Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh Kháng Nấm Gây Bệnh Trên Cây Hồ Tiêu Ở Đắk Lắk

Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hoàn
• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Gia Hy
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh Kháng Nấm Gây Bệnh Trên Cây Hồ Tiêu Ở Đắk Lắk
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU
• 1.1.1. Cây hồ tiêu và tiềm năng phát triển cây hồ tiêu ở Việt Nam
• 1.1.2. Hiện trạng canh tác trồng cây hồ tiêu ở Đăk Lăk
• 1.1.3. Bệnh cây và ảnh hưởng của bệnh nấm đối với cây trồng
• 1.1.4. Khả năng đối kháng của các vi sinh vật đối với nấm gây bệnh thực vật
• 1.2. VI SINH VẬT NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
• 1.2.1. Vi sinh vật nội sinh (endophylic microorganisms) trên cây hồ tiêu
• 1.2.2. Sự đa dạng vi sinh vật nội sinh năng kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu
• 1.2.3. Khả năng ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng chống nấm gây bệnh cây hồ tiêu
• 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM
• 1.3.1. Nghiên cứu bệnh gây hại trên cây hồ tiêu
• 1.3.2. Biện pháp phòng trừ bệnh cây hồ tiêu bằng biện pháp sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 2.1.1. Các mẫu cây hồ tiêu và chủng giống vi sinh vật kiểm định
• 2.1.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.1.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp thu mẫu
• 2.2.2. Khử trùng bề mặt và phân lập vi sinh vật nội sinh
• 2.2.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh
• 2.2.4. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật nội sinh với nấm bệnh
• 2.2.5. Xác định khả năng ức chế nấm bệnh của dịch lọc vi sinh vật nội sinh
• 2.2.6. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh
• 2.2.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng lựa chọn
• 2.2.8. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 2.2.9. Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp
• 2.2.10. Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici
• 2.2.11. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK
• 3.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ các mẫu cây hồ tiêu
• 3.1.2. Sơ bộ phân nhóm vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu phân lập được
• 3.1.3. Phân bố vi sinh vật nội sinh theo môi trường phân lập
• 3.1.4. Khả năng đối kháng với nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu của các nhóm vi sinh vật phân lập được
• 3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG DIỆT NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU CAO Ở ĐẮK LẮK
• 3.2.1. Hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk
• 3.2.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk
• 3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN LOẠI VÀ AN TOÀN SINH HỌC CỦA CHỦNG HDL34
• 3.3.1. Đặc điểm sinh học
• 3.3.2. Phân loại chủng HDL34 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 3.3.3. Độ an toàn sinh học của chủng HDL34
• 3.4. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG CHỦNG HDL34
• 3.4.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng chủng HDL34
• 3.4.2. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của chủng HDL34 ở quy mô phòng thí nghiệm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Nội Sinh Kháng Nấm Hồ Tiêu

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk là một hướng đi đầy tiềm năng trong nông nghiệp bền vững. Hồ tiêu là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nhưng thường xuyên đối mặt với các bệnh do nấm gây bệnh, đặc biệt là bệnh chết nhanh và chết chậm. Việc sử dụng biện pháp sinh học để phòng trừ bệnh hại đang trở thành xu hướng tất yếu, nhằm giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc hóa học và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, định danh và đánh giá khả năng kháng nấm của các vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk, từ đó mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm sinh học hiệu quả.

1.1. Tiềm Năng Phát Triển Cây Hồ Tiêu và Thách Thức Bệnh Hại

Cây hồ tiêu được mệnh danh là "vua gia vị", mang lại giá trị xuất khẩu cao cho Việt Nam. Tuy nhiên, việc canh tác hồ tiêu đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là tình trạng bệnh hại do nấm gây bệnh, như nấm Fusarium và nấm Phytophthora. Theo thống kê, bệnh chết nhanh và chết chậm là những vấn đề nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại lớn cho người trồng. Việc tìm kiếm các giải pháp bảo vệ thực vật hiệu quả và thân thiện với môi trường là vô cùng cấp thiết.

1.2. Vai Trò Của Vi Sinh Vật Nội Sinh Trong Bảo Vệ Hồ Tiêu

Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong mô cây hồ tiêu mà không gây hại. Chúng có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, sản xuất chất kháng nấm, hoặc kích thích hệ miễn dịch của cây. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật nội sinh và khả năng kháng nấm của chúng là cơ sở để phát triển các biện pháp sinh học hiệu quả trong phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu.

II. Vấn Đề Bệnh Nấm Gây Hại Hồ Tiêu Ở Đắk Lắk Giải Pháp

Tình trạng bệnh nấm gây hại trên cây hồ tiêu ở Đắk Lắk đang là một vấn đề nhức nhối, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và thu nhập của nông dân. Các bệnh như chết nhanh, chết chậm do nấm Fusarium và nấm Phytophthora gây ra đang lan rộng, đe dọa sự phát triển bền vững của ngành hồ tiêu. Việc sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh hại không chỉ tốn kém mà còn gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế, đặc biệt là sử dụng vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm, là vô cùng quan trọng.

2.1. Thực Trạng Sử Dụng Thuốc Hóa Học và Hậu Quả Tiêu Cực

Việc lạm dụng thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu không chỉ gây ra tình trạng kháng thuốc của nấm bệnh mà còn ảnh hưởng đến hệ sinh thái đất, làm suy giảm đa dạng vi sinh vật có lợi. Ngoài ra, dư lượng thuốc hóa học trong sản phẩm hồ tiêu có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và làm giảm giá trị xuất khẩu. Cần có những giải pháp kiểm soát sinh học để giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc hóa học.

2.2. Nhu Cầu Cấp Thiết Về Biện Pháp Sinh Học An Toàn Hiệu Quả

Trước những thách thức đặt ra, việc nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu là vô cùng cần thiết. Sử dụng vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm là một giải pháp tiềm năng, vừa an toàn cho môi trường, vừa hiệu quả trong việc kiểm soát sinh học các nấm gây bệnh. Điều này góp phần vào sự phát triển nông nghiệp bền vững và nâng cao giá trị sản phẩm hồ tiêu.

III. Phương Pháp Phân Lập Định Danh Vi Sinh Vật Nội Sinh Kháng Nấm

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp nghiên cứu khoa học hiện đại để phân lập vi sinh vật, định danh vi sinh vật và đánh giá khả năng kháng nấm của chúng. Các mẫu cây hồ tiêu được thu thập từ các vùng trồng hồ tiêu khác nhau ở Đắk Lắk. Sau đó, các vi sinh vật nội sinh được phân lập từ rễ, thân và lá của cây. Các chủng vi sinh vật được định danh bằng phương pháp phân tích gen, sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. Khả năng kháng nấm của các chủng vi sinh vật được đánh giá thông qua các thử nghiệm đối kháng trong phòng thí nghiệm (nghiên cứu in vitro).

3.1. Quy Trình Thu Mẫu Phân Lập Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Hồ Tiêu

Quy trình thu mẫu cây hồ tiêu được thực hiện theo phương pháp khoa học, đảm bảo tính đại diện và khách quan. Các mẫu được thu thập từ nhiều vườn hồ tiêu khác nhau ở Đắk Lắk, bao gồm cả cây khỏe mạnh và cây bị bệnh. Quá trình phân lập vi sinh vật được thực hiện cẩn thận, sử dụng các môi trường nuôi cấy chọn lọc để thu được các chủng vi sinh vật nội sinh đa dạng.

3.2. Kỹ Thuật PCR Giải Trình Tự Gen Trong Định Danh Vi Sinh Vật

Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen là những công cụ mạnh mẽ trong việc định danh vi sinh vật. Bằng cách khuếch đại và phân tích gen 16S rDNA, các nhà khoa học có thể xác định chính xác loài của vi sinh vật và so sánh chúng với các loài đã biết trong cơ sở dữ liệu gen. Điều này giúp xác định đa dạng vi sinh vật và tìm ra những chủng có tiềm năng kháng nấm.

3.3. Thử Nghiệm Đối Kháng In Vitro Đánh Giá Hiệu Quả Kháng Nấm

Thử nghiệm đối kháng in vitro là phương pháp quan trọng để đánh giá khả năng kháng nấm của các chủng vi sinh vật nội sinh. Trong thử nghiệm, các chủng vi sinh vật được cấy chung với các nấm gây bệnh trên môi trường thạch. Nếu vi sinh vật có khả năng kháng nấm, chúng sẽ ức chế sự phát triển của nấm bệnh, tạo ra vùng ức chế xung quanh khuẩn lạc.

IV. Kết Quả Phân Lập Được Chủng Vi Sinh Vật Nội Sinh HDL34 Tiềm Năng

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và định danh một số chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu. Trong đó, chủng HDL34 cho thấy tiềm năng lớn nhất, với khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm Fusarium và nấm Phytophthora trong các thử nghiệm in vitro. Chủng HDL34 được xác định là thuộc chi Bacillus, một chi vi sinh vật có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp. Nghiên cứu sâu hơn về chủng HDL34 có thể mở ra cơ hội phát triển sản phẩm sinh học hiệu quả để phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu.

4.1. Đặc Điểm Sinh Học Phân Loại Chủng Vi Sinh Vật HDL34

Chủng vi sinh vật HDL34 có đặc điểm sinh học phù hợp cho việc ứng dụng trong nông nghiệp. Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau, sản xuất enzyme ngoại bào và chất kháng nấm. Kết quả phân tích gen cho thấy chủng HDL34 thuộc chi Bacillus, một chi vi sinh vật có nhiều loài có khả năng kiểm soát sinh học các nấm gây bệnh.

4.2. Khả Năng Kháng Nấm Fusarium Phytophthora Của HDL34

Các thử nghiệm in vitro cho thấy chủng HDL34 có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm Fusarium và nấm Phytophthora, hai loại nấm chính gây bệnh trên cây hồ tiêu. Vùng ức chế xung quanh khuẩn lạc HDL34 lớn hơn so với các chủng vi sinh vật khác, cho thấy tiềm năng kháng nấm vượt trội của chủng này.

4.3. Nghiên Cứu Điều Kiện Nuôi Cấy Tối Ưu Cho Chủng HDL34

Để tối ưu hóa khả năng sản xuất chất kháng nấm của chủng HDL34, cần nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp, bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ, pH và độ thông khí. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất sản phẩm sinh học từ chủng HDL34 với hiệu quả cao nhất.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Phát Triển Sản Phẩm Sinh Học Từ HDL34

Việc phát triển sản phẩm sinh học từ chủng vi sinh vật HDL34 có tiềm năng lớn trong việc phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu. Sản phẩm có thể được sử dụng để xử lý đất, ngâm rễ, hoặc phun lên lá cây. Các thử nghiệm in vivo cần được thực hiện để đánh giá hiệu quả của sản phẩm trong điều kiện thực tế. Nếu thành công, sản phẩm có thể được thương mại hóa và cung cấp cho nông dân, góp phần vào sự phát triển nông nghiệp bền vững ở Đắk Lắk.

5.1. Thử Nghiệm In Vivo Đánh Giá Hiệu Quả Phòng Bệnh Trên Hồ Tiêu

Thử nghiệm in vivo là bước quan trọng để đánh giá hiệu quả thực tế của chủng HDL34 trong việc phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu. Các thử nghiệm cần được thực hiện trong điều kiện nhà kính và ngoài đồng ruộng, với các phương pháp ứng dụng khác nhau để tìm ra phương pháp hiệu quả nhất.

5.2. Quy Trình Sản Xuất Đóng Gói Sản Phẩm Sinh Học HDL34

Để thương mại hóa chủng HDL34, cần xây dựng quy trình sản xuất và đóng gói sản phẩm sinh học đảm bảo chất lượng và ổn định. Quy trình cần tuân thủ các tiêu chuẩn về an toàn sinh học và bảo vệ môi trường. Sản phẩm cần được đóng gói cẩn thận để bảo quản vi sinh vật trong thời gian dài.

5.3. Hợp Tác Với Nông Dân Doanh Nghiệp Nông Nghiệp Để Ứng Dụng

Để ứng dụng thực tiễn sản phẩm sinh học HDL34, cần có sự hợp tác chặt chẽ giữa các nhà khoa học, nông dân và doanh nghiệp nông nghiệp. Nông dân cần được hướng dẫn về cách sử dụng sản phẩm hiệu quả, và doanh nghiệp cần đảm bảo cung cấp sản phẩm chất lượng với giá cả hợp lý.

VI. Kết Luận Vi Sinh Vật Nội Sinh Giải Pháp Bền Vững Cho Hồ Tiêu

Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk đã mở ra một hướng đi đầy hứa hẹn cho nông nghiệp bền vững. Việc phân lập và định danh chủng HDL34, một chủng Bacillus có khả năng ức chế mạnh mẽ nấm Fusarium và nấm Phytophthora, là một thành công quan trọng. Nghiên cứu sâu hơn về chủng HDL34 và phát triển sản phẩm sinh học từ chủng này có thể giúp nông dân giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc hóa học, bảo vệ môi trường và nâng cao giá trị sản phẩm hồ tiêu.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Ý Nghĩa Khoa Học

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của vi sinh vật nội sinh trong việc kiểm soát sinh học các nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển sản phẩm sinh học an toàn và hiệu quả, góp phần vào sự phát triển nông nghiệp bền vững.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Phát Triển Sản Phẩm

Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng HDL34, đánh giá hiệu quả của sản phẩm sinh học trong điều kiện thực tế, và nghiên cứu cơ chế kháng nấm của chủng HDL34. Ngoài ra, cần nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu để tìm ra những chủng có tiềm năng hơn nữa.

6.3. Kiến Nghị Để Ứng Dụng Rộng Rãi Biện Pháp Sinh Học

Để ứng dụng rộng rãi biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại trên cây hồ tiêu, cần có sự hỗ trợ từ các cơ quan quản lý nhà nước, các viện nghiên cứu, các doanh nghiệp và nông dân. Cần xây dựng chính sách khuyến khích sử dụng sản phẩm sinh học, đào tạo nông dân về kỹ thuật canh tác hồ tiêu bền vững, và tạo điều kiện cho các doanh nghiệp phát triển sản phẩm sinh học chất lượng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) được xem là "vua gia vị" với giá trị kinh tế và xuất khẩu cao, đặc biệt tại Việt Nam, nơi diện tích trồng hồ tiêu đạt khoảng 100.000 ha, tập trung chủ yếu ở Tây Nguyên. Mặc dù diện tích chỉ chiếm khoảng 2,5% tổng diện tích cây công nghiệp lâu năm, giá trị xuất khẩu đạt khoảng 7.000 USD/ha, vượt trội so với nhiều cây công nghiệp khác như cà phê, chè, điều và cao su. Tuy nhiên, cây hồ tiêu đang đối mặt với thách thức lớn từ các bệnh nấm gây hại, đặc biệt là bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora và bệnh chết chậm do sự kết hợp của nấm Fusarium và tuyến trùng Meloidogyne. Những bệnh này gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và chất lượng sản phẩm, làm giảm tuổi thọ vườn tiêu và ảnh hưởng đến thu nhập của nông dân.

Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập, đánh giá sự đa dạng và tuyển chọn các chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk, từ đó phát triển các giải pháp sinh học thay thế thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh. Nghiên cứu tập trung vào các mẫu rễ, thân và lá thu thập tại huyện Cư Kuin, Đắk Lắk trong năm 2017, với phạm vi nghiên cứu bao gồm phân lập vi sinh vật nội sinh, đánh giá hoạt tính kháng nấm, đặc điểm sinh học và thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây hồ tiêu. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuất hồ tiêu tại vùng Tây Nguyên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms), được định nghĩa là các vi sinh vật sinh trưởng trong mô tế bào thực vật mà không gây hại cho cây chủ. Vi sinh vật nội sinh có khả năng kích thích tăng trưởng, tăng cường miễn dịch và sản sinh các hợp chất kháng nấm, góp phần bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh. Lý thuyết về đối kháng sinh học (biocontrol) được áp dụng, trong đó vi sinh vật đối kháng được sử dụng để ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh như Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani.

Mô hình nghiên cứu tập trung vào việc phân lập vi sinh vật nội sinh từ các bộ phận cây hồ tiêu, đánh giá hoạt tính kháng nấm qua các chỉ số phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%), và xác định đặc điểm sinh học, phân loại dựa trên trình tự gen 16S rDNA. Các khái niệm chính bao gồm: vi sinh vật nội sinh, hoạt tính đối kháng, enzyme ngoại bào (chitinase, cellulase, protease), và an toàn sinh học trong ứng dụng vi sinh vật.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là 9 mẫu cây hồ tiêu (rễ, thân, lá) thu thập tại huyện Cư Kuin, Đắk Lắk vào tháng 7 năm 2017. Vi sinh vật nội sinh được phân lập trên 4 môi trường dinh dưỡng đặc hiệu: MPA, TSA, NA và KB. Phương pháp chọn mẫu theo TCVN 8551:2010, đảm bảo mẫu được khử trùng bề mặt kỹ lưỡng để loại bỏ vi sinh vật bên ngoài.

Phân tích hoạt tính đối kháng được thực hiện bằng phương pháp thử nghiệm kép trên môi trường PDA, đo phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%) sau 6 ngày nuôi cấy. Các chủng có RI% ≥ 30% được lựa chọn để nghiên cứu tiếp. Đặc điểm sinh học được xác định qua quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, thử khả năng đồng hóa các nguồn carbon và nitơ, xác định pH, nhiệt độ và nồng độ NaCl thích hợp. Phân loại vi sinh vật dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA bằng PCR và giải trình tự.

Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici được tiến hành trên lá hồ tiêu trong điều kiện phòng thí nghiệm, đánh giá mức độ bệnh qua thang điểm từ 0 đến 4. Dữ liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đa dạng vi sinh vật nội sinh: Từ 9 mẫu cây hồ tiêu, phân lập được 36 chủng vi sinh vật nội sinh, trong đó rễ chiếm 44,44%, thân 38,89% và lá 16,67%. Môi trường MPA phân lập được nhiều chủng nhất (36,11%), tiếp theo là NA và TSA (22,22% mỗi loại), thấp nhất là KB (19,45%).

2. Hoạt tính kháng nấm: Trong 36 chủng, 32 chủng có khả năng kháng ít nhất một loại nấm gây bệnh. Cụ thể, 26 chủng kháng Rhizoctonia solani với 72,22% có RI% trên 30%, 24 chủng kháng Phytophthora capsici với 100% có RI% trên 30%, và 27 chủng kháng Fusarium oxysporum với 92,6% có RI% trên 30%. Sáu chủng nổi bật có khả năng kháng cả ba loại nấm với RI% từ 48,14% đến 88,6%.

3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Các chủng được tuyển chọn có khả năng sinh enzyme chitinase, cellulase và protease, trong đó chủng HDL34 thể hiện hoạt tính enzym cao nhất với đường kính vòng phân giải lần lượt là 5,1 mm (chitinase), 3,0 mm (cellulase) và 3,1 mm (protease).

4. Đặc điểm sinh học và phân loại chủng HDL34: Chủng HDL34 được xác định là vi khuẩn Gram dương, có đặc điểm sinh học phù hợp với nhóm Bacillus, an toàn sinh học theo tiêu chuẩn châu Âu, thích hợp nuôi cấy ở pH 6,5-7, nhiệt độ 30-37°C và nồng độ NaCl dưới 2%.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk có sự đa dạng tương đối, phù hợp với điều kiện khí hậu và đất đai vùng Tây Nguyên. Tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng nấm cao vượt trội so với một số nghiên cứu trước đây, minh chứng cho tiềm năng ứng dụng trong phòng trừ sinh học. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng, đặc biệt là HDL34, góp phần vào cơ chế ức chế nấm bệnh qua phá hủy thành tế bào nấm, đồng thời hỗ trợ tăng cường sức đề kháng cho cây.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, như tại Ấn Độ và Malaysia, kết quả tương đồng về vị trí phân bố vi sinh vật nội sinh và mức độ kháng nấm, tuy nhiên nghiên cứu này đã mở rộng phạm vi đánh giá enzyme ngoại bào và an toàn sinh học, tạo nền tảng cho phát triển chế phẩm sinh học. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố chủng theo bộ phận cây, bảng so sánh RI% của các chủng và hình ảnh khuẩn lạc, nhuộm Gram để minh họa đặc điểm sinh học.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển chế phẩm sinh học từ chủng vi sinh vật nội sinh: Tập trung nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học dựa trên chủng HDL34 và các chủng có hoạt tính kháng nấm cao, nhằm giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học, nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh trên cây hồ tiêu trong vòng 2-3 năm tới. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Áp dụng quy trình nuôi cấy và sử dụng tối ưu: Xây dựng quy trình nuôi cấy chủng vi sinh vật nội sinh ở điều kiện pH 6,5-7, nhiệt độ 30-37°C và nồng độ NaCl dưới 2%, đảm bảo sinh trưởng và hoạt tính kháng nấm tối đa. Thời gian triển khai trong 1 năm, do các phòng thí nghiệm chuyên ngành thực hiện.

3. Mở rộng khảo sát và phân lập vi sinh vật nội sinh tại các vùng trồng hồ tiêu khác: Tiến hành khảo sát đa dạng vi sinh vật nội sinh tại các tỉnh Tây Nguyên và Đông Nam Bộ để tuyển chọn thêm chủng có tiềm năng, phục vụ phát triển bền vững ngành hồ tiêu. Thời gian thực hiện 2 năm, do các trường đại học và viện nghiên cứu phối hợp.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ cho nông dân: Tổ chức các khóa tập huấn về sử dụng chế phẩm sinh học và kỹ thuật canh tác bền vững cho người trồng hồ tiêu, nhằm nâng cao nhận thức và áp dụng hiệu quả biện pháp sinh học trong vòng 1-2 năm. Chủ thể thực hiện là các cơ quan quản lý nông nghiệp và tổ chức đào tạo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về vi sinh vật nội sinh, phương pháp phân lập và đánh giá hoạt tính kháng nấm, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan đến vi sinh vật đối kháng và bảo vệ thực vật.

2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và bảo vệ thực vật: Thông tin về chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng nấm cao và đặc điểm sinh học giúp phát triển sản phẩm sinh học thay thế thuốc hóa học, nâng cao hiệu quả và an toàn trong sản xuất nông nghiệp.

3. Cơ quan quản lý nông nghiệp và phát triển nông thôn: Cơ sở khoa học để xây dựng chính sách khuyến khích sử dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây trồng, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường.

4. Nông dân và hợp tác xã trồng hồ tiêu: Hướng dẫn áp dụng các biện pháp sinh học trong quản lý dịch hại, nâng cao năng suất và chất lượng hồ tiêu, giảm thiểu tác động tiêu cực của thuốc hóa học đến sức khỏe và môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi sinh vật nội sinh là gì và vai trò của chúng trong bảo vệ cây hồ tiêu?
   Vi sinh vật nội sinh là các vi sinh vật sống trong mô tế bào cây mà không gây hại. Chúng giúp tăng cường miễn dịch, kích thích sinh trưởng và sản sinh các hợp chất kháng nấm, góp phần bảo vệ cây hồ tiêu khỏi các bệnh nấm nguy hiểm như Phytophthora capsici.

2. Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh được thực hiện như thế nào?
   Mẫu rễ, thân, lá được khử trùng bề mặt kỹ lưỡng, sau đó nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng đặc hiệu như MPA, TSA, NA và KB. Vi sinh vật phát triển được tách thuần và đánh giá hoạt tính kháng nấm qua thử nghiệm đối kháng trên môi trường PDA.

3. Chỉ số phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%) có ý nghĩa gì?
   RI% đo lường khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm bởi vi sinh vật nội sinh. RI% ≥ 70% được xem là hoạt động kháng nấm rất cao, từ 50-70% là cao, 30-50% vừa phải và dưới 30% là thấp. Đây là chỉ số quan trọng để lựa chọn chủng vi sinh vật tiềm năng.

4. Chủng vi sinh vật nội sinh HDL34 có điểm gì nổi bật?
   HDL34 có khả năng kháng mạnh ba loại nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu với RI% từ 40,61% đến 75,35%, đồng thời sinh được ba loại enzyme ngoại bào (chitinase, cellulase, protease) với hoạt tính cao, giúp phá hủy thành tế bào nấm và tăng hiệu quả phòng trừ bệnh.

5. Làm thế nào để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tế sản xuất hồ tiêu?
   Kết quả nghiên cứu có thể được chuyển giao qua việc phát triển chế phẩm sinh học từ các chủng vi sinh vật nội sinh, áp dụng trong phun hoặc bón cho cây hồ tiêu nhằm phòng trừ bệnh nấm, giảm sử dụng thuốc hóa học, đồng thời tổ chức đào tạo kỹ thuật cho nông dân để đảm bảo hiệu quả và bền vững.

Kết luận

• Đã phân lập và xác định được 36 chủng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk, với đa dạng sinh học tương đối cao, tập trung chủ yếu ở rễ và thân.
• 32 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh, trong đó 6 chủng nổi bật có khả năng kháng mạnh cả ba loại nấm Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani.
• Chủng HDL34 được chọn làm đối tượng nghiên cứu sâu với đặc điểm sinh học phù hợp, khả năng sinh enzyme ngoại bào cao và an toàn sinh học.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển chế phẩm sinh học thay thế thuốc hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuất hồ tiêu.
• Các bước tiếp theo bao gồm phát triển quy trình nuôi cấy, thử nghiệm quy mô lớn và chuyển giao công nghệ cho nông dân, dự kiến trong vòng 2-3 năm tới.

Kêu gọi hành động: Các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý cần phối hợp đẩy mạnh ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong sản xuất hồ tiêu để phát triển ngành hàng bền vững, an toàn và hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hồ tiêu đen (Piper nigrum L.), đồng nghĩa với danh hiệu "vua gia vị", là một loại cây nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển Malabar ở Nam Ấn Độ (Nazeem et al. Tại Việt Nam, cây hồ tiêu được trồng chủ yếu tại 9 tỉnh trọng điểm của nước ta, với tổng diện tích 100.000 ha, trong đó, Tây Nguyên là vùng có nhiều tiềm năng về đất đai, khí hậu để mở rộng diện tích trồng tiêu (4 tỉnh Tây Nguyên: Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông và Lâm Đồng đã chiếm 55. Tuy diện tích hồ tiêu chỉ chiếm 2,5% trong tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu năm nhưng giá trị xuất khẩu đạt khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, 6 lần cây chè, 3,8 lần cây điều, gấp 4 lần cây cao su. Tuy có nhiều lợi thế để phát triển, song thực tế trong những năm qua cây hồ tiêu vẫn chưa thực sự đứng vững, thậm chí nhiều thời điểm người sản xuất còn lao đao bởi cây tiêu chết hàng loạt do chạy theo giá thị trường, phát triển cây tiêu không theo quy hoạch, không chú trọng đến việc cải tạo đất, không xử lý mầm bệnh.

Một số diện tích tiêu trồng trên những vùng đất không phù hợp, trồng một cách tạm bợ không được chăm sóc theo đúng quy trình kỹ thuật, giống tiêu không rõ nguồn gốc,. khiến tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ngày càng phát triển mạnh. Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora và bệnh chết chậm có thể do sự cộng hợp của các tác nhân nấm Fusarium sp., tuyến trùng Meloidogyne sp. Ở nước ta hiện nay, việc phòng trừ dịch hại trên cây tiêu chủ yếu bằng biện pháp hóa học thường gặp nhiều khó khăn, vì không những khó tiêu diệt được bào tử nấm gây bệnh, mà còn ảnh hưởng đến sinh vật, côn trùng có lợi làm mất cân bằng sinh thái.

Hướng sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh trong phòng chống bệnh cho cây trồng nói chung và cây hồ tiêu nói riêng, được xem là giải pháp cần thiết nhằm thay thế các loại thuốc hoá học gây độc hại môi trường. Đối với bệnh hại trên hồ tiêu đã được nghiên cứu và có nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tế sản xuất, như sử dụng một số loài nấm Dactylella oviparasitica, Arthrobotrys oligospore, Verticillium 2 chlamydosporium, Monacrosporium gepgyropagum có khả năng diệt tuyến trùng hay nấm Trichoderma đang được sử dụng khá phổ biến trong phòng trừ nấm Phytophthora trên cây hồ tiêu (Ngô Thị Xuyên, 2002). Sử dụng vi sinh vật đối kháng phân lập từ đất sẽ khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây bệnh, đây chính là hiệu quả của việc quản lý dịch hại dựa trên cơ sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất. Tuy nhiên, biện pháp phòng trừ sinh học bằng các vi sinh vật nội sinh đối kháng chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta.

Vì vậy, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu, trên cơ sở đó chọn lựa ra những chủng có khả năng kháng nấm và tuyến trùng là việc làm cấp thiết nhằm hạn chế sử dụng thuốc hóa học, phát triển phong phú quần thể vi sinh vật có lợi sẽ giúp cho cây trồng phát triển, tăng sức đề kháng sâu bệnh. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh thực vật trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk” với mục đích nghiên cứu sự đa dạng, phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu, với các nội dung chính sau đây: 1. Phân lập và đánh giá sự phân bố vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu ở Đắk Lắk; 2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng diệt nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu cao ở Đắk Lắk; 3.

Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại và an toàn sinh học của chủng được tuyển chọn; 4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng, phát triển của các chủng được tuyển chọn và thử nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh trên lá hồ tiêu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU 1.

Cây hồ tiêu và tiềm năng phát triển cây hồ tiêu ở Việt Nam Hạt tiêu đen (Piper nigrum L.), đồng nghĩa với danh hiệu "vua gia vị", là một loại cây nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển Malabar ở Nam Ấn Độ (Ravindran, 2000; Nazeem et al. Hồ tiêu được lan truyền bởi thương nhân Hindu và du khách đến Malaysia và Indonesia. Ngày nay, Hồ tiêu được trồng thương mại ở các vùng nhiệt đới bao gồm Malabar, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Sri Lanka, Việt Nam và Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa để hỗ trợ nhu cầu tiêu thụ tiêu đen trên toàn thế giới (Victor R. Tại Việt Nam, cây hồ tiêu được trồng ở nhiều vùng sinh thái như ở miền đồi núi đất đỏ, miền trung như tỉnh Quảng Trị hoặc vùng Đông Nam Bộ và các tỉnh Tây Nguyên.

Tuy nhiên, hồ tiêu chủ yếu trồng tại 9 tỉnh trọng điểm của nước ta, với tổng diện tích 100.000 ha, trong đó, Tây Nguyên là vùng có nhiều tiềm năng về đất đai, khí hậu để mở rộng diện tích trồng tiêu (4 tỉnh Tây Nguyên: Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng đã chiếm 55. Hồ tiêu là loại cây trồng khó tính, mẫn cảm với sự thay đổi thất thường của thời tiết, mặt Hình 1.1: Cây hồ tiêu khác bộ rễ cây tiêu rất dễ tổn thương bởi các tác động từ bên ngoài và khi bộ rễ đã tổn thương thì không hút được nước, các chất dinh dưỡng, tạo cho các loại sâu bệnh hại thừa cơ xâm nhập để tàn phá. Phytophthora capsici là tác nhân gây bệnh chết nhanh ở thực vật thường được coi là tác nhân gây bệnh thối rữa và bệnh rụng lá ở tiêu (Anandaraj và Sarma, 1995a, Babadoost, 2005, Nguyen, V. Hiện trạng canh tác trồng cây hồ tiêu ở Đắk Lắk Theo Thống kê của ngành nông nghiệp, hồ tiêu được trồng khoảng 100.000ha chủ yếu là Đông Nam Bộ và Tây Nguyên và là một trong những loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế và giá trị xuất khẩu cao.

Tuy diện tích hồ tiêu chỉ chiếm 2,5% trong tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu năm, giá trị xuất khẩu đạt khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, 6 lần cây chè, 3,8 lần cây điều, gấp 4 lần cây cao su (Quyết định 1442/QĐ-BNN-TT ngày 3/7/2014 của Bộ NN và PTNN). Tuy có nhiều lợi thế để phát triển song thực tế trong những năm qua cây hồ tiêu vẫn chưa thực sự đứng vững, thậm chí nhiều thời điểm người sản xuất còn lao đao bởi cây tiêu chết hàng loạt do chạy theo giá thị trường, phát triển cây tiêu không theo quy hoạch, không chú trọng đến việc cải tạo đất, không xử lý mầm bệnh. Một số diện tích tiêu trồng trên những vùng đất không phù hợp, trồng một cách tạm bợ không được chăm sóc theo đúng quy trình kỹ thuật, giống tiêu không rõ nguồn gốc,. khiến tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ngày càng phát triển mạnh.

Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết nhanh, chết chậm. Bệnh cây và ảnh hưởng của bệnh nấm đối với cây trồng Theo thống kê của Tổ chức Nông- Lương thế giới (FAO): Các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với khoản 100.000 loại sâu hại, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Chính vì vậy, hàng năm khoảng 20% sản lượng lương thực, thực phẩm trên thế giới bị mất trắng. Trên thế giới bệnh cây đã gây ra những thiệt hại to lớn cho sản xuất nông nghiệp, chúng phá huỷ đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới.

Riêng lúa chiếm khoảng 9%, ngô 10%, cây rau 12% và cây ăn quả 16,5%. Trong các loại bệnh cây, bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%. Theo Ou, 1972, trong số 45 bệnh lúa đã mô tả có tới 60% do nấm gây ra, cũng theo kết quả nghiên cứu khoa học bảo vệ thực vật 1971-1976 của Viện Bảo vệ thực vật, trong số 24 bệnh hại lúa ở Việt Nam có tới 13 bệnh do 5 nấm gây ra, 34 bệnh ngô có 26 bệnh do nấm gây ra và 21 bệnh khoai tây có 8 bệnh do nấm. Những bệnh nấm chủ yếu và có tầm quan trọng nhất, là các bệnh: đạo ôn, khô vằn, tiêm hạch, đốm nâu, thối rễ, mốc sương… Một số bệnh nấm tiêu biểu gây hại cho cây trồng được quan tâm nhiều nhất là bệnh thối thân, rễ ở thực vật do nhiều loài nấm ký sinh gây ra như Phytophthora sp., Botrytis cinerespers, Diplodia sp., Rhizoctonia solani Kuln, Sclerotium batiticola Faud nhưng chủ yếu là F.

Chỉ riêng tính ở khoai tây thiệt hại do Fusarium sp. gây bệnh thối củ trên đồng ruộng và trong bảo quản lên tới 20% số củ thu hoạch được. Ngoài ra, chúng còn gây một số bệnh khác như bệnh mốc hồng và thối thân ở ngô. Nấm Fusarium oxysorum còn gây ra bệnh héo mạch dẫn và nhiều bệnh thối thân thối rễ ở nhiều loại cây rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua… Bệnh héo thân cây còn do Pseudomonas solanacerium là loài vi khuẩn Gram âm ký sinh đa thực vật, bào gồm nhiều chủng gây bệnh héo rũ trên 35 họ cây trồng khác nhau, rất phổ biến ở nước ta và nhiều nước trên thế giới.

Bệnh héo rũ vi khuẩn là loại bệnh gây tắc ống dẫn, sau mấy ngày toàn cây héo rũ, chết khô dần. Khả năng đối kháng của các vi sinh vật đối với nấm gây bệnh thực vật Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có thể kháng lại các vi sinh vật gây bệnh cho cây, nhất là đất được canh tác tốt, đúng kỹ thuật sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật có lợi phát triển cạnh tranh với các vi sinh vật có hại gây bệnh cho cây. Trong số các nhóm vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm thì vi khuẩn và xạ khuẩn có tỷ lệ đối kháng cao, có tới 40-60% các chủng xạ khuẩn sống trong đất có khả năng kháng lại các loại nấm gây bệnh cho cây trồng như nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ, nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn ở lúa, nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn ở lúa, ngô. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các nhà khoa học ở nhiều nước đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật, xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật.