kluyveromyces Lên men 15 37 Mark và cộng cam marxianus trực tiép su, 2007 Kluyveromyces Lén men „ Lina và cộng Bun giây marxianus SSF va 40 38 sự, 2010. ATCC 36907 SHF Kluyveromyces Lén men Rom lua Antonio va marxianus SSF va 16.7 42 mì cộng sự, 2013 CECT 10875 PSSF Co dinh Lua Kluyveromyces „ trong natri- Kanchana và miền marxianus 81.56 40 alginate va cong su, 2015 ngot DBKKUY-103 polyvinyl Nachaiwieng , Kluyveromyces Lén men Vo trau 15.63 43 va cộng sự, marxianus CKS& SSF 2015 Vo Lén men Kluyveromyces Wei va cong khoai SSF va 48.98 40 marxianus K2] sự 2016 môn SHF Thủy phân Kluyveromyces ` và lên men Emanuel và Bã điều marxianus ` 58 40 dong thoi cong su, 2017 ATCC36907 (SSF) Y.
Kourkoutasa va cộng sự (2004) cho rang quá trình cô định nắm men trên chất mang sẽ mang lại những ưu điềm: - Kéo dai và 6n định hoạt động của các chất xúc tác sinh học. Chất mang đóng vai trò bảo vệ tế bào nắm men tránh khỏi các tác động tiêu cực của môi trường bên ngoài như pH thấp, nhiệt độ cao, môi trường có chứa các chất ức chế nắm men,. - _ Mật độ tế bào trong môi trường lên men cao hơn dẫn đến năng suất sản phẩm cao hơn, thời gian lên men ngắn hơn, rút ngắn pha sinh trưởng của tế bào. - Tang khả năng sử dụng cơ chất và hiệu suất sinh tong hop sản phẩm.
- Tang tính liên tục của quá trình sản xuất nhờ vào kha năng tái sử dụng nhiều lần. - Tang khả năng sử dụng cơ chất trong môi trường nông độ cơ chất cao và giảm sự ức ché của sản phẩm lên tế bảo. - Tang tính khả thi của quá trình lên men ở nhiệt độ thấp. - Dé thu hồi sản phẩm hơn do không cần phải ly tâm hoặc vi lọc dé tách tế bào ra khỏi dịch lên men, làm giảm năng lượng và chỉ phí thiết bị.
Một số loại chất mang đã được nghiên cứu để cỗ định K. marxianus và thu được hiệu quả tích cực như: alginate, agar (Guo và cộng sự, 2010; Christensen và cộng sự, 2011), be lá dừa nước (Vu và cộng sự, 2016), gelatin (Puri và cộng sự, 2010). Guo và cộng sự (2010) báo cáo rằng K. marxianus cô định trên alginate cho hàm lượng ethanol cuối cao hơn nam men tự do 1.
Nhìn chung, các nghiên cứu nói trên khi tiễn hành so sánh nắm men K. marxianus cỗ định và tự do đều kết luận rằng nắm men cô định cho kết quả lên men tốt hơn nắm men tự do. Một số nghiên cứu khác cũng đánh giá cao khả năng lên men của K. marxianus cô định khi sử dụng các phương pháp lên men khác nhau như lên men chu kỳ, lên men chu kỳ sử dụng nồng độ cơ chất cao, lên men chu kỳ có bổ sung cơ chất và lên men liên tục (Christensen và cộng sự, 2011; Taherzadeh và cộng sự, 2001; Behera và cộng sự, 2010).
So sánh khả năng lên men cua nam men Kluyveromyces marxianus tự do va cô định, sử dụng dịch whey phomai làm môi trường lên men (Guo và cộng sự, 2010) Thông số đánh giá Nam men tự do Nam men cô định Hàm lượng ethanol cuối (% v/v) 3. Hàm lượng đường sót (g/100 mL) 0.32 Tốc độ sinh tong hop ethanol (g/ L.68 Tốc độ sử dụng đường (g/ L.00 Lượng ethanol thực té/ lượng ethanol lý „ 58. Sự hình thành acid acetic trong quá trình tiền xử lý lignocellulose Quá trình tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose nhằm loại bỏ lignin, phá hủy cấu trúc tỉnh thể của cellulose và tăng độ xốp của nguyên liệu. Khi đó, các phân tử polysaccharide sẽ được giải phóng ra ở dạng riêng lẻ và dễ dàng tạo phức với các phân tử enzyme thủy phân để chuyền hóa thành các đường lên men.