Chiết xuất và xác định cấu trúc hợp chất từ cây Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo

Tài liệu trình bày chi tiết nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo (Hedyotis diffusa).

• Tác giả: Lê Thị Vân
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Nguyễn Thành
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ cao ethyl acetat của phần trên mặt đất cây Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo (Hedyotis diffusa Willd.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung về Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo Hedyotis diffusa

Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo (Hedyotis diffusa Willd.) là một loài thực vật thuộc chi Hedyotis, có giá trị y học truyền thống cao trong y học cổ truyền Việt Nam và Đông Á. Cây này được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm trùng, viêm nhiễm và các bệnh lý liên quan đến khối u. Hợp chất từ cây Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa mạnh mẽ. Phần trên mặt đất của cây, bao gồm thân, lá và hoa, chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học quý báu. Nghiên cứu hiện đại đã chứng minh rằng các hợp chất hoạt tính từ loài này có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư khác nhau như A549, MCF-7 và HepG2. Điều này làm cho Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực dược phẩm hiện đại.

1.1. Đặc điểm chi Hedyotis

Chi Hedyotis thuộc họ Rubiaceae, bao gồm hàng chục loài thực vật có phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các loài trong chi này thường là những cây thấp, có hoa nhỏ màu xanh hay trắng. Hợp chất từ chi Hedyotis đã được nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh có tác dụng dược lý đa dạng, đặc biệt là hoạt tính kháng khối u và chống oxy hóa.

1.2. Vai trò y học truyền thống

Trong y học cổ truyền, Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo được sử dụng để chữa các bệnh viêm nhiễm, sốt cao và các bệnh lý ngoài da. Các hợp chất tích cực từ cây giúp tăng cường miễn dịch và hỗ trợ quá trình chữa lành của cơ thể. Nước sắc hoặc cao từ cây này được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc truyền thống.

II. Chiết xuất và phân lập hợp chất từ Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo

Quá trình chiết xuất hợp chất từ Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo là bước quan trọng để tách lấy và nồng độ các chất có hoạt tính sinh học. Phương pháp chiết xuất sử dụng cao ethyl acetat đã được chứng minh là hiệu quả trong việc tách lấy các hợp chất flavonoid và các alkaloid quý báu. Cao ethyl acetat có độ phân cực vừa phải, cho phép chiết xuất được các hợp chất có trọng lượng phân tử trung bình, đó chính là các chất hoạt tính mạnh trong cây. Sau chiết xuất, các hợp chất từ cây được phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mỗi hợp chất được tinh khiết và chuẩn bị cho các bước xác định cấu trúc tiếp theo. Quá trình này đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ về điều kiện nhiệt độ, áp suất và thời gian để đạt hiệu suất tối ưu.

2.1. Phương pháp chiết xuất bằng ethyl acetat

Chiết xuất với ethyl acetat là phương pháp được lựa chọn vì tính an toàn và hiệu quả của nó. Phần trên mặt đất cây được sấy khô, xay mịn, sau đó ngâm trong dung môi ethyl acetat ở nhiệt độ phòng. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để đảm bảo các hợp chất hoạt tính được chiết xuất hoàn toàn. Cao thu được sau đó được loại bỏ dung môi bằng máy bay hơi chân không.

2.2. Kỹ thuật phân lập và tinh khiết

Sau chiết xuất, cao được phân lập bằng sắc ký cột silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexan-ethyl acetat (HE) với tỷ lệ khác nhau. Mỗi hợp chất từ cây được thu tập dựa trên Rf value và được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC). Các hợp chất được tinh khiết hơn nữa bằng sắc ký lỏng chứa Sephadex LH-20 hoặc kỹ thuật kết tinh lại.

III. Xác định cấu trúc hợp chất bằng phương pháp phổ

Xác định cấu trúc hợp chất từ Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo là công việc phức tạp và quan trọng, yêu cầu sử dụng nhiều kỹ thuật phổ hiện đại. Phương pháp NMR (Nuclear Magnetic Resonance) là công cụ chính để xác định cấu trúc, bao gồm ¹H-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) và ¹³C-NMR (phổ carbon-13). Các phổ HSQC và HMBC cung cấp thông tin chi tiết về sự liên kết giữa các nguyên tố trong phân tử. Phương pháp ESI-MS (Electrospray ionization - mass spectrometry) được sử dụng để xác định khối lượng phân tử chính xác. Kết hợp với các dữ liệu từ DEPT, COSY và các dữ liệu hóa học khác, các nhà khoa học có thể xác định chính xác cấu trúc của từng hợp chất hoạt tính. Quá trình này đòi hỏi kiến thức chuyên sâu về hóa học hữu cơ và kỹ năng phân tích dữ liệu cao.

3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

¹H-NMR và ¹³C-NMR cung cấp thông tin về số lượng và loại proton, cũng như các nguyên tử carbon trong hợp chất. Phổ HSQC cho phép nhận dạng sự liên kết trực tiếp C-H, trong khi HMBC xác định các liên kết dài hạn. Những dữ liệu này kết hợp với dữ liệu hóa học khác giúp xác định chính xác cấu trúc phân tử của hợp chất từ cây Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo.

3.2. Phổ khối lượng MS và ESI MS

Phương pháp ESI-MS cung cấp khối lượng phân tử chính xác của hợp chất. Mẫu được tách rời và ion hóa bằng kỹ thuật phun mù điện tử. Từ đó, xác định được công thức phân tử (molecular formula) của hợp chất hoạt tính. Các mảnh vỡ ion trong phổ MS cũng cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc chi tiết.

IV. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của hợp chất

Các hợp chất từ Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư. Các nghiên cứu in vitro trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như A549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) và HCT-8/5-FU (ung thư đại tràng) cho thấy hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở nồng độ thấp (IC50 thấp). Cơ chế hoạt động liên quan đến việc kích hoạt quá trình apoptosis (chết tế bào lập trình) thông qua con đường caspase hoặc con đường Fas/FasL. Ngoài ra, hợp chất hoạt tính còn có tác dụng chống oxy hóa (antioxidant) được đánh giá bằng phương pháp DPPH. Các phát hiện này mở ra triển vọng sử dụng hợp chất từ cây làm tiền chất để phát triển các dược phẩm mới trong điều trị ung thư.

4.1. Hoạt tính kháng ung thư

Các hợp chất flavonoid từ Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo có khả năng ức chế sự phân chia tế bào ung thư. Hoạt tính này được thể hiện qua giá trị IC50 thấp trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Cơ chế bao gồm ức chế các protein kinase quan trọng như CHK1, AKT và MAPK, từ đó kích hoạt con đường apoptosis thông qua sự tăng cường Bax và giảm Bcl-2.

4.2. Hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng tiềm năng

Hợp chất từ cây cũng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh được đánh giá bằng các phương pháp DPPH và FTC. Khả năng này giúp bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa và viêm nhiễm. Những phát hiện này gợi ý rằng hợp chất hoạt tính có thể được ứng dụng trong phòng chống các bệnh liên quan đến stress oxy hóa và viêm nhiễm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình đa dạng và thảm thực vật phong phú, nhờ đó sở hữu nguồn tài nguyên cây thuốc đặc biệt dồi dào. Trong bối cảnh hiện nay, khi các loại bệnh mạn tính, ung thư, viêm nhiễm và kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, nhu cầu sử dụng dược liệu có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được quan tâm. Y học hiện đại đang có xu hướng "hướng về tự nhiên", tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây thuốc để phát triển dược phẩm an toàn, hiệu quả và ít tác dụng phụ. Do đó, nghiên cứu khoa học về chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây thuốc là hướng đi có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng, góp phần phát triển nền y dược học Việt Nam theo hướng bền vững, hiện đại và hội nhập.

Bạch hoa xà thiệt thảo có tên khoa học là Hedyotis diffusa Willd. phân bố tại Ấn Độ, Nepal, Bhutan, Sri Lanka, Bangladesh, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippines và phân bố rộng rãi ở Việt Nam. Trong Dược điển Trung Quốc (2015), loài này được ghi nhận có tác dụng lợi tiểu để giảm phù nề, thanh nhiệt, giải độc và thúc đẩy lưu thông máu để ngăn chặn cơn đau [1], [2]. Ở nhiều nước châu Á, loài này được xem là có tiềm năng lớn trong điều trị ung thư và khối u [3].

Tuy nhiên cho tới nay, số lượng các nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học của loài cây này ở nước ta vẫn còn hạn chế. Chính vì vậy, để có cái nhìn tổng quan nhất cũng như góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu thành phần hóa học của loài Bạch hoa xà thiệt thảo tại Việt Nam, đề tài “Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat loài Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.)” đã được tiến hành. Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu sau: - Phân lập 1 – 2 hợp chất từ cao ethyl acetat của phần trên mặt đất cây Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd. - Xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất đã phân lập được từ cao ethyl acetat của phần trên mặt đất cây Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.

Tổng quan về chi Hedyotis Vị trí phân loại chi Hedyotis Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen Takhtajan [4] năm 2009, chi Hedyotis có vị trí phân loại như sau: Giới: Thực vật bậc cao (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Bạc hà (Lamiidae) Bộ: Cà phê (Rubiales) Họ: Cà phê (Rubiaceae) Chi: Hedyotis Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái chi Hedyotis. Đặc điểm thực vật: Cây thân thảo, sống một năm hay nhiều năm, mọc thẳng đứng hoặc leo. Thân hình trụ hoặc góc cạnh, thường phân nhánh chia đôi, không lông hoặc có lông. Lá kèm thường xen kẽ, rời nhau hoặc hợp nhất với gốc cuống lá, hình tam giác với đỉnh tù hoặc gần tròn.

Lá thường mọc đối, hình chữ thập hoặc không, đôi khi mọc thành cụm ở ngọn thân; phiến lá thẳng, hình mác, hình elip hoặc hình cầu, mỏng, nhẵn, có lông rất nhỏ hoặc có lông tơ; gốc thuôn dài, hình nêm hoặc hiếm khi tù; đỉnh nhọn hoặc tù; gân thứ cấp rõ hoặc mờ; cuống lá không có hoặc có rõ. Cụm hoa ở ngọn hoặc nách lá, đơn hoặc nhiều hoa, mọc thành cụm hay bó, dạng xim, chùm tán, không cuống hoặc có cuống, có lá bắc. Hoa lưỡng tính, đối xứng đều hoặc bất đối xứng về hình thái; đế hoa hình cầu, hình trứng, hình elip, tròn hoặc có góc, dẹt hoặc không; đài có 4 thùy nông hoặc sâu, thùy hình tam giác, hình mác hoặc hình tuyến; tràng hoa màu trắng, hồng, tím hoặc xanh lam, hình ống, hình phễu, hình đĩa hoặc hình chum, mặt trong nhẵn hoặc có lông, ống tràng có thể phình rõ hoặc không, họng tràng nhẵn, có lông dày; thùy tràng thường có 4, hiếm khi 5, xếp van trong nụ, thẳng hoặc cong ngược, thường có lông ở mặt ngoài, mặt trong nhẵn, có lông rất nhỏ hoặc lông tơ. Nhị thường có 4, hiếm khi 5, thò ra hoặc ẩn trong ống tràng, chỉ nhị dính vào dưới họng tràng hoặc tại khe giữa các thùy tràng, bao phấn thuôn dài, có 2 ngăn (2 túi phấn), đính lưng.

Bầu dưới hoặc nửa dưới, có 2 ô, noãn thường nhiều, hình cầu hoặc hình trứng, đính cuống. Vòi nhụy thò ra hoặc ẩn trong ống tràng; đầu nhụy chẻ đôi, thùy hình sợi đến hình chùy, thò ra hoặc không. Quả nang không cuống hoặc có cuống ngắn, có lá đài, thường hình cầu hoặc hình trứng, không nứt hoặc nứt dọc theo đỉnh nhọn của quả nang hoặc nứt theo ô. Vỏ quả mỏng, cứng hoặc mọng.

Hạt có từ ít đến nhiều, nhỏ, góc cạnh, 2 mặt dẹt - lồi; vỏ hạt 2 mỏng, gồm các tế bào hình ngũ giác, lục giác hoặc hình cầu, bề mặt trơn, hạt nhỏ, có lỗ, đốm nhỏ, có vân hoặc sần sùi [3], [5]. Đặc điểm phân bố: Chi Hedyotis phân bố rộng rãi ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới với khoảng hơn 500 loài chủ yếu ở châu Phi, Đông Á, Đông Nam Á, Úc và châu Mỹ [3], [5]. Ở Singapore, có 14 loài bản địa, trong đó có một loài rất hiếm [3]. Có 35 loài được ghi nhận ở Malaysia [6].

Có 62 loài thuộc chi Hedyotis được phân bố ở Trung Quốc, trong đó có hơn 20 loài được sử dụng làm thuốc, bao gồm Hedyotis diffusa Willd. Hiện nay ở Việt Nam có khoảng 60 loài được ghi nhận và trong đó phát hiện được một loài mới là Hedyotis konhanungensis [5], [8]. Sinh thái: Chi Hedyotis sinh trưởng trên đất khô và đất cát trong rừng núi thưa và thứ sinh, ven đường, bãi cỏ, đất hoang, dọc theo các con sông, bờ biển đến vùng núi. Nhiều loài có tính xâm lấn, dễ phát triển ở các khu vực bị tác động [3].

Thành phần hóa học của chi Hedyotis Các nghiên cứu hóa thực vật trên các loài trong chi Hedyotis đã tìm ra các hợp chất hoá học bao gồm: alcaloid, anthraquinon, flavonoid, iridoid, lignan, triterpenoid, sterol, coumarin và saponin [9], [10], [11]. Một số alcaloid đã được phân lập từ ba loài thuộc chi Hedyotis, đó là H. Bốn anthraquinon đầu tiên, 2-methyl-3-methoxyanthraquinon, 2-methyl-3- hydroxyanthraquinon, 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinon và 2,3-dimethoxy- 6-methylanthraquinon được báo cáo trong chi Hedyotis đã được phân lập từ H. Một nghiên cứu về H.

herbacea đã phát hiện hai hợp chất 2,3-dimethoxy-9- hydroxy-1,4-anthraquinon, 2-hydroxymethyl-10-hydroxy-1,4-anthraquinon. Các hợp chất này là 1,4-anthraquinon, một loại hợp chất hiếm gặp trong tự nhiên [10]. Hơn 20 triterpenoid pentacyclic đã được báo cáo từ chi này, chủ yếu từ H. Chỉ có một loài H.

lawsoniae được phát hiện có chứa lignan [15]. Các chất chuyển hóa thứ cấp khác được phân lập từ chi Hedyotis bao gồm coumarin, scopoletin, fraxin từ H. dichotoma [16] và arbutin – một monoglucosid hydroquinon từ H. Hoạt tính sinh học Đã có rất nhiều nghiên cứu về hóa học và dược lý được tiến hành trên một số loài của chi Hedyotis.

Trong đó, các hoạt động chống oxy hóa, dọn gốc tự do, chống viêm, gây độc tế bào và kháng khuẩn từ cao chiết methanol của một số loài thuộc chi Hedyotis đã được đánh giá và báo cáo [17], [18]. Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp thiocyanate sắt (FTC) và acid thiobarbituric (TBA) trong khi khả năng dọn gốc tự do được đo bằng phương 3 pháp 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Các cao chiết methanol từ phần trên mặt đất của các loài H. pinifolia được thử nghiệm đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh khi so sánh với vitamin E (α-tocopherol) với tỷ lệ ức chế 89 – 98% trong FTC và 60 – 95% trong các thử nghiệm TBA.

Tuy nhiên, trong thử nghiệm DPPH, không có cao chiết nào cho thấy khả năng dọn gốc tự do tốt. herbacea biểu hiện hoạt tính dọn gốc tự do trung bình, với giá trị IC₅₀ là 32 µg/ml [17]. Hoạt tính kháng viêm Hoạt tính chống viêm liên quan đến khả năng ức chế NO của cao chiết methanol từ các bộ phận trên mặt đất của các loài H. pinifolia được đo bằng thử nghiệm Griess.

Trong thử nghiệm Griess kết quả cho thấy chỉ có cao chiết từ thân cây của H. capitellata có khả năng ức chế ở mức độ trung bình (khoảng 40%) tại nồng độ 100 µg/ml. Tất cả các cao chiết khác không thể hiện bất kỳ sự ức chế nào, điều này cho thấy rằng các thành phần trong các cao chiết có thể là chất ức chế yếu của NO synthase hoặc không có hoạt tính trong điều kiện khảo sát [17]. Hoạt tính kháng khuẩn Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên 4 loại vi khuẩn, bao gồm: Bacillus subtilis B28 (kiểu đột biến), Bacillus subtilis B29 (kiểu hoang dã), Pseudomonas aeruginosa UI 60690 và Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

Thân và rễ của H. capitellata cho thấy tác dụng từ yếu đến trung bình trên 4 loại vi khuẩn được thử nghiệm, trong khi lá chỉ cho thấy tác dụng yếu trên chủng Bacillus subtilis B28, MRSA và Pseudomonas aeruginosa. dichotoma cho thấy tác dụng kháng khuẩn trung bình đối với tất cả 4 loại vi khuẩn. Các cao chiết methanol từ phần trên mặt đất của các loài H.

pinifolia được thử nghiệm đều không thể hiện bất kỳ hoạt tính kháng khuẩn nào [17]. Hoạt tính gây độc tế bào Độc tính tế bào của các cao chiết thực vật được đánh giá thông qua phương pháp thử nghiệm MTT trên dòng tế bào CEM-SS (tế bào ung thư bạch cầu lympho T ở người). Kết quả cho thấy các cao chiết methanol từ phần trên mặt đất của các loài H. pinifolia được thử nghiệm đều biểu hiện mức độ gây độc tế bào ở mức trung bình, với giá trị CD₅₀ nằm trong khoảng từ 21 – 41 µg/ml [17].

Công dụng Nhiều loài thuộc chi Hedyotis (Rubiaceae) được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị cảm lạnh, viêm và ung thư [19]. Các loài này còn để điều trị bệnh kiết 4 lỵ, tiêu chảy, đắp lên vết thương khi bị thương hoặc bị rắn cắn [17]. Tổng quan về loài Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo (Hedyotis diffusa) Tên chấp nhận: Scleromitrion diffusum (Willd.Wang Tên đồng nghĩa: Hedyotis diffusa (Willd.), Oldenlandia diffusa (Willd. [Dược điển Việt Nam V vẫn dùng tên Hedyotis diffusa (Willd.)] Tên khác: An điền bò, An điền lan, Bòi ngòi bò, Cỏ lưỡi rắn hoa trắng Họ: Cà phê (Rubiaceae) Bộ phận dùng: Toàn cây phơi hoặc sấy khô [2], [20] Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố loài Bạch hoa xà thiệt thảo Đặc điểm thực vật: Cây thảo, mọc bò, sống hàng năm, dài 20 – 25 cm.

Thân vuông màu nâu nhạt. Cành lá sum sê.