Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn bacillus licheniformis d7

Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long bằng vi khuẩn bacillus licheniformis d7.

• Tác giả: Hồ Nguyễn Hoàng Yến
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh
• Trường học: Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm chung
• 1.1.1. Khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng mốc của Bacillus licheniformis
• 1.2. Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long
• 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.3.1. Một số nghiên cứu ngoài nước
• 1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước
• 1.3.3. Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Các phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.2.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
• 2.2.2.1. Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn
• 2.2.2.2. Phương pháp bảo quản bào tử nấm mốc
• 2.2.2.3. Phương pháp bảo quản hệ sợi tơ nấm mốc
• 2.2.3. Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn
• 2.2.4. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
• 2.2.5. Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng của vi khuẩn
• 2.2.6. Phương pháp khảo sát các thành phần khác nhau của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế nấm mốc
• 2.2.7. Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc
• 2.2.8. Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc
• 2.2.9. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt, bền pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm mốc
• 2.2.10. Phương pháp kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra trên thanh long của dịch nuôi cấy vi khuẩn
• 2.2.11. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Định danh chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 3.2. Định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
• 3.3. Kết quả sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
• 3.4. Đường cong tăng trưởng của chủng Bacillus licheniformis D7
• 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7
• 3.6. Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 3.7. Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 3.8. Khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 3.8.1. Khả năng bền nhiệt
• 3.8.2. Khả năng bền pH
• 3.9. Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum

Nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum là tác nhân chính gây ra bệnh đốm nâu trên thanh long, một loại trái cây có giá trị kinh tế cao tại Việt Nam. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng sản phẩm, gây thiệt hại lớn cho nông dân. Việc tìm kiếm các phương pháp kiểm soát hiệu quả bệnh do nấm mốc này là rất cần thiết. Bacillus licheniformis D7 đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc này, mở ra hướng đi mới cho việc bảo vệ cây trồng.

1.1. Đặc điểm của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum

Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, gây ra các bệnh nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt là thanh long. Nấm này có khả năng phát triển nhanh chóng trong điều kiện ẩm ướt, làm giảm năng suất và chất lượng trái cây.

1.2. Tác động của bệnh đốm nâu đến sản xuất thanh long

Bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra đã làm thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng thanh long. Nông dân gặp khó khăn trong việc tiêu thụ sản phẩm, ảnh hưởng đến thu nhập và đời sống.

II. Thách thức trong việc kiểm soát nấm mốc trên thanh long

Việc sử dụng thuốc diệt nấm hóa học để kiểm soát nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum không chỉ không hiệu quả mà còn gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, cần tìm kiếm các giải pháp sinh học an toàn và hiệu quả hơn.

2.1. Hạn chế của thuốc diệt nấm hóa học

Thuốc diệt nấm hóa học thường không hiệu quả trong việc kiểm soát nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum và có thể dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh.

2.2. Nhu cầu về giải pháp sinh học

Giải pháp sinh học như việc sử dụng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm mốc đang trở thành xu hướng trong nông nghiệp hiện đại. Bacillus licheniformis D7 là một trong những ứng viên tiềm năng.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế nấm mốc

Nghiên cứu khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bằng Bacillus licheniformis D7 được thực hiện thông qua các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm. Các phương pháp như khuếch tán qua giếng thạch và khảo sát sự phát triển của nấm mốc đã được áp dụng.

3.1. Thiết kế thí nghiệm và phương pháp thực hiện

Thí nghiệm được thiết kế để đánh giá khả năng ức chế của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 đối với sự phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum. Các điều kiện như nhiệt độ và pH cũng được kiểm soát chặt chẽ.

3.2. Kết quả khảo sát sự phát triển của nấm mốc

Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng ức chế sự nảy mầm và phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, đặc biệt là trong điều kiện pH 7 và nhiệt độ phòng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Bacillus licheniformis D7 trong nông nghiệp

Nghiên cứu cho thấy Bacillus licheniformis D7 có tiềm năng lớn trong việc phát triển chế phẩm sinh học để kiểm soát bệnh đốm nâu trên thanh long. Việc ứng dụng chế phẩm này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn thân thiện với môi trường.

4.1. Tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học

Bacillus licheniformis D7 có thể được phát triển thành chế phẩm sinh học, giúp nông dân kiểm soát bệnh đốm nâu một cách hiệu quả và an toàn.

4.2. Lợi ích cho ngành trồng thanh long

Việc sử dụng Bacillus licheniformis D7 không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại do nấm mốc mà còn nâng cao chất lượng sản phẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xuất khẩu thanh long.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bằng Bacillus licheniformis D7 mở ra hướng đi mới cho việc bảo vệ cây trồng. Việc phát triển chế phẩm sinh học từ vi khuẩn này có thể giúp ngành nông nghiệp Việt Nam phát triển bền vững.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ Bacillus licheniformis D7, nhằm nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh đốm nâu trên thanh long.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Thanh long (Hylocereus undatus và Hylocereus polyrhizus) là loại cây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới có giá trị kinh tế cao, được trồng phổ biến tại các tỉnh Bình Thuận, Long An và Tiền Giang. Theo số liệu thống kê trong văn bản, diện tích canh tác thanh long tại Việt Nam tăng từ 5.512 ha năm 2000 lên 35.665 ha năm 2014, sản lượng đạt khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và ước tính đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025. Tuy nhiên, việc mở rộng diện tích và thâm canh cao đã tạo điều kiện cho nhiều loại dịch hại phát triển. Từ năm 2008, bệnh đốm nâu xuất hiện tại Bình Thuận, sau đó lây lan ra hơn 1.000 ha vào năm 2012 và tăng lên 3.000 ha vào năm 2013, gây thiệt hại nghiêm trọng đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng quả.

Tác nhân chính gây ra bệnh đốm nâu được xác định là nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum. Nấm bệnh gây ra các vết tổn thương hình tròn, trũng, chuyển từ màu đỏ sang xám, đóng vảy nâu và tạo lỗ thủng trên thân cành cũng như quả thanh long. Việc lạm dụng thuốc diệt nấm hóa học trong thực tế không mang lại hiệu quả kiểm soát triệt để, đồng thời gây ô nhiễm môi trường, tăng nguy cơ bùng phát tính kháng thuốc và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, việc ứng dụng tác nhân sinh học đối kháng có nguồn gốc từ vi khuẩn—đặc biệt là các chủng thuộc chi Bacillus có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt và tiết các hoạt chất kháng sinh tự nhiên—là giải pháp được đặt ra nhằm hướng tới canh tác bền vững.

Khóa luận xác định mục tiêu chung là đánh giá khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7. Nhiệm vụ nghiên cứu được cụ thể hóa thành 5 nội dung:

1. Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7.
2. Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum.
3. Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum.
4. Khảo sát khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum.
5. Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum (ký hiệu HY) được phân lập từ thân cây thanh long bị nhiễm bệnh đốm nâu tại Bình Thuận.
• Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 được phân lập từ mẫu đất tại Thành phố Hồ Chí Minh. Cả hai chủng vi sinh vật được lưu trữ tại Bộ sưu tập giống của Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá hoạt tính đối kháng in vitro và hiệu quả ngăn ngừa bệnh in vivo trên mô thân và quả thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở phân loại học và sinh lý học vi sinh vật:

• Neoscytalidium dimidiatum: Thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu, phân cắt thành các bào tử đốt hình trụ, hình tròn hoặc ellipse chứa 1-2 nhân.
• Bacillus licheniformis: Thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus. Đây là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, hình thành nội bào tử bền nhiệt và tiết nhiều enzyme ngoại bào (chitinase, protease, glucanase, amylase) cùng các hợp chất kháng nấm (chẳng hạn như Fungicin M4, Protein F2, Surfactin, benzoic acid).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Định danh sinh học phân tử: Khai thác trình tự vùng gen 18S-rRNA (đối với nấm mốc) và 16S-rRNA (đối với vi khuẩn) được giải trình tự tại Đại học Konkuk (Hàn Quốc). So sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI; căn chỉnh và xử lý trình tự bằng các phần mềm FinchTV, Seaview, ClustalX2; xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-joining với giá trị kiểm định bootstrap 1.000 lần trên phần mềm MEGA5.
• Bảo quản giống vi sinh vật: Giữ giống trong môi trường bổ sung glycerol nồng độ cuối 50% ở nhiệt độ -80°C.
• Thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn: Chủng vi khuẩn D7 được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường LB ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong 16 giờ, sau đó ly tâm lạnh 13.000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút (2 lần) để thu dịch nổi.
• Đo đường cong tăng trưởng: Đo giá trị mật độ quang $\text{OD}_{600\text{nm}}$ sau mỗi 2 giờ nuôi cấy trong môi trường LB; mô hình hóa dữ liệu sinh trưởng theo mô hình Gompertz bằng phần mềm GraphPad Prism 8.2.
• Thử nghiệm khuếch tán qua giếng thạch: Đánh giá đường kính vòng ức chế ($D - d$) trên môi trường thạch PGA (Potato Glucose Agar) sau khi bổ sung 50 µL dịch nuôi cấy vi khuẩn.
• Khảo sát phân đoạn dịch nuôi cấy: So sánh hoạt tính giữa dịch nuôi cấy vi khuẩn vô bào (lọc qua màng vô trùng 0,22 µm) và huyền phù tế bào vi khuẩn đã rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
• Khảo sát tác động lên bào tử và hệ sợi tơ nấm: Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử hoặc dịch chứa hệ sợi tơ nấm mốc theo các tỷ lệ thể tích 0,5:1; 1:1; 2:1 (chuẩn hóa mật độ $10^6\text{ bào tử/mL}$ bằng buồng đếm hồng cầu), theo dõi hình thái và khả năng phát triển tại các mốc thời gian 4, 8, 12 và 24 giờ.
• Khảo sát độ bền nhiệt và bền pH: Xử lý dịch nuôi cấy ở các mức nhiệt độ 40°C đến 100°C (đun cách thủy) và 121°C (hơi nước áp suất cao) trong 30 phút; xử lý ở các dải pH khác nhau từ pH 1,0 đến 11,0 bằng dung dịch đệm trong 2 giờ trước khi kiểm tra hoạt tính kháng mốc.
• Thử nghiệm phòng ngừa bệnh trên mô thực vật (in vivo): Tiêm 200 µL hỗn hợp thử nghiệm (độ sâu 0,5 cm) lên thân cành và quả thanh long, theo dõi triệu chứng bệnh đốm nâu định kỳ đến 21 ngày.
• Xử lý số liệu: Tính toán giá trị trung bình, vẽ biểu đồ trên Excel 2019, phân tích phương sai ANOVA ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ (độ tin cậy 95%) bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tổng quan về giá trị kinh tế của thanh long Việt Nam, sự suy giảm năng suất do bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum), thực trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học và sự cần thiết của biện pháp sinh học. Xác định rõ mục tiêu, 5 nội dung nghiên cứu, đối tượng chủng nấm HY và chủng vi khuẩn D7, cùng ý nghĩa thực tiễn của đề tài trong việc định hướng phát triển chế phẩm sinh học.

Chương 1: Tổng quan

Hệ thống hóa các tài liệu khoa học về đặc điểm sinh thái, sinh lý của chi Bacillus và loài Bacillus licheniformis, các nhóm chất kháng nấm ngoại bào (peptide, lipopeptide, enzyme thủy phân). Tổng quan về chu trình gây bệnh của Neoscytalidium dimidiatum trên thanh long qua 6 giai đoạn triệu chứng (đốm đỏ $\rightarrow$ xám $\rightarrow$ vảy nâu $\rightarrow$ quầng sáng vàng $\rightarrow$ vết loét dạng ghẻ $\rightarrow$ hoại tử tạo lỗ hổng). Trình bày tình hình nghiên cứu quốc tế (Lan et al., 2012; Montiel et al., 2018; Alwan et al., 2019) và trong nước (Võ Thị Thu Oanh et al., 2014; Hà Thị Thúy et al., 2016; Đỗ Thị Thanh Dung et al., 2018; Nguyễn Như Nhứt et al., 2019), rút ra khoảng trống nghiên cứu về việc tìm kiếm các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt lực ức chế mạnh.

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp

Mô tả chi tiết danh mục thiết bị, dụng cụ, hóa chất tinh khiết và thành phần các môi trường nuôi cấy (LB, LB agar, PGA, PGB, môi trường giữ giống chứa glycerol). Trình bày sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể và quy trình chuẩn của 11 phương pháp thực nghiệm: từ kỹ thuật giữ giống -80°C, định danh phân tử, thu nhận dịch nuôi cấy, khuếch tán giếng thạch, đo $\text{OD}_{600\text{nm}}$, khảo sát phân đoạn dịch/tế bào, thử nghiệm ức chế bào tử/hệ sợi tơ, kiểm tra độ bền nhiệt/pH, đến quy trình cảm nhiễm in vivo trên cành và quả thanh long, kèm phương pháp xử lý thống kê ANOVA.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Trình bày và thảo luận toàn bộ các phát hiện thực nghiệm qua 9 nội dung:

• Định danh nấm mốc: Khuẩn lạc chủng HY trên PGA có dạng sợi màu xám đen đến nâu đen, vươn cao như bông; bào tử đốt hình ellipse, hình trụ hoặc tròn. Trình tự gen 18S-rRNA tương đồng 100% với Neoscytalidium dimidiatum CBS 251.49, cây phả hệ Neighbor-joining đạt giá trị bootstrap 98.
• Định danh vi khuẩn: Chủng D7 là trực khuẩn Gram dương, tạo nội bào tử, dương tính với phản ứng catalase, khuẩn lạc màu trắng đục, bề mặt khô nhăn. Trình tự 16S-rRNA tương đồng 91% với Bacillus licheniformis RT8, cây phả hệ có giá trị bootstrap 100.
• Khả năng đối kháng sơ bộ: Dịch nuôi cấy D7 tạo vòng ức chế nấm mốc đạt đường kính 29,5 mm trên đĩa PGA. Dịch nuôi cấy vô bào (qua màng lọc 0,22 µm) không còn hoạt tính, trong khi huyền phù tế bào vi khuẩn sau khi rửa sạch thể hiện khả năng ức chế rõ rệt.
• Đường cong tăng trưởng và thời gian thu dịch: Chủng D7 đạt pha cân bằng sau 16 giờ nuôi cấy trong LB. Khảo sát hoạt tính theo thời gian cho thấy dịch nuôi cấy thu tại thời điểm 16 giờ đạt hoạt lực kháng nấm cao nhất, có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) so với các mốc thời gian khác.
• Tác động lên sự nảy mầm của bào tử: Ở tỷ lệ phối trộn dịch nuôi cấy : dịch bào tử là 0,5:1, bào tử nấm mất khả năng sinh trưởng trên PGA sau 8 giờ ủ. Ở tỷ lệ 1:1 và 2:1, bào tử bị ức chế nảy mầm, biến dạng và mất hoàn toàn khả năng sinh trưởng sau 4 giờ tiếp xúc.
• Tác động lên hệ sợi tơ nấm: Dịch nuôi cấy D7 làm hệ sợi tơ nấm bị biến dạng, teo xoắn và đứt gãy sau 4–8 giờ xử lý ở tỷ lệ 1:1 và 2:1. Sau 24 giờ, hệ sợi tơ nấm bị hủy hoại hoàn toàn và không thể tiếp tục phân nhánh kéo dài.
• Độ bền nhiệt: Dịch nuôi cấy duy trì hoạt tính ức chế nấm ở dải nhiệt độ từ nhiệt độ phòng đến 80°C (hoạt tính còn lại đạt 29,09% tại 80°C trong 30 phút), nhưng mất hoàn toàn hoạt tính khi xử lý ở 90°C, 100°C và 121°C.
• Độ bền pH: Hoạt tính kháng nấm đạt tối ưu tại pH 7,0 (môi trường trung tính), giảm ở môi trường kiềm và mất hoàn toàn hoạt tính trong điều kiện acid mạnh (pH 1,0–2,0).
• Hiệu quả ngăn ngừa bệnh in vivo: Trên quả thanh long, dịch nuôi cấy D7 làm giảm rõ rệt diện tích và mức độ tổn thương của vết bệnh. Trên thân cành thanh long, việc xử lý dịch vi khuẩn phối trộn với bào tử nấm giúp ngăn ngừa hoàn toàn sự xuất hiện của triệu chứng bệnh đốm nâu trong suốt thời gian theo dõi ít nhất 21 ngày.

Chương 4: Kết luận

Tóm lược các kết quả đạt được về định danh, thông số sinh trưởng, hoạt tính ức chế bào tử/sợi nấm, tính chất bền lý hóa và hiệu quả bảo vệ mô thực vật của chủng Bacillus licheniformis D7, khẳng định tiềm năng phát triển chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận cung cấp các dữ liệu định lượng cụ thể qua các bảng thực nghiệm:

Chỉ tiêu khảo sát	Điều kiện / Thông số thực nghiệm	Kết quả ghi nhận
Định danh chủng nấm HY	Vùng gen 18S-rRNA (BLAST, NCBI)	Tương đồng 100% với N. dimidiatum CBS 251.49 (Bootstrap = 98)
Định danh chủng vi khuẩn D7	Vùng gen 16S-rRNA (BLAST, NCBI)	Tương đồng 91% với B. licheniformis RT8 (Bootstrap = 100)
Đường kính vòng ức chế in vitro	Khuếch tán giếng thạch trên môi trường PGA	Đường kính $D - d = 29,5\text{ mm}$
Thời điểm sinh trưởng tối ưu	Nuôi lắc LB (150 rpm, nhiệt độ phòng)	Pha cân bằng đạt tại 16 giờ; hoạt tính kháng mốc đạt cực đại tại 16 giờ
Ngưỡng ức chế bào tử nấm	Tỷ lệ dịch vi khuẩn : dịch bào tử ($10^6\text{ CFU/mL}$)	Tỷ lệ 0,5:1: Bào tử mất sinh trưởng sau 8 giờ Tỷ lệ 1:1 và 2:1: Bào tử mất sinh trưởng sau 4 giờ
Tác động lên hệ sợi tơ nấm	Xử lý phối trộn dịch nuôi cấy	Hệ sợi tơ bị biến dạng, teo xoắn, đứt gãy sau 4–8 giờ; phân rã sau 24 giờ
Độ bền nhiệt của dịch nuôi cấy	Xử lý nhiệt độ trong 30 phút	Hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ phòng; còn 29,09% ở 80°C; mất hoạt tính ở $\ge 90^\circ\text{C}$
Độ bền pH của dịch nuôi cấy	Xử lý trong dung dịch đệm 2 giờ	Hoạt tính cao nhất tại pH 7,0; mất hoạt tính ở pH 1,0–2,0
Hiệu quả bảo vệ thân cành in vivo	Tiêm hỗn hợp dịch thử nghiệm (sâu 0,5 cm)	Ngăn ngừa hoàn toàn triệu chứng bệnh đốm nâu trong ít nhất 21 ngày

Tác giả đề xuất định hướng ứng dụng chủng Bacillus licheniformis D7 để nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học đối kháng nấm bệnh, thay thế các loại thuốc trừ nấm hóa học trong canh tác thanh long.

So với các công trình công bố trước đó, nghiên cứu này ghi nhận dịch nuôi cấy của chủng B. licheniformis D7 tạo đường kính vòng ức chế nấm N. dimidiatum đạt 29,5 mm, cao hơn so với đường kính vòng ức chế của các chủng Bacillus sp. do Đỗ Thị Thanh Dung và cộng sự (2018) phân lập từ đất vườn thanh long tại Bình Thuận (21,33 mm). Đồng thời, tác giả đã làm rõ cơ chế tác động kép: vừa ức chế sự nảy mầm và phá hủy hình thái bào tử, vừa làm biến dạng đứt gãy hệ sợi tơ, cũng như chứng minh được khả năng bảo vệ thân cành thanh long không phát bệnh trong 21 ngày in vivo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu:

• Thử nghiệm hiệu quả phòng ngừa bệnh in vivo mới được tiến hành trên thân cành và quả thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm, chưa khảo nghiệm trên cây trồng ngoài đồng ruộng chịu tác động của điều kiện thời tiết tự nhiên.
• Dịch nuôi cấy vô bào sau khi lọc qua màng 0,22 µm bị mất hoạt tính ức chế nấm, cho thấy các hợp chất đối kháng có thể kém bền hoặc đòi hỏi sự hiện diện của tế bào vi khuẩn trong quá trình cảm ứng tiết chất kháng sinh; nghiên cứu chưa tách chiết và xác định cấu trúc hóa học cụ thể của hoạt chất.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tinh sạch, xác định bản chất hóa học và cơ chế phân tử của các hợp chất kháng nấm ngoại bào do chủng D7 sinh tổng hợp.
• Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men và công nghệ tạo chế phẩm sinh học (dạng lỏng hoặc dạng bột mang bào tử vi khuẩn).
• Khảo nghiệm diện rộng khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu của chế phẩm tại các vùng chuyên canh thanh long (Bình Thuận, Long An, Tiền Giang).

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo chuyên môn hữu ích cho sinh viên, học viên và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành: Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Vi sinh học ứng dụng và Nông nghiệp công nghệ cao.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu gồm:

• Quy trình chuẩn trong định danh phân tử nấm và vi khuẩn dựa trên gen 18S-rRNA và 16S-rRNA, phân tích cây phát sinh loài bằng MEGA5.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá động học sinh trưởng vi khuẩn theo mô hình Gompertz.
• Thiết kế thí nghiệm định lượng tác động của dịch vi sinh vật đối kháng lên bào tử và hệ sợi tơ nấm mốc (in vitro và in vivo trên mô thực vật).

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 và nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum được thu thập từ nguồn nào? Chủng nấm mốc N. dimidiatum (HY) được phân lập từ mô thân cây thanh long nhiễm bệnh đốm nâu tại tỉnh Bình Thuận. Chủng vi khuẩn B. licheniformis D7 được phân lập từ mẫu đất tại Thành phố Hồ Chí Minh. Cả hai chủng được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM.

2. Hoạt tính đối kháng in vitro của chủng B. licheniformis D7 đối với nấm N. dimidiatum đạt kết quả như thế nào? Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch ghi nhận đường kính vòng ức chế nấm mốc đạt 29,5 mm, cao hơn so với kết quả công bố của các chủng Bacillus sp. trong nghiên cứu của Đỗ Thị Thanh Dung và cộng sự năm 2018 (21,33 mm).

3. Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn D7 đạt hoạt tính kháng nấm cao nhất ở thời điểm nào? Dựa trên đường cong tăng trưởng mô hình hóa theo Gompertz, chủng D7 bước vào pha cân bằng sau 16 giờ nuôi cấy trong môi trường LB. Dịch nuôi cấy thu tại thời điểm 16 giờ cho hoạt tính ức chế nấm N. dimidiatum mạnh nhất và có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$).

4. Dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn D7 có đặc tính bền nhiệt và bền pH ra sao? Dịch nuôi cấy có hoạt tính kháng nấm tốt nhất ở nhiệt độ phòng và pH 7,0. Hoạt tính duy trì được đến 80°C (còn 29,09% sau 30 phút) nhưng mất hoàn toàn ở nhiệt độ $\ge 90^\circ\text{C}$ (90°C, 100°C, 121°C). Ở môi trường acid mạnh (pH 1,0–2,0), dịch nuôi cấy mất hoàn toàn hoạt tính đối kháng.

5. Kết quả kiểm tra hiệu quả phòng ngừa bệnh đốm nâu trên thân cây thanh long đạt được như thế nào? Khi phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn D7 với dịch bào tử nấm mốc và tiêm vào thân cành thanh long, sự phát triển của bệnh đốm nâu bị ngăn ngừa hoàn toàn trong thời gian theo dõi ít nhất 21 ngày.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hồ Nguyễn Hoàng Yến đã xác định thành công khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7. Dịch nuôi cấy vi khuẩn ở thời điểm 16 giờ thể hiện hoạt tính kháng nấm mạnh, ức chế nảy mầm bào tử, phá hủy cấu trúc hệ sợi tơ nấm, đồng thời bền nhiệt đến 80°C và hoạt động tối ưu ở pH 7,0. Thử nghiệm thực nghiệm chứng minh vi khuẩn D7 có khả năng ngăn ngừa hoàn toàn sự phát triển của bệnh đốm nâu trên thân cành thanh long trong ít nhất 21 ngày, tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung Các chủng Bacillus là vi khuẩn Gram dương hình que, hiếu khí hoặc kỵ khí đa dạng, có khả năng sinh enzyme catalase và hiện diện ở khắp nơi trong tự nhiên [16]. Chúng có khả năng hình thành nội bào tử khi điều kiện môi trường trở nên bất lợi, chỉ có một nội bào tử được hình thành trên một tế bào và có thể ở trạng thái không hoạt động này trong nhiều năm. Nội bào tử của một chủng Bacillus từ vùng Morocco đã được báo cáo là vẫn sống sót sau khi được xử lí bằng nhiệt khô với nhiệt độ lên đến 420℃ và khả năng này được duy trì sau nhiều thế hệ [17]. Do bào tử của nhiều loài Bacillus có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm nên chúng khó bị loại bỏ khỏi các nguyên liệu y tế, dược phẩm và là nguyên nhân thường xuyên gây ô nhiễm.

Một số loài Bacillus được biết đến như những sinh vật gây hư hỏng thực phẩm [16]. Bênh cạnh đó, các loài Bacillus cũng được sử dụng trong nhiều quy trình y tế, dược phẩm, nông nghiệp và công nghiệp bằng cách tận dụng các đặc điểm sinh lý đa dạng, khả năng tạo ra nhiều loại enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa khác [16]. cereus sản sinh độc tố, các chủng Bacillus còn lại thường có lợi, an toàn cho thực vật và môi trường sinh thái [18]. Những đặc tính này của các loài Bacillus làm cho chúng trở thành tác nhân kiểm soát sinh học tốt để thay thế thuốc trừ nấm hóa học tổng hợp.

Nhiều chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh do nấm mốc gây ra trên thực vật như Botrytis cinerea, các chủng Aspergillus… [19, 20]. Ngoài ra, bacitracin và polymyxin là hai loại kháng sinh nổi tiếng được thu nhận từ các loài Bacillus. Một số loài được sử dụng làm tiêu chuẩn trong các thử nghiệm y tế và dược phẩm [16]. Ash và cộng sự đã cho ra đời hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gene 16S-rRNA [21].

Chúng bao gồm ít nhất 9 loài 5 là B. Các loại enzyme từ Bacillus như amylase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt, do đó, các loại enzyme này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bên cạnh đó, các chủng Bacillus cũng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại hợp chất kháng sinh như lipopeptide, peptide, protein,… được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học nông nghiệp, sản xuất enzyme công nghiệp, và sản xuất kháng sinh [16]. Nhiều chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở thực vật, đặc biệt là các bệnh gây ra bởi nấm như Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, các chủng Aspergillus và Penicillium… [19, 20].2 Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis là một trực khuẩn Gram dương, phân bố rộng rãi trong tự nhiên.

Chủng vi khuẩn này có khả năng hình thành nội bào tử để chống lại các bất lợi khác nhau của môi trường [22]. licheniformis còn sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn khác nhau, chẳng hạn như lipopeptide, peptide, phospholipid, polyenes, amino acid và nucleic acid, có khả năng ức chế các mầm bệnh khác nhau từ động vật, thực vật và con người. licheniformis cũng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme có hoạt tính cao như protease, lipase, amylase, glucanase và chitinase [23-27]. Chính vì vậy mà B.

licheniformis được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng y tế, thuốc trừ sâu, thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi và làm sạch môi trường. Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật điển hình, cơ chế tác động của nó bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng và không gian với mầm bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng diệt khuẩn, cảm ứng sự đề kháng của cây trồng và thúc đẩy sự phát triển của cây trồng. Các ví dụ bao gồm B. licheniformis NJWGYH 833051, có thể xâm nhập vào lá và thân rễ của cà chua, đóng một vai trò trong kiểm soát sinh học [28]; B.

licheniformis GZ-3, được phát hiện bởi Ma và cộng sự không chỉ cho thấy khả năng đối kháng tốt với Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum mà còn có hoạt tính ức chế chống lại nhiều loại 6 nấm gây bệnh đã được thử nghiệm khác [29]; một loài B. licheniformis được phân lập từ ngũ cốc lên men và có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn Gram dương khác nhau [30]. Bên cạnh đó, khi xử lý rễ cây dưa chuột bằng B. licheniformis TG116 có thể làm tăng hoạt động của các enzyme bảo vệ như peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), và phenylalanine amoniac-lyase (PAL) trong lá, đồng thời làm giảm nhẹ hàm lượng malondialdehyde (MDA) về trạng thái cân bằng mới và gây ra sức đề kháng trên toàn thân cây [31].

Ansari và cộng sự đã phát hiện ra rằng B. licheniformis B642 và Pseudomonas fluorescens FAP2 có thể tương tác trong màng sinh học, do đó làm tăng sự phát triển và quang hợp của thực vật [32]. Với những đặc tính hữu ích trên mà chủng B. licheniformis chỉ đứng sau Escherichia coli về mức độ chi tiết đã được nghiên cứu [33].

Trình tự bộ gen được chú thích của B. licheniformis trước đây đã được phân tích để đánh giá tầm quan trọng về công nghệ sinh học của sinh vật [34]. Theo phân loại của (Weigmann 1898) Chester vào năm 1901 [13], Bacillus licheniformis thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus licheniformis 7 a b Hình 1. Hình thái đại thể (a) và vi thể (b) của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis [13, 35] 1.3 Khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng mốc của Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis là một chủng Bacillus tiềm năng với khả năng tổng hợp phong phú các chất chống nấm ngoại bào, bao gồm glucanase, chitinase, protein kháng nấm, peptide, lipopeptide [36].

Một vài hợp chất có khả năng kháng mốc của B. licheniformis đã được nghiên cứu và công bố như Fungicin M4, Protein F2, Surfactin, benzoic acid [37-40]… Chủng B. licheniformis M4 sản xuất một peptide ưa nước 3.4 kDa với hoạt tính kháng nấm, được đặt tên là Fungicin M4. Hợp chất này có phổ ức chế hẹp chỉ ức chế được các loài như Microsporum canis CECT 2797, Mucor mucedo CECT 2653, Mucor plumbeus CCM F 443, Sporothrix schenckii CECT 2799 [37].

Một loại protein chống nấm được tạo ra bởi chủng B. licheniformis BS-3 đã được tinh chế bằng kết tủa ammonium sulfate, sắc ký cột DEAE-52 và sắc ký cột Sephadex G-75. Protein tinh khiết được gọi là protein F2, có khả năng ức chế sự phát triển của Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae và Rhizoctonia solani. Protein F2 là một monomer có trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 kDa [38].

8 Hợp chất kháng nấm được tổng hợp từ B. licheniformis BC98 có hoạt tính kháng mạnh nhất đối với nấm đạo ôn Magnaporthe grisea. Ngoài ra, hợp chất này còn ức chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh khác như Curvularia lunata và Rhizoctonia bataticola. Sau khi tiến hành phân tích HPLC mô tả cấu trúc chi tiết và phân tích 500 MHz 1H NMR thì lipopeptide đối kháng được tiết ra bởi B.

licheniformis BC98 có khối lượng phân tử xấp xỉ 1 kDa và được xác định là Surfactin [39]. Chất chuyển hóa của B. licheniformis MH48 cho hoạt tính ức chế mạnh đối với nấm Rhizoctonia solani và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên cây trồng. Sau khi tiến hành chạy HPLC để xác nhận độ tinh khiết của hợp chất kháng nấm, phân tích 600 MHz 1H NMR 1H để xác định cấu trúc hóa học và chạy GC/MS để xác định trọng lượng phân tử của hợp chất kháng nấm, chất kháng nấm do B.

licheniformis MH48 tiết ra được xác định là benzoic acid [40].1 Đặc điểm Neoscytalidium dimidiatum được nhà nấm học người Anh, tiến sĩ Rolland Marshall Nattrass mô tả lần đầu tiên vào năm 1933 với tên gọi Hendersonula toruloidea từ những cây ăn quả bị bệnh ở Ai Cập. Nhiều thập kỷ sau, nó được xác định là tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [8]. Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [7]. dimidiatum phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu và có khả năng phân cắt thành các bào tử đốt.

Bào tử có hình dạng ellipse, hình trụ hoặc tròn, chứa một hoặc hai nhân, màu sắc từ trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách [7]. Một đĩa sợi nấm đường kính 6mm được cấy vào trung tâm của đĩa thạch PGA (đường kính 90mm), ủ ở 25℃. Hình thái khuẩn lạc và sắc tố được đánh giá sau 7 ngày nuôi cấy, trong khi tốc độ tăng trưởng được đo mỗi ngày cho đến khi lan đầy đĩa (3 ngày) [41]. Khuẩn lạc nấm N.

dimidiatum dạng sợi, có màu xám đen đến nâu 9 đen ở mặt trên, mặt dưới có màu đen, không có vòng đồng tâm. Sợi nấm phân nhánh, vươn cao như bông gòn trên bề mặt môi trường PGA (Hình 1. Neoscytalidium dimidiatum được biết đến như một mầm bệnh có thể gây bệnh trên cả con người, động vật và thực vật. dimiditum đã gây ra bệnh viêm mũi với các triệu chứng như đau ở trán và thái dương, chảy nước mũi, nghẹt mũi, ho và khó thở [42].

Ở động vật, theo báo cáo của Daniel Elad và cộng sự năm 2011, N. dimiditum xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [9]. Ở thực vật, mốc N. dimiditum gây bệnh trên nhiều đối tượng hơn như: cà chua, cây có múi, thanh long,… làm giảm năng suất cũng như chất lượng quả, gây thiệt hại nặng nề về mặt kinh tế [10-12].

Hình thái đại thể (A) và vi thể (B) của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum [43] 1.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long Bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long là một bệnh cực kỳ nghiêm trọng, rất khó kiểm soát trong mùa mưa. Bệnh dễ dàng lây lan trong môi trường nóng và ẩm, hiện tại không có phương pháp kiểm soát hiệu quả. Bệnh gây thiệt hại cho thân cây, làm ảnh hưởng đến năng suất quả. Ngoài ra, bệnh đốm nâu cũng ảnh hưởng đến sự ra quả.

Kết quả là mất lợi ích kinh tế trong xuất khẩu. Sau khi bị nhiễm bệnh, chuỗi các biểu hiện triệu chứng sẽ xuất hiện như sau (Hình 1. Xuất hiện các điểm tổn thương có vệt đỏ ở tâm 2. Các điểm sau đó dần chuyển sang màu xám 3.

Các điểm tổn thương lan rộng dần ra xung quanh và tâm tạo thành lớp vảy nâu cứng 4. Hình thành quần sáng màu vàng dễ thấy xung quanh hoặc một bên của vảy và vùng tổn thương dần lan rộng ra 5. Giai đoạn mở rộng liên tiếp dẫn đến các tổn thương lớn, màu xám, từng cụm, giống như ghẻ 6.