CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung Các chủng Bacillus là vi khuẩn Gram dương hình que, hiếu khí hoặc kỵ khí đa dạng, có khả năng sinh enzyme catalase và hiện diện ở khắp nơi trong tự nhiên [16]. Chúng có khả năng hình thành nội bào tử khi điều kiện môi trường trở nên bất lợi, chỉ có một nội bào tử được hình thành trên một tế bào và có thể ở trạng thái không hoạt động này trong nhiều năm. Nội bào tử của một chủng Bacillus từ vùng Morocco đã được báo cáo là vẫn sống sót sau khi được xử lí bằng nhiệt khô với nhiệt độ lên đến 420℃ và khả năng này được duy trì sau nhiều thế hệ [17]. Do bào tử của nhiều loài Bacillus có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm nên chúng khó bị loại bỏ khỏi các nguyên liệu y tế, dược phẩm và là nguyên nhân thường xuyên gây ô nhiễm.
Một số loài Bacillus được biết đến như những sinh vật gây hư hỏng thực phẩm [16]. Bênh cạnh đó, các loài Bacillus cũng được sử dụng trong nhiều quy trình y tế, dược phẩm, nông nghiệp và công nghiệp bằng cách tận dụng các đặc điểm sinh lý đa dạng, khả năng tạo ra nhiều loại enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa khác [16]. cereus sản sinh độc tố, các chủng Bacillus còn lại thường có lợi, an toàn cho thực vật và môi trường sinh thái [18]. Những đặc tính này của các loài Bacillus làm cho chúng trở thành tác nhân kiểm soát sinh học tốt để thay thế thuốc trừ nấm hóa học tổng hợp.
Nhiều chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh do nấm mốc gây ra trên thực vật như Botrytis cinerea, các chủng Aspergillus… [19, 20]. Ngoài ra, bacitracin và polymyxin là hai loại kháng sinh nổi tiếng được thu nhận từ các loài Bacillus. Một số loài được sử dụng làm tiêu chuẩn trong các thử nghiệm y tế và dược phẩm [16]. Ash và cộng sự đã cho ra đời hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gene 16S-rRNA [21].
Chúng bao gồm ít nhất 9 loài 5 là B. Các loại enzyme từ Bacillus như amylase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt, do đó, các loại enzyme này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bên cạnh đó, các chủng Bacillus cũng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại hợp chất kháng sinh như lipopeptide, peptide, protein,… được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học nông nghiệp, sản xuất enzyme công nghiệp, và sản xuất kháng sinh [16]. Nhiều chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở thực vật, đặc biệt là các bệnh gây ra bởi nấm như Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, các chủng Aspergillus và Penicillium… [19, 20].2 Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis là một trực khuẩn Gram dương, phân bố rộng rãi trong tự nhiên.
Chủng vi khuẩn này có khả năng hình thành nội bào tử để chống lại các bất lợi khác nhau của môi trường [22]. licheniformis còn sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn khác nhau, chẳng hạn như lipopeptide, peptide, phospholipid, polyenes, amino acid và nucleic acid, có khả năng ức chế các mầm bệnh khác nhau từ động vật, thực vật và con người. licheniformis cũng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme có hoạt tính cao như protease, lipase, amylase, glucanase và chitinase [23-27]. Chính vì vậy mà B.
licheniformis được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng y tế, thuốc trừ sâu, thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi và làm sạch môi trường. Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật điển hình, cơ chế tác động của nó bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng và không gian với mầm bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng diệt khuẩn, cảm ứng sự đề kháng của cây trồng và thúc đẩy sự phát triển của cây trồng. Các ví dụ bao gồm B. licheniformis NJWGYH 833051, có thể xâm nhập vào lá và thân rễ của cà chua, đóng một vai trò trong kiểm soát sinh học [28]; B.
licheniformis GZ-3, được phát hiện bởi Ma và cộng sự không chỉ cho thấy khả năng đối kháng tốt với Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum mà còn có hoạt tính ức chế chống lại nhiều loại 6 nấm gây bệnh đã được thử nghiệm khác [29]; một loài B. licheniformis được phân lập từ ngũ cốc lên men và có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn Gram dương khác nhau [30]. Bên cạnh đó, khi xử lý rễ cây dưa chuột bằng B. licheniformis TG116 có thể làm tăng hoạt động của các enzyme bảo vệ như peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), và phenylalanine amoniac-lyase (PAL) trong lá, đồng thời làm giảm nhẹ hàm lượng malondialdehyde (MDA) về trạng thái cân bằng mới và gây ra sức đề kháng trên toàn thân cây [31].
Ansari và cộng sự đã phát hiện ra rằng B. licheniformis B642 và Pseudomonas fluorescens FAP2 có thể tương tác trong màng sinh học, do đó làm tăng sự phát triển và quang hợp của thực vật [32]. Với những đặc tính hữu ích trên mà chủng B. licheniformis chỉ đứng sau Escherichia coli về mức độ chi tiết đã được nghiên cứu [33].
Trình tự bộ gen được chú thích của B. licheniformis trước đây đã được phân tích để đánh giá tầm quan trọng về công nghệ sinh học của sinh vật [34]. Theo phân loại của (Weigmann 1898) Chester vào năm 1901 [13], Bacillus licheniformis thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus licheniformis 7 a b Hình 1. Hình thái đại thể (a) và vi thể (b) của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis [13, 35] 1.3 Khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng mốc của Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis là một chủng Bacillus tiềm năng với khả năng tổng hợp phong phú các chất chống nấm ngoại bào, bao gồm glucanase, chitinase, protein kháng nấm, peptide, lipopeptide [36].
Một vài hợp chất có khả năng kháng mốc của B. licheniformis đã được nghiên cứu và công bố như Fungicin M4, Protein F2, Surfactin, benzoic acid [37-40]… Chủng B. licheniformis M4 sản xuất một peptide ưa nước 3.4 kDa với hoạt tính kháng nấm, được đặt tên là Fungicin M4. Hợp chất này có phổ ức chế hẹp chỉ ức chế được các loài như Microsporum canis CECT 2797, Mucor mucedo CECT 2653, Mucor plumbeus CCM F 443, Sporothrix schenckii CECT 2799 [37].
Một loại protein chống nấm được tạo ra bởi chủng B. licheniformis BS-3 đã được tinh chế bằng kết tủa ammonium sulfate, sắc ký cột DEAE-52 và sắc ký cột Sephadex G-75. Protein tinh khiết được gọi là protein F2, có khả năng ức chế sự phát triển của Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae và Rhizoctonia solani. Protein F2 là một monomer có trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 kDa [38].
8 Hợp chất kháng nấm được tổng hợp từ B. licheniformis BC98 có hoạt tính kháng mạnh nhất đối với nấm đạo ôn Magnaporthe grisea. Ngoài ra, hợp chất này còn ức chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh khác như Curvularia lunata và Rhizoctonia bataticola. Sau khi tiến hành phân tích HPLC mô tả cấu trúc chi tiết và phân tích 500 MHz 1H NMR thì lipopeptide đối kháng được tiết ra bởi B.
licheniformis BC98 có khối lượng phân tử xấp xỉ 1 kDa và được xác định là Surfactin [39]. Chất chuyển hóa của B. licheniformis MH48 cho hoạt tính ức chế mạnh đối với nấm Rhizoctonia solani và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên cây trồng. Sau khi tiến hành chạy HPLC để xác nhận độ tinh khiết của hợp chất kháng nấm, phân tích 600 MHz 1H NMR 1H để xác định cấu trúc hóa học và chạy GC/MS để xác định trọng lượng phân tử của hợp chất kháng nấm, chất kháng nấm do B.
licheniformis MH48 tiết ra được xác định là benzoic acid [40].1 Đặc điểm Neoscytalidium dimidiatum được nhà nấm học người Anh, tiến sĩ Rolland Marshall Nattrass mô tả lần đầu tiên vào năm 1933 với tên gọi Hendersonula toruloidea từ những cây ăn quả bị bệnh ở Ai Cập. Nhiều thập kỷ sau, nó được xác định là tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [8]. Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [7]. dimidiatum phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu và có khả năng phân cắt thành các bào tử đốt.
Bào tử có hình dạng ellipse, hình trụ hoặc tròn, chứa một hoặc hai nhân, màu sắc từ trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách [7]. Một đĩa sợi nấm đường kính 6mm được cấy vào trung tâm của đĩa thạch PGA (đường kính 90mm), ủ ở 25℃. Hình thái khuẩn lạc và sắc tố được đánh giá sau 7 ngày nuôi cấy, trong khi tốc độ tăng trưởng được đo mỗi ngày cho đến khi lan đầy đĩa (3 ngày) [41]. Khuẩn lạc nấm N.
dimidiatum dạng sợi, có màu xám đen đến nâu 9 đen ở mặt trên, mặt dưới có màu đen, không có vòng đồng tâm. Sợi nấm phân nhánh, vươn cao như bông gòn trên bề mặt môi trường PGA (Hình 1. Neoscytalidium dimidiatum được biết đến như một mầm bệnh có thể gây bệnh trên cả con người, động vật và thực vật. dimiditum đã gây ra bệnh viêm mũi với các triệu chứng như đau ở trán và thái dương, chảy nước mũi, nghẹt mũi, ho và khó thở [42].
Ở động vật, theo báo cáo của Daniel Elad và cộng sự năm 2011, N. dimiditum xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [9]. Ở thực vật, mốc N. dimiditum gây bệnh trên nhiều đối tượng hơn như: cà chua, cây có múi, thanh long,… làm giảm năng suất cũng như chất lượng quả, gây thiệt hại nặng nề về mặt kinh tế [10-12].
Hình thái đại thể (A) và vi thể (B) của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum [43] 1.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long Bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long là một bệnh cực kỳ nghiêm trọng, rất khó kiểm soát trong mùa mưa. Bệnh dễ dàng lây lan trong môi trường nóng và ẩm, hiện tại không có phương pháp kiểm soát hiệu quả. Bệnh gây thiệt hại cho thân cây, làm ảnh hưởng đến năng suất quả. Ngoài ra, bệnh đốm nâu cũng ảnh hưởng đến sự ra quả.
Kết quả là mất lợi ích kinh tế trong xuất khẩu. Sau khi bị nhiễm bệnh, chuỗi các biểu hiện triệu chứng sẽ xuất hiện như sau (Hình 1. Xuất hiện các điểm tổn thương có vệt đỏ ở tâm 2. Các điểm sau đó dần chuyển sang màu xám 3.
Các điểm tổn thương lan rộng dần ra xung quanh và tâm tạo thành lớp vảy nâu cứng 4. Hình thành quần sáng màu vàng dễ thấy xung quanh hoặc một bên của vảy và vùng tổn thương dần lan rộng ra 5. Giai đoạn mở rộng liên tiếp dẫn đến các tổn thương lớn, màu xám, từng cụm, giống như ghẻ 6.
